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利用crispr-cas系统研究食源性致病菌的基因编辑与调控

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科技通报 2024年第5期40卷 27-33页

作者：张昕哲甄珍大庆市疾病预防控制中心黑龙江大庆163311 哈尔滨海关技术中心黑龙江齐齐哈尔161000

本文基于crispr-cas系统,构建了食源性致病菌基因检测模型。利用基因编码测度技术对cas蛋白基因中的向导RNA序列进行识别,提取其中的主要基因特征并进行分类。在此基础上,分别使用基因表达与分子诊断技术,根据序列特征,对基因表达数据... 详细信息

本文基于crispr-cas系统,构建了食源性致病菌基因检测模型。利用基因编码测度技术对cas蛋白基因中的向导RNA序列进行识别,提取其中的主要基因特征并进行分类。在此基础上,分别使用基因表达与分子诊断技术,根据序列特征,对基因表达数据的差异性与菌属分布概率进行分析。结果表明:通过设计特异性识别的向导RNA和基因差异表达的分析,实现对目标基因和致病菌的检测。这种方法为食源性致病菌的基因检测提供了一种精确、可靠且高效的工具。

关键词： crispr-cas系统食源性致病菌基因编辑

crispr-cas系统预测方法研究与实现

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CRISPR-Cas系统预测方法研究与实现

作者：王金彪扬州大学

学位级别：硕士

规律间隔成簇短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats,crispr)及相关蛋白(crispr-associated,cas)系统(crispr-cas)是一种存在于原核生物(约90%的古细菌和48%的细菌基因)中的一种获得性免疫系统。其免疫过程包括适应、表达和干扰三个阶段,可以特异性地裂解外源入侵的病毒或质粒等。crispr-cas系统主要由三部分组成:crispr阵列、前导序列和cas基因。crispr阵列由重复序列(DirectRepeat,DR)和间隔序列(Spacer)组成。前导序列包含启动子等,可以将crispr阵列转录成RNA,参与crispr-cas系统的免疫调控。cas基因可以转录翻译成cas蛋白,参与到crispr-cas系统整个免疫过程中。同时,crispr-cas系统作为一种基因编辑手段已成为新一代基因工程的重要组成部分,在农业、食品、医学等多个领域得到了广泛应用。迄今为止,仍有大量crispr-cas系统尚未被发现,这在一定程度上阻碍了对原核生物免疫系统进化的系统性研究。通过传统实验手段去发掘大量crispr-cas系统是十分困难的,因此需要先利用生物信息学方法对原核生物全基因组序列进行审查,预测出其中可能的crispr-cas系统,再通过实验进一步验证。针对crispr-cas系统的两个重要组件(crispr阵列和cas基因)的预测问题,本文进行了详细的理论研究与系统实现,主要贡献如下:(1)提出了一种新型的crispr阵列预测方法crispr-F。该方法通过搜索序列和搜索范围序列的局部双序列比对结果确认目标序列。为了让序列比对更具生物学意义且保持重复序列的高度保守性,在局部双序列比对时只允许有两个碱基位点发生突变。由于允许碱基突变,比对后目标序列左端不相同的碱基理想情况下属于间隔序列。因此去除不相同的碱基并向右端添加相同的碱基,最多达到最大重复序列的长度。在不同序列群多序列比对得到核心序列群后,向两侧以至少75%出现概率添加碱基位,并检查两侧退化的重复序列。最后检查约束条件后得到最终的crispr阵列。并通过crispr阵列两翼的AT含量预测crispr阵列方向。与CRT将全基因序列完全当成字符串相比,crispr-F预测得到的重复序列更具生物学意义,充分考虑了重复序列突变中的替换、插入和丢失。(2)提出了一种新型的cas基因预测方法cas-F。该方法是Stacking模型融合的改进方法。首先将蛋白质序列分别从伪氨基酸构成、k-间隔氨基酸对构成和位置特异性得分矩阵三个角度进行特征提取,并分别建立三个SVM模型基学习器。每一个SVM模型都以十折交叉验证进行训练。将这三个SVM模型基学习器的预测结果整合成一个新的特征向量再去训练一个新的SVM模型。将最后的SVM模型作为最终的预测结果,用于判断蛋白质序列是否属于cas蛋白序列。当模型将蛋白质序列判定为cas蛋白序列后,需要通过HMMER程序进行蛋白质图谱的序列相似性搜索确定cas类型。通过实验证明,伪氨基酸构成、k-间隔氨基酸对构成、位置特异性得分矩阵和融合后的SVM模型十折交叉验证的准确率分别为 69.42%、82.43%、80.09%和 83.78%。(3)构建了 crispr-cas系统预测及可视化平台crisprcasFV。该平台在crisprVi的基础上,添加了 crispr-F和cas-F的功能,并实现了这两个新增模块的可视化。测试结果表明:用户只需要在crisprcasFV中上传需要预测的全基因组序列文件(默认FASTA格式文件),crisprcasFV可以将crispr-F和cas-F预测结果分别详细地展示在各自的可视化界面中。crispr-F可视化界面中显示信息包括重复序列和间隔序列的起始位点、终止位点、序列信息、序列长度和方向。cas-F可视化界面中显示信息包括cas类型、方向、起始位点、终止位点、DNA序列和蛋白质序列。综上,本文在系统研究现有crispr-cas系统的预测方法基础上,提出并实现了 crispr阵列和cas基因的预测方法,并将其整合成为crispr-cas系统预测及可视化平台crisprcasFV,以推动crispr-cas系统领域的相关研究。

