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利用crispr/cas13a编辑技术获得马铃薯抗PVX植株

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植物保护学报 2024年第1期51卷 211-218页

作者：涂振钟子旸陈汝豪杨曼华詹晓慧陈家茹马恢聂碧华华中农业大学园艺林学学院果蔬园艺作物种质创新与利用全国重点实验室农业农村部马铃薯生物学与生物技术重点实验室武汉430070 恒敬合创生物医药(浙江)有限公司浙江嘉兴314000 湖北大学生命科学学院省部共建生物催化与酶工程国家重点实验室武汉430062 张家口市农业科学院马铃薯研究所河北张家口075000

为探究利用crispr/cas13a系统获得抗马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)马铃薯的可行性,通过设计靶向PVX中TGBp1基因的小向导RNA(small guide RNA,sgRNA),构建crispr/cas13a基因编辑载体,以马铃薯栽培种Désirée为受体材料进行稳定遗传转... 详细信息

为探究利用crispr/cas13a系统获得抗马铃薯X病毒(potato virus X,PVX)马铃薯的可行性,通过设计靶向PVX中TGBp1基因的小向导RNA(small guide RNA,sgRNA),构建crispr/cas13a基因编辑载体,以马铃薯栽培种Désirée为受体材料进行稳定遗传转化,并通过机械摩擦接种法鉴定转基因植株对PVX的抗性。结果显示,成功构建了靶向PVX的PVX-cas13a载体,并获得了表达cas13a的转基因马铃薯植株,对其中3个高表达cas13a的株系进行PVX抗性鉴定,发现在接种PVX 10~20 d后,转基因植株系统叶上无明显发病症状,且PVX积累量均显著低于未接种PVX对照。表明靶向PVX的crispr/cas13a系统能够有效抑制该病毒的积累,这为马铃薯抗PVX育种提供了一条有效策略。

关键词：马铃薯基因编辑 crispr/cas13a 马铃薯X病毒抗性鉴定

基于crispr/cas13a的马尔堡病毒核酸检测方法的建立

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微生物学报 2024年第8期64卷 3073-3085页

作者：闫阔诚李浩白萱洋韩尧石大伟贾雷立孙岩松中国人民解放军军事科学院军事医学研究院北京100071 中国人民解放军疾病预防控制中心北京100071 中国食品药品检定研究院传染病诊断试剂二室北京100050

【目的】建立一种基于成簇的规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白13a(clustered regularly interspaced short palindromic repeats/associated protein 13a,crispr/cas13a),针对马尔堡病毒核酸的快速检测方法。【方法】根据马尔堡病毒核蛋白(nucleoprotein,NP)基因保守区序列设计合成特异性的逆转录酶重组酶介导链替换核酸扩增(reverse transcription recombinase aided amplification,RT-RAA)引物及crispr RNA(crRNA),利用RT-RAA等温扩增技术对靶序列进行扩增,通过crispr/cas13a系统检测扩增产物,并结合消线法(easy-readout and sensitive enhanced,ERASE)侧流层析试纸进行结果判读。最后利用国家标准品对建立的新方法的灵敏度和特异性进行评估。【结果】筛选出一组针对马尔堡病毒NP基因的高效扩增引物和crRNA,建立了用于马尔堡病毒检测的crispr-ERASE方法,可在1 h内检测出浓度为1 copy/μL目标核酸,并与其他多种病原体无交叉反应。【结论】本研究基于crispr/cas13a建立了一种快速、简便、高灵敏度和高特异性的马尔堡病毒核酸检测方法。

关键词：马尔堡病毒 crispr/cas13a 核酸检测逆转录酶重组酶介导链替换核酸扩增(RT-RAA)

基于crispr/cas13a系统的发热伴血小板减少综合征病毒快速检测方法的建立

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寄生虫与医学昆虫学报 2024年

作者：丁康慧黄俊范娇邱少富刘洪波刘鸿博宋宏彬中国医科大学公共卫生学院流行病学教研室安徽医科大学公共卫生学院中国人民解放军疾病预防控制中心

蜱是一种可携带多种病原体的专性吸血节肢动物，发热伴血小板减少综合征（Severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS）是一种以蜱为传播媒介的新发传染病，因发热伴血小板减少综合征病毒（Severe fever with thrombocytopenia... 详细信息

