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crispr-Cas9系统在肿瘤生物学中的应用及前景

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合成生物学 2023年第4期4卷 703-719页

作者：马孟丹尚梦宇刘宇辰深圳大学第一附属医院深圳市第二人民医院深圳转化医学研究院广东深圳518035 广东省泌尿生殖肿瘤系统生物学与合成生物学重点实验室广东深圳518035 汕头大学医学院广东汕头515041 深圳大学医学部基础医学院广东深圳518060

RNA引导的crispr-Cas核酸酶系统最初作为适应性免疫系统的一部分在细菌中被发现,其修改或修饰遗传成分的能力已经带来了各种实际应用,如碱基编辑、转录调控和表观遗传修饰等。由于crispr-Cas基因编辑工具不仅功能强大,而且具有特异性强... 详细信息

RNA引导的crispr-Cas核酸酶系统最初作为适应性免疫系统的一部分在细菌中被发现,其修改或修饰遗传成分的能力已经带来了各种实际应用,如碱基编辑、转录调控和表观遗传修饰等。由于crispr-Cas基因编辑工具不仅功能强大,而且具有特异性强、效率高等特点,可以准确、快速地对整个基因组进行筛选,便于对特定疾病进行基因治疗,已被广泛应用于人类疾病治疗的相关研究。在肿瘤研究领域,crispr-Cas系统可以用来编辑基因组,探索肿瘤发生、发展和转移的机制。文章阐述了crispr-Cas9系统作为癌症研究工具所取得的进展;总结了该技术在癌症基础研究、诊断和治疗中的应用现状;讨论了这一技术在肿瘤研究新热点领域和临床医学精准医疗方面的发展前景,并指出了其面临的技术挑战和未来的发展方向。

关键词： crispr相关蛋白 crispr-Cas衍生工具谱系追踪癌症诊断肿瘤治疗筛选药物靶点

基于crispr/Cas工具的肿瘤基因线路构建及应用

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合成生物学 2022年第1期3卷 53-65页

作者：宋斐刘宇辰蔡志明黄卫人深圳大学第一附属医院深圳市第二人民医院泌尿外科广东深圳518035 广东省泌尿生殖肿瘤系统生物学与合成生物学重点实验室广东深圳518035

以恶性肿瘤为代表的难治性疾病仍是困扰我国乃至全球的一个重大公共卫生问题。近年来,合成生物学的蓬勃发展,极大推动了疾病创新治疗策略,并显示出巨大潜力。人工构建的基因线路可特异性地识别、区分疾病细胞和正常细胞,并控制疾病细胞... 详细信息

以恶性肿瘤为代表的难治性疾病仍是困扰我国乃至全球的一个重大公共卫生问题。近年来,合成生物学的蓬勃发展,极大推动了疾病创新治疗策略,并显示出巨大潜力。人工构建的基因线路可特异性地识别、区分疾病细胞和正常细胞,并控制疾病细胞命运,为精准治疗提供了新途径。然而构建基因线路用于疾病治疗的挑战之一是缺乏有效、可编程、安全和序列特异性的基因编辑工具。crispr/Cas自从首次被用于哺乳动物基因编辑以来,已被广泛应用于研究、工业和医学领域。除Cas9诱导的indel突变外,crispr/Cas能够进行DNA/RNA的碱基编辑,为基因线路设计提供了高效的工具,极大提高了每个线路元件效率。因此,基于crispr技术的智能化基因线路的应用,可有效保证癌症等疾病治疗的安全性、高效性和特异性。本文介绍了crispr/Cas技术应用于医学合成生物学基因线路设计的研究进展和潜在挑战。评估了使用crispr系统元件的合成基因线路在肿瘤治疗中的效果,尤其利用人工开关诱导的Cas9干预肿瘤细胞治疗的安全性和有效性;介绍了crispr/Cas9介导的信号传感器设计,其可同时识别多个蛋白质信号,实现了多基因同步调控,以及新一代体系小、特异性强、基因调控效率高的crispr/Cas12a系统及其遗传改造。基于无启动子表达crispreader元件的精简基因线路设计,其高效启动的特点极大提升了智能化基因线路在未来精准癌症治疗中的应用潜力。