关键词： crispr-cas系统 crispr预测 cas预测可视化

肺炎克雷伯菌crispr-cas系统及anti-crispr蛋白家族研究进展

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上海交通大学学报（医学版） 2022年第12期42卷 1757-1765页

作者：姜春宇郭晓奎秦金红上海交通大学医学院免疫学与微生物学系上海200025 上海交通大学医学院-国家热带病研究中心全球健康学院上海200025

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)在自然界中广泛分布,致病性肺炎克雷伯菌在临床上可以引起广泛感染,如呼吸系统感染、血流感染、肝脓肿及泌尿系统感染等。肺炎克雷伯菌是著名的“质粒收集器”,其基因组可以同时携带多种不同类型的... 详细信息

肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)在自然界中广泛分布,致病性肺炎克雷伯菌在临床上可以引起广泛感染,如呼吸系统感染、血流感染、肝脓肿及泌尿系统感染等。肺炎克雷伯菌是著名的“质粒收集器”,其基因组可以同时携带多种不同类型的质粒,从而导致临床中不断出现耐药菌株。尤其是近年来高毒力多重耐药菌株亦不断出现,给临床治疗工作带来了极大挑战。因此肺炎克雷伯菌对外源基因特别是耐药以及毒力相关基因的获取能力引起了广大学者的关注。作为细菌的获得性免疫系统,活跃的常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白(clustered regularly interspaced palindromic repeats/crispr-associated proteins,crispr-cas)系统可以有效阻碍肺炎克雷伯菌基因组中可移动元件的水平转移,特别是接合型质粒的转移。近年来发现一些接合型质粒通过携带anti-crispr (Acr)蛋白抑制宿主菌编码的crispr-cas系统活性,逃逸宿主的免疫识别,进而可以有效进行转移。分析数据库中已知肺炎克雷伯菌基因序列结果表明,其基因组中主要的crispr-cas系统类型为I-E型及亚型(I-E*)。研究肺炎克雷伯菌基因组中crispr-cas系统与质粒的分布及转移关系,并研究Acr蛋白在调控crispr-cas系统活性中发挥作用的机制,将为揭示其基因组进化的动力及方向提供线索,为防控高毒力多重耐药菌株提供临床指导。

关键词：肺炎克雷伯菌获得性耐药获得性高毒力 crispr-cas系统 Acr蛋白家族

crispr-cas系统在结核分枝杆菌检测中的应用前景

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浙江中西医结合杂志 2023年第11期33卷 1071-1074页

作者：喻义杭陈园园蔡青山孔娇赵亚芳浙江中医药大学第二临床医学院杭州310053 浙江大学医学院附属杭州市胸科医院结核病诊疗中心杭州310003

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染性疾病。随着新型冠状病毒的大流行,2022年结核病成为全球仅次于新型冠状病毒感染传染病死因^([1]),严重危害全球人民的生命与健康。虽然目前有众多的检测手段,但据世界卫生组织(WHO)估计仍有... 详细信息

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的慢性传染性疾病。随着新型冠状病毒的大流行,2022年结核病成为全球仅次于新型冠状病毒感染传染病死因^([1]),严重危害全球人民的生命与健康。虽然目前有众多的检测手段,但据世界卫生组织(WHO)估计仍有近一半的病例未能确诊。近年来基于成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-cas,crisprcas)系统发展迅速,其研发成果已应用于基因编辑和体外分子诊断。

关键词： crispr-cas系统结核分枝杆菌结核病诊断

crispr-cas系统与细菌和噬菌体的共进化

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遗传 2011年第3期33卷 213-218页

作者：李铁民杜波辽宁大学生命科学院沈阳110036

细菌在适应噬菌体攻击的过程中,进化了多种防御系统,噬菌体在细菌的选择压力下,也在不断进化反防御策略,双方的这种进化关系与发生机制一直尚不完全清楚。近年在细菌和古细菌中发现一种新的免疫防御系统,即crispr-cas(clustered regular... 详细信息

细菌在适应噬菌体攻击的过程中,进化了多种防御系统,噬菌体在细菌的选择压力下,也在不断进化反防御策略,双方的这种进化关系与发生机制一直尚不完全清楚。近年在细菌和古细菌中发现一种新的免疫防御系统,即crispr-cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-crispr-associated system)系统。在对其功能和作用机制深入研究的同时,也不断地揭示了细菌和噬菌体之间的共进化关系。为此,文章在介绍原核细胞中crispr-cas系统介导的免疫机制基础上,重点综述了crispr系统在细菌和噬菌体进化中的作用。