蜱是一种可携带多种病原体的专性吸血节肢动物，发热伴血小板减少综合征（Severe fever with thrombocytopenia syndrome，SFTS）是一种以蜱为传播媒介的新发传染病，因发热伴血小板减少综合征病毒（Severe fever with thrombocytopenia syndrome virus，SFTSV）感染引起，病死率高且缺乏特效疗法，严重威胁人类生命健康。本研究建立了基于crispr（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats， crispr）系统快速、灵敏的现场核酸检测方法。首先，经序列比对分析得到SFTSV S基因特异性保守区，设计并筛选多酶恒温扩增（Multienzyme isothermal rapid Amplification，MIRA）引物和靶标crispr RNA（crispr RNA，crRNA），经荧光信号和免疫层析试纸读取检测结果。为提升检测敏感度在单反应体系中加入多个检测靶标crRNA。并利用蜱感染模拟样本和蜱源样本验证了该方法对蜱虫样本现场核酸检测的有效性。结果显示，MIRA-crispr/cas13a荧光法检测SFTSV的最低检测限为1 copy/μL，试纸法的最低检测限为10 copies/μL。特异性实验表明SFTSV与其他4种阴性对照病原均无交叉反应。该方法检测蜱感染模拟样本的检测灵敏度优于RT-RCR法。应用所建立的方法检测29份蜱源SFTSV样本共检出20份阳性样本和9份阴性样本，与RT-PCR检测结果符合率为100%。结果表明，本文所建立的方法可用SFTSV的现场快速检测。

关键词：发热伴血小板减少综合征病毒 crispr/cas13a 等温扩增蜱核酸检测

猪流行性腹泻病毒RAA-crispr/cas13a检测方法的建立与初步应用

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畜牧兽医学报 2023年第9期54卷 3991-3997页

作者：刘华殷冬冬邵颖宋祥军王振宇潘孝成涂健何长生朱良强祁克宗安徽农业大学合肥230036 安徽省动物疫病预防与控制中心合肥230091 安徽省农业科学院畜牧兽医研究所合肥230031

将重组酶辅助扩增技术(recombinase aided amplification,RAA)与规律间隔性成簇短回文重复序列相关cas13a蛋白(crispr-cas13a)技术相结合,即RAA-cas13a,建议建立高效、灵敏、特异的猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)检测方法。针对PEDV N基因保守区设计RAA特异性引物和crispr RNA(crRNA),利用RAA技术扩增样本核酸,并进行crispr-cas13a荧光检测,以RT-qPCR为对照方法,评价该方法的灵敏度、特异性及与RT-qPCR法的一致性。结果表明,该方法最低可检测至101 copies·μL^(-1),且与猪圆环病毒1型、猪圆环病毒2型、猪圆环病毒3型、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒及猪伪狂犬病病毒等常见猪源病原核酸检测无交叉反应。采用RAA-cas13a检测40份临床样本与RT-qPCR方法阳性符合率为100%,阴性符合率为84.6%,总符合率为95%,Kappa值为0.881。本研究建立的RAA-cas13a方法灵敏度高、特异性强,为PEDV的临床诊断和流行病学监测提供了可靠的技术手段。

关键词：猪流行性腹泻病毒 crispr/cas13a 重组酶辅助扩增 N基因检测

基于crispr/cas13a技术检测肿瘤驱动基因TP53 R248W的研究

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南京医科大学学报（自然科学版） 2022年第8期42卷 1119-1124页

作者：邝振展肖斌孙朝晖罗镕何洁雯李林海中国人民解放军南部战区总医院检验科广东广州510010 广州医科大学附属第六医院(清远市人民医院)检验医学部广东清远511518 广州医科大学金域检验学院广东广州510180 广州南方学院云康医学与健康学院广东广州510970

目的:建立一种基于crispr/cas13a的TP53 R248W变异体的快速检测技术。方法:根据Over-lap PCR技术,以TP53野生型质粒为模板构建TP53 R248W变异体质粒;对TP53R248W变异体扩增产物大小,扩增反应条件及crRNA长度和浓度进行优化,初步建立基于... 详细信息

