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基于crispr cas12a的等温核酸检测技术用于新型隐球菌高敏诊断的临床研究

广西医科大学学报 2024年第4期41卷 483-488页

作者：叶辛刘伊诺张蕾罗明明李俊玉张黎明方文捷刘馨遥冉玉平潘炜华许斌廖万清西安交通大学第一附属医院检验科西安710061 海军军医大学附属长征医院皮肤科上海200003 陕西省人民医院皮肤科西安710068 江西省肿瘤医院南昌330029 四川大学华西医院成都610044

目的:构建基于crispr cas12a的高敏等温核酸检测方法,并评估其在支气管肺泡灌洗液及脑脊液中对于新型隐球菌的诊断能力。方法:利用NCBI Blast确定新型隐球菌保守序列,针对保守序列,设计等温重组酶聚合酶扩增引物及crRNA序列。利用新型... 详细信息

目的:构建基于crispr cas12a的高敏等温核酸检测方法,并评估其在支气管肺泡灌洗液及脑脊液中对于新型隐球菌的诊断能力。方法:利用NCBI Blast确定新型隐球菌保守序列,针对保守序列,设计等温重组酶聚合酶扩增引物及crRNA序列。利用新型隐球菌标准菌株及其他菌株(白念珠菌、热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌、金黄色葡萄球菌、脑膜炎奈瑟菌、肺炎链球菌),提取其核酸,以评估方法的特异性及最低检测限。进一步收集临床确诊的10例肺部及10例中枢神经系统新型隐球菌感染患者的支气管肺泡灌洗液及脑脊液,以评估本研究构建的核酸诊断方法的临床检测性能。结果:共设计6组引物及crRNA组合,经筛选得到1组最佳组合。本研究构建的检测方法特异性高(与7种其他类型菌株无交叉反应),最低检测限达到5 copies/μL,整个检测流程速度快(在1 h内完成)。针对10例支气管肺泡灌洗液及10例脑脊液临床标本的阳性检出率均为100%。结论:本研究构建的新型核酸检测方法,具有高度的特异性和良好的检测限,在临床标本检测中同样具有优良检测性能,具备了较强的临床新型隐球菌核酸检测的应用潜力。

关键词：新型隐球菌等温重组酶聚合酶扩增 crispr cas12a 临床诊断

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Single and multiplexed gene repression in solventogenic Clostridium via cas12a-based crispr interference

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Synthetic and Systems Biotechnology 2023年第1期8卷 148-156页

作者： Rochelle Carla Joseph Nicholas R.Sandoval Department of Chemical and Biomolecular Engineering Tulane UniversityNew OrleansLA70118United States

The Gram-positive,spore-forming,obligate anaerobic firmicute species that make up the Clostridium genus have broad feedstock consumption capabilities and produce value-added metabolic products,but genetic manipulation is difficult,limiting their broad ***-cas systems have recently been applied to Clostridium species,primarily using cas9 as a counterselection marker in conjunction with plasmid-based homologous *** interference is a method that reduces gene expression of specific genes via precision targeting of a nuclease deficient cas effector ***,we develop a dcas12a-based crispr interference system for transcriptional gene repression in multiple mesophilic Clostridium *** show the Francisella novicida cas12a-based system has a broader applicability due to the low GC content in Clostridium species compared to crispr cas systems derived from other *** demonstrate>99%reduction in transcript levels of targeted genes in Clostridium acetobutylicum and>75%reduction in Clostridium *** also demonstrate multiplexed repression via use of a single synthetic crispr array,achieving 99%reduction in targeted gene expression and elucidating a unique metabolic profile for their reduced ***,this work builds a foundation for high throughput genetic screens without genetic editing,a key limitation in current screening methods used in the Clostridium community.

关键词： crispr cas12a Clostridium crispri

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