关键词： crispr crispr-cas系统噬菌体共进化免疫防御

crispr-cas系统在食品微生物中的应用研究进展

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食品科学 2017年第11期38卷 269-275页

作者：张玉洁宋育阳秦义刘延琳西北农林科技大学葡萄酒学院陕西杨凌712100 陕西省葡萄与葡萄酒工程技术研究中心陕西杨凌712100

成簇的规律间隔的短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,crispr)及其关联蛋白(crispr-associated proteins,cas)构成crispr-cas系统,该系统作为高效、灵活、易于操作的基因编辑技术,开始广泛应用于微生物基因组位点的靶向编辑中。本文针对crispr-cas9系统在食品微生物领域,特别是在食品酿造微生物和食品病原微生物中的应用进行综述,并进一步讨论影响该系统基因编辑效率的主要因素及发展方向,为crispr-cas9系统在食品微生物中的应用提供参考和依据。

关键词： crispr-cas系统食品微生物基因编辑

crispr-cas系统调控细菌生理功能的机制研究进展

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微生物学通报 2017年第12期44卷 3045-3052页

作者：张博姚学萍王印杨泽晓曹随忠张鹏飞四川农业大学动物医学院四川成都611130 动物疫病与人类健康四川省重点实验室四川成都611130

crispr-cas系统是存在于部分细菌和绝大部分古细菌中的一种获得性免疫防御系统,使细菌在外源性基因入侵时具有免疫防御能力。此外,crispr-cas系统对细菌自身生物膜的形成、耐药性、毒力等生理功能都有调控作用,这对于研究人员进行相关... 详细信息

crispr-cas系统是存在于部分细菌和绝大部分古细菌中的一种获得性免疫防御系统,使细菌在外源性基因入侵时具有免疫防御能力。此外,crispr-cas系统对细菌自身生物膜的形成、耐药性、毒力等生理功能都有调控作用,这对于研究人员进行相关研究有着重要意义。本文以细菌crispr-cas系统及其发挥免疫防御作用的相关研究为基础展开论述,重点阐述该系统对细菌生理功能的调控作用,并对其应用前景进行了展望,以期为进一步研究细菌耐药性和致病性提供新思路。

关键词：细菌 crispr-cas系统免疫防御生理功能调控作用

crispr-cas系统在核酸检测中的应用研究

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生物技术通报 2021年第9期37卷 266-273页

作者：胡秀文刘华王宇唐雪明王金斌曾海娟蒋玮李红上海海洋大学食品学院上海201306 上海农业科学院生物技术研究所上海201106 兰州理工大学生命科学与工程学院兰州730050 上海市农业遗传育种重点实验室上海201106 上海交通大学农业与生物学院 200240 上海市农业科学院畜牧兽医研究所上海201106

crispr-cas系统是一种高效、实用的基因编辑工具,被广泛应用于基因组编辑和调控机制研究。目前发现的cas系列核酸酶工具为开发用于各种目的的不同类型核酸检测,具有广阔的应用前景。crispr-cas系统的高灵敏度和高特异性,使其在病原体检... 详细信息

crispr-cas系统是一种高效、实用的基因编辑工具,被广泛应用于基因组编辑和调控机制研究。目前发现的cas系列核酸酶工具为开发用于各种目的的不同类型核酸检测,具有广阔的应用前景。crispr-cas系统的高灵敏度和高特异性,使其在病原体检测、单核苷酸多态性(SNP)分析以及基因突变检测等发挥了极其重要的作用;另外,crispr-cas系统在核酸检测领域的精确、高效性,间接推动了基础生物学和应用生物学研究的进展。概述了不同类型的靶向特定核酸检测的crispr-cas系统的最新进展和用途,以及与之对应的新一代的体外检测平台,旨为核酸检测领域提供新的研究思路和理论依据。

关键词：基因编辑 crispr-cas系统 cas蛋白核酸酶核酸检测

crispr-cas系统PAM依赖的新间隔序列获取的结构及分子机制

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中国科学基金 2016年第5期30卷 443-446页

作者：王久宇王艳丽中国科学院生物物理研究所核酸生物学重点实验室北京100101

原核生物的基因组中成簇有规律的间隔短回文重复序列（crispr）及其辅助蛋白（cas蛋白）一同构成crispr—cas系统，保护细菌和古菌等原核生物免受外界噬菌体和质粒的侵染。crispr阵列由长度序列完全相同的repeat序列和长度相近序列可变... 详细信息

原核生物的基因组中成簇有规律的间隔短回文重复序列（crispr）及其辅助蛋白（cas蛋白）一同构成crispr—cas系统，保护细菌和古菌等原核生物免受外界噬菌体和质粒的侵染。crispr阵列由长度序列完全相同的repeat序列和长度相近序列可变的spacer序列交替排列，其中spacer序列来自于宿主获取的外源DNA（图1）。

关键词： crispr-cas系统获取阶段蛋白质-DNA复合物晶体结构分子机制