目的:建立一种基于crispr/cas13a的TP53 R248W变异体的快速检测技术。方法:根据Over-lap PCR技术,以TP53野生型质粒为模板构建TP53 R248W变异体质粒;对TP53R248W变异体扩增产物大小,扩增反应条件及crRNA长度和浓度进行优化,初步建立基于crispr/cas13a的R248W变异体快速检测方法;利用不同突变率TP53 R248W变异体及模拟血浆ctDNA,评价crispr/cas13a方法的检测灵敏度。结果:建立的crispr/cas13a方法成功检测出产物大小为368 bp的TP53R248W片段;在0.05~0.25μmol/L浓度范围内,crRNA浓度越高,检测结果相对荧光值越高;该方法检测TP53 R248W变异体的灵敏度为1×10~4拷贝/μL,最低可以检测出突变率为0.01%的变异体。结论:建立的crispr/cas13a方法具有快速、简便、灵敏、特异等优点,为组织和血浆中的TP53 R248W变异体的检测提供了新的技术手段。

关键词： crispr/cas13a TP53 R248W crRNA 快速检测

基于crispr/cas13a系统的嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌和肺炎克雷伯菌高敏感现场检测技术研究

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基于CRISPR/Cas13a系统的嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌和肺炎克雷伯...

作者：陈思嘉中国医科大学

学位级别：硕士

目的:细菌、病毒、支原体、衣原体等病原引起的呼吸道传染病一直以来都是引起社会广泛关注的公共卫生问题。本研究联合运用重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase aided amplification,RAA)、crispr(clustered regularly interspaced ... 详细信息

目的:细菌、病毒、支原体、衣原体等病原引起的呼吸道传染病一直以来都是引起社会广泛关注的公共卫生问题。本研究联合运用重组酶介导等温核酸扩增技术(Recombinase aided amplification,RAA)、crispr(clustered regularly interspaced short palindromic repeats)荧光法以及免疫层析技术检测嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌和肺炎克雷伯菌三种呼吸道病原,以期实现准确高效、特异灵敏的现场检测。研究方法:1、查找文献、专利确定嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌和肺炎克雷伯菌具有高度保守性和稳定性的基因作为检测的目的基因,合成目的基因序列作为阳性参考品备用。2、依据crispr/cas13a检测原理在目的基因里设计嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌的特异性靶标序列(protospacer),并将序列合成成cr RNA(crispr-RNA)。3、建立crispr/cas13a荧光检测体系,通过crispr荧光法筛选出嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌、肺炎克雷伯菌相对较优cr RNA。4、依据RAA引物设计原则设计各菌的恒温扩增引物,通过DNA凝胶电泳实验筛选出各菌的相对较优引物。5、评价各菌的crispr荧光法和免疫层析法的特异性、检测限。结果:1、针对嗜肺军团菌,确定检测的目的基因为Mip,筛选出相对较优的特异性引物组和cr RNA分别为F6R3、cr RNA10,crispr/cas13a荧光法和免疫层析法检测特异性良好,与其他十种呼吸道病原无交叉反应,检测限分别达到1 copy/μL、0.5 copies/μL。2、针对流感嗜血杆菌,确定检测的目的基因为Omp6,筛选出相对较优特异性引物组和cr RNA分别为F5R4、cr RNA1,crispr/cas13a荧光法和免疫层析法检测特异性良好,与其他十种呼吸道病原无交叉反应,两种检测方法的检测限均达到1copy/μL。3、针对肺炎克雷伯菌,确定检测的目的基因为pho E,筛选出相对较优特异性引物组和cr RNA分别为F2R6、cr RNA1,crispr/cas13a荧光法和免疫层析法检测特异性良好,与其他十种呼吸道病原无交叉反应,检测限分别达到0.5 copies/μL、1 copy/μL。结论:1、基于crispr/cas13a荧光法检测体系,可以特异的、灵敏的、快速的实现对嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌和肺炎克雷伯菌的检测。2、基于crispr/cas13a免疫层析法检测体系,对嗜肺军团菌、流感嗜血杆菌和肺炎克雷伯菌的检测具备了快速、灵敏、特异、便携且结果直观等特点,有望实现现场检测。