关键词：基因线路信号传感器恶性肿瘤成簇的规则间隔短回文重复 crispr相关蛋白

GATA1s敲除hPSCs模型构建与造血分化影响初探

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生命的化学 2023年第3期43卷 443-453页

作者：李霞李晓红周涯马峰张勇刚中国医学科学院北京协和医学院输血研究所成都610052

本文建立了GATA1s敲除人多能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs)细胞株,并以此为模型探讨了GATA1s缺失对体外诱导造血分化的影响。本文通过构建含有重组臂-敲入片段(GATA1外显子Ⅱ-Ⅵ序列及BGH polyA序列)-LoxP-潮霉素筛选标记... 详细信息

本文建立了GATA1s敲除人多能干细胞(human pluripotent stem cells,hPSCs)细胞株,并以此为模型探讨了GATA1s缺失对体外诱导造血分化的影响。本文通过构建含有重组臂-敲入片段(GATA1外显子Ⅱ-Ⅵ序列及BGH polyA序列)-LoxP-潮霉素筛选标记-LoxP-重组臂的打靶质粒和含有gRNA-Cas9的gRNA质粒对hPSCs进行基因编辑以敲除GATA1s。通过第一步电穿孔将以上质粒导入细胞,潮霉素初步筛选7 d后的阳性克隆进行下一步电穿孔环化重组酶(Cre)使LoxP位点特异性重组以去除筛选标记,通过单细胞克隆的方式进一步培养,PCR及测序鉴定出正确基因编辑细胞,最后通过蛋白质免疫印迹验证其GATA1与GATA1s蛋白的表达情况,验证敲除GATA1s后的细胞株进行体外诱导造血分化,发现其CD34^(+)、CD43^(+)及CD45^(+)细胞增多,但GPA^(+)、CD41a^(+)及CD42b^(+)细胞显著减少,通过转座子系统过表达GATA1也不能挽救其减少的GPA^(+)、CD41a^(+)及CD42b^(+)细胞。本研究建立了GATA1s敲除hPSCs细胞株,并发现其在造血分化时有重要作用。

关键词： GATA1 GATA1s 多能干细胞基因敲入技术聚簇规则间隔短回文重复序列 crispr相关蛋白造血分化

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遗传性血液系统疾病基因治疗的研究现状

国际输血及血液学杂志 2020年第4期43卷 294-299页

作者：李姗姗李彦欣上海交通大学医学院附属上海儿童医学中心血液/肿瘤科国家卫生健康委员会儿童血液肿瘤重点实验室 200127

目前,采取异基因造血干细胞移植(allo-HSCT),是临床上大多数遗传性血液系统疾病和原发性免疫缺陷病的根治手段。但是由于缺少人类白细胞抗原(HLA)相合供体,以及移植后可能发生移植物抗宿主病(GVHD),使该方法始终难以在临床推广、应用。... 详细信息

目前,采取异基因造血干细胞移植(allo-HSCT),是临床上大多数遗传性血液系统疾病和原发性免疫缺陷病的根治手段。但是由于缺少人类白细胞抗原(HLA)相合供体,以及移植后可能发生移植物抗宿主病(GVHD),使该方法始终难以在临床推广、应用。近年来,基因编辑和干细胞生物学技术发展迅速,利用患者自体造血干/祖细胞(HS/PC)进行基因治疗的方法日渐兴起,成为遗传性血液系统疾病基因治疗领域的的研究热点。一方面,基因治疗从根源上避免了免疫排斥的难题;另一方面,成簇规律间隔的短回文重复序列(crispr)-crispr相关蛋白(Cas)9系统的发现,使靶向基因治疗更具有可行性。crispr-Cas9系统能够对靶向基因进行定点剪切,达到修饰基因组DNA的目的。因此,笔者主要就基因编辑技术、遗传性血液系统疾病基因治疗的临床研究进展,以及基因治疗面临的挑战和发展方向进行阐述。

关键词：基因治疗成簇规律间隔的短回文重复序列 crispr-Cas9系统 crispr相关蛋白血红蛋白病 Wiskott-Aldrich综合征范科尼贫血黏多糖累积病

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国际输血及血液学杂志 2021年第6期44卷 520-529页