关键词：呼吸道病原 crispr/cas13a 免疫层析法现场检测

基于crispr/cas13a基因编辑技术建立的H9N2亚型禽流感病毒检测方法

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基于CRISPR/Cas13a基因编辑技术建立的H9N2亚型禽流感病毒检测方法

作者：陈莎莎吉林农业大学

学位级别：硕士

H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,简称AIV)是一种在不同鸟类物种之间传播的甲型流感病毒。近年来,H9N2亚型AIV已成为鸡、鸭、鸽群中最主要的亚型,对家禽业产生了巨大的威胁。除此之外,H9N2亚型AIV的6个内部基因会频繁与其他... 详细信息

H9N2亚型禽流感病毒(Avian influenza virus,简称AIV)是一种在不同鸟类物种之间传播的甲型流感病毒。近年来,H9N2亚型AIV已成为鸡、鸭、鸽群中最主要的亚型,对家禽业产生了巨大的威胁。除此之外,H9N2亚型AIV的6个内部基因会频繁与其他流感病毒重新组合,生成可感染人类的新型流感病毒,对人类的公共卫生方面也产生了巨大的威胁。对于流行病的预防和控制而言,病原的早期、快速诊断具有重要意义。然而,目前的H9N2亚型AIV诊断方法存在着灵敏度低、特异性差、耗时长以及需要专用设备和熟练操作人员等问题。因此,一种准确且快速有效的H9N2亚型AIV诊断方法十分必要。几乎所有的古细菌和大约一半的细菌都具有成簇的规律间隔的短回文重复序列系统(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats system,简称crispr)。crispr系统中的crispr/Lw cas13a具有RNA酶切活性可反式切割单链RNA,cas13a还可导致旁观者RNA分子的反式裂解效应。张峰团队利用这种裂解活性结合基于重组酶聚合酶的等温扩增技术开发了一种核酸检测方法,命名为SHERLOCK(Specific high-sensitivity enzymatic reporter unlocking)。基于crispr/cas13a技术的病原检测方法具有特异性强、灵敏度高、检测方便等特点,更适合于实际应用。本研究旨在建立一种新的基于crispr/cas13a技术检测H9N2亚型AIV的方法,主要研究内容及结果如下:*** cas13a蛋白的表达纯化与活性鉴定利用大肠杆菌诱导表达可溶性Lw cas13a蛋白,使用His Trap Ni Sepharose excel层析柱对可溶性Lw cas13a蛋白进行纯化,设置阴性对照组检测Lw cas13a蛋白的切割活性。结果表明在21℃条件下,利用终浓度为0.5 m M的IPTG诱导大肠杆菌可成功表达可溶性Lw cas13a蛋白。使用His Trap Ni Sepharose excel层析柱纯化后可得到相对纯度较高的Lw cas13a蛋白。对Lw cas13a蛋白进行活性鉴定时,实验组的荧光信号远高于阴性对照组,表明纯化后得到的Lw cas13a蛋白具有良好的RNA酶切活性。2.基于crispr/cas13a技术H9N2亚型AIV检测体系的建立、优化及评估将NCBI公布的30条H9N2亚型AIV HA基因和NA基因与本实验中使用的H9N2亚型AIV株HA基因和NA基因进行序列比对,选取保守序列作为模板,依据RPA引物设计原则设计3个RPA引物对,利用RT-RPA技术扩增目的基因,筛选出扩增效率最高的RPA引物对。依据cr RNA设计原则设计三条cr RNA,利用crispr/cas13a技术对H9N2亚型AIV进行核酸检测,通过荧光强度筛选出最佳的cr RNA。将纯化后的Lw cas13a蛋白和最佳cr RNA依次以2倍的梯度进行倍比稀释,通过荧光强度确定最佳的Lw cas13a蛋白浓度和cr RNA浓度。结果表明Lw cas13a蛋白最佳浓度为12.5 ng/μL,cr RNA最佳浓度为0.9375ng/μL。为了评估基于crispr/cas13a技术构建的H9N2亚型AIV检测体系,利用前期优化的检测体系检测10倍倍比稀释处理后的H9N2亚型AIV基因组,依据荧光强度确定构建检测体系的最低检测限。利用前期优化的检测体系对禽类易感的不同病毒样本进行检测,依据是否产生荧光信号判定构建检测体系的特异性。结果表明基于crispr/cas13a技术构建的H9N2亚型AIV检测体系的最低检测限为10copies/μL,敏感度较高。基于crispr/cas13a技术构建的H9N2亚型AIV检测体系在检测禽类易感的不同病毒时除H9N2亚型AIV外无荧光信号,证实该检测体系特异性较强。综上所述,本实验构建了基于crispr/cas13a技术检测H9N2亚型AIV的方法,为H9N2亚型AIV的诊断提供新的方法和思路,也为实现H9N2亚型AIV的现场检测奠定基础。

关键词： crispr/cas13a 禽流感病毒 RT-RPA技术 SHERLOCK 检测方法

一种基于RPA-crispr/cas13a的快速可视化溶藻弧菌核酸检测方法的建立与应用

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一种基于RPA-CRISPR/Cas13a的快速可视化溶藻弧菌核酸检测方法的...

作者：王亚楠河北北方学院

学位级别：硕士

溶藻弧菌是一种重要的人畜共患病原体,其感染水产养殖动物后可造成巨大经济损失;感染人类后可诱发较严重的血流或皮肤感染、食源性腹泻及相关并发症。传统检测方法操作流程复杂或需要使用专业仪器检测,一定程度上限制了溶藻弧菌的现场... 详细信息

溶藻弧菌是一种重要的人畜共患病原体,其感染水产养殖动物后可造成巨大经济损失;感染人类后可诱发较严重的血流或皮肤感染、食源性腹泻及相关并发症。传统检测方法操作流程复杂或需要使用专业仪器检测,一定程度上限制了溶藻弧菌的现场快速检测。因此,建立一种适用于非实验室场景下的溶藻弧菌快速检测方法对于溶藻弧菌感染救治及挽救海水养殖业经济损失有重要意义。gyrB基因编码DNA促旋酶B亚基蛋白,该基因相对保守,对于弧菌属的鉴别有一定价值,常作为弧菌属核酸检测的靶点。本研究中,利用MEGA软件对弧菌属gyrB基因进行进化树发育分析,验证了该基因对于相似弧菌种属间鉴别的有效性;进一步选择副溶血弧菌标准菌株、河流弧菌标准菌株、哈维氏弧菌标准菌株及创伤弧菌标准菌株的gyrB基因与溶藻弧菌标准菌株gyrB基因进行序列比对,针对溶藻弧菌gyrB基因保守区段设计重组酶聚合酶扩增（Recombinase polymerase amplification,RPA）技术的特异性引物及crispr核糖核酸（crispr RNA,cr RNA）序列;然后运用RPA技术在恒温条件下对核酸模板进行快速扩增,并通过与crispr/cas13a反应体系结合提高检测灵敏度及特异性;最后与荧光或侧流层析试纸条结合实现结果判读可视化。构建含溶藻弧菌gyrB基因片段的质粒并将质粒倍比稀释后作为灵敏度验证的模板;以种属相近的海洋弧菌（副溶血弧菌、河流弧菌、梅氏弧菌）及临床常见致病菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿假单胞菌）基因组DNA作为模板用以评价上述两种检测方法的特异性;通过对实验室前期分离鉴定的35株野生溶藻弧菌进行检测,用以验证上述两种检测方法在临床应用的可行性。实验结果显示,本研究建立的RPA-crispr/cas13a荧光法及RPA-crispr/cas13a-LFD法均具有较高的灵敏度,RPA-crispr/cas13a荧光法与RPA-crispr/cas13a-LFD法的最低检出限分别为1copy·μL和1×10～1copies·μL,且两种方法与种属相近的海洋弧菌及临床常见致病菌均无交叉反应。RPA-crispr/cas13a荧光法与RPA-crispr/cas13a-LFD法对35株野生溶藻弧菌的阳性检出率皆为100%（35/35）,与MALDI-TOF MS质谱鉴定结果及Taqman-qPCR的检测结果一致,特异性和灵敏度均可达100%,证实上述两种方法可用于临床野生溶藻弧菌的核酸检测。综上所述,与细菌培养鉴定法、Taqman-qPCR法等常见溶藻弧菌检测方法相比,本研究建立的基于RPA-crispr/cas13a反应体系的溶藻弧菌核酸检测方法具有快速、灵敏度高、特异性高、判读结果可视化、不需要复杂升降温仪器设备等特点,不但适用于缺乏专业仪器及专业操作人员场景下的溶藻弧菌核酸检测,而且可缩短检测时间并提高检测效率。