作者：谢芳莘蔡信平周建华李霞赖默温张勇刚马峰中国医学科学院输血研究所成都610052

目的探讨利用成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)/crispr相关蛋白(Cas)9基因编辑技术快速构建GATA1-mCherry实时追踪人多能干细胞(hPSC)株的方法。方法①选择GATA1基因为目的基因,利用crispr/Cas9技术构建共表达载体[Cas9和向导RNA(gRN... 详细信息

目的探讨利用成簇规律间隔短回文重复序列(crispr)/crispr相关蛋白(Cas)9基因编辑技术快速构建GATA1-mCherry实时追踪人多能干细胞(hPSC)株的方法。方法①选择GATA1基因为目的基因,利用crispr/Cas9技术构建共表达载体[Cas9和向导RNA(gRNA)]和打靶载体(重组臂),并且以电穿孔的方式将共表达载体、打靶载体及环化重组酶(Cre)导入hPSC的H1细胞系。经电穿孔后的H1细胞培养2 d后,选择24个H1细胞单克隆进行PCR扩增,以验证共表达载体和打靶载体是否被成功导入,以及Cre是否成功去除H1细胞单克隆中的筛选标志物。②挑取经PCR验证的条带大小正确的阳性H1细胞单克隆,进行细胞培养后,提取H1细胞单克隆基因组,并且分别采用引物对1/2(GATA15′端臂外引物/mCherry 3′端引物)和3/5(HygroR 5′端引物/GATA13′端臂外引物)对基因组进行PCR扩增,以验证该H1细胞单克隆是否具有GATA1和mCherry正确序列。③使用构建完成的H1∶GATA1-mCherry细胞进行造血功能验证实验,以确认基因编辑是否改变H1细胞特性,以及造血分化能力。选择未经基因编辑H1细胞和H1∶GATA1-mCherry细胞,置于相同的造血分化培养条件培养14 d后,分别于610 nm激发波长免疫荧光显微镜下观察,并采用流式细胞术(FCM)对细胞表面标志物CD34、CD43、CD45进行检测。选取培养至GATA1大量表达时期的H1∶GATA1-mCherry细胞,进行细胞甩片和免疫荧光染色实验。对经过基因编辑的H1∶GATA1-mCherry细胞,进行GATA1特异抗体染色体,观察其能否准确追踪并指示GATA1。结果①经电穿孔转入打靶载体和共表达载体后,H1细胞单克隆PCR扩增产物的电泳结果显示,H1细胞经电穿孔后,可获得2710和945 bp的PCR扩增产物电泳条带;电泳条带为2710 bp,说明该克隆基因组成功敲入GATA1和mCherry序列,但是Cre没有去除筛选标志物;条带大小为945 bp,说明该克隆基因组成功敲入GATA1和mCherry序列,并且Cre已去除筛选标志物,为目的H1细胞。选取24个H1细胞单克隆进行PCR验证结果显示,打靶载体和共表达载体成功敲入的H1细胞克隆、打靶载体和共表达载体成功敲入且Cre去除筛选标志的H1细胞克隆(目的细胞)及染色体纯合敲入的H1细胞比例分别为80%(20/24)、50%(10/20)和90%(18/20)。②H1∶GATA1-mCherry细胞进行造血诱导培养14 d时,荧光显微镜下GATA1表达时期可见大量红色荧光,FCM检测结果显示,未经基因编辑H1细胞与H1∶GATA1-mCherry细胞相比,造血干/祖细胞群比例相似,二者CD34^(+)CD45^(+)细胞比例分别为12.4%和14.1%,CD34^(+)CD45^(+)细胞比例分别为17.0%和20.2%,表明H1∶GATA1-mCherry细胞的造血分化能力没有改变。③GATA1高表达时期H1∶GATA1-mCherry细胞的免疫荧光染色实验结果显示,荧光显微镜下可见仅GATA1抗体染色阳性细胞有mCherry标志物,表明H1∶GATA1-mCherry细胞通过mCherry荧光蛋白对GATA1基因的标记是准确且特异的。结论本研究以GATA1为目的基因,在hPSC中快速、高效进行基因敲入,成功建立快速、实时示踪目的基因表达的方法。

关键词： GATA1转录因子多能干细胞基因敲入技术成簇规律间隔短回文重复序列 crispr相关蛋白 GATA1基因