关键词：溶藻弧菌 RPA技术 crispr/cas13a 核酸检测可视化检测现场检测

基于RAA-crispr/cas13a的猪伪狂犬病毒检测方法的建立及初步应用

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基于RAA-CRISPR/Cas13a的猪伪狂犬病毒检测方法的建立及初步应用

作者：王恩惠山东农业大学

学位级别：硕士

猪伪狂犬是由猪伪狂犬病毒(PRV)引起的一种急性传染病,属于疱疹病毒科,甲型疱疹病毒亚科,猪疱疹病毒Ⅰ型。可感染不同日龄的猪,其中新生仔猪死亡率达100%可造成母猪繁殖障碍,这给国内外养猪业造成巨大的经济损失。由于PRV无特征性剖检变... 详细信息

猪伪狂犬是由猪伪狂犬病毒(PRV)引起的一种急性传染病,属于疱疹病毒科,甲型疱疹病毒亚科,猪疱疹病毒Ⅰ型。可感染不同日龄的猪,其中新生仔猪死亡率达100%可造成母猪繁殖障碍,这给国内外养猪业造成巨大的经济损失。由于PRV无特征性剖检变化,感染后常呈隐形经过,只能依靠快速诊断及分子生物学的方法进行确诊。目前,针对PRV的检测方法虽各有优势,但大多数仍需大型实验仪器设备及专业操作人员来完成,过程繁琐且耗时,因此,建立一种操作简单、快速灵敏、可以进行现场检测且特异性强的检测方法对PRV的预防和控制有重要意义。crispr/cas系统是主要的基因编辑工具,其中crispr/cas13a蛋白不仅切割靶标RNA而且具有附属切割活性,一旦被激活可非特异性的切割单链RNA,与传统RNA干扰技术相比,具有更强的切割特异性与识别能力。利用这一特性,将反应体系中加入ss RNA报告分子,可实现对结果的可视化读数,此外,结合侧流试纸条,利用快速便捷的特点,在无需专业人员就可操作,实现高灵敏度、高特异性的检测。重组酶介导核酸等温扩增技术(RAA)是一种新的体外核酸扩增技术,利用重组酶、单链结合蛋白和DNA重组酶在恒温条件下(37℃)短时间就可完成对靶标的扩增。因快速、价格低且无需热循环仪器就可操作,在基层和现场检测种受到广泛推广。现如今,将重组酶介导的扩增(RAA)技术与crispr/cas13a检测系统相结合,已被应用于非洲猪瘟、猪瘟、猪流行性腹泻等病毒的检测,但目前还没有建立一种检测PRV的方法。本研究基于上述两种检测技术,通过将RAA与crispr/cas13a的切割反应相结合,建立PRV的快速检测的方法。具体研究结果如下:1.成功表达纯化Lbacas13a蛋白,并验证其切割活性,将Lbacas13a质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)后,在IPTG浓度为0.5 m M,温度16℃,转速150 r/min条件下诱导20 h,成功诱导所需蛋白,并经镍柱纯化出了Lbacas13a蛋白,经过检测证明了其具有较好的切割活性。2.成功设计出针对PRV且适用于Lbacas13a的cr RNA,对比多个不同株的同一基因找到保守序列并根据cas13a的PFS序列特征找到Protospacer序列并设计了cr RNA,经过检测证明设计的cr RNA可用于检测。3.成功设计并筛选了针对检测靶序列的RAA和PCR引物,且在引物上游5′端添加T7启动子序列,等温扩增以及荧光显色的实验结果表明设计的引物可以扩增靶序列且用于检测,根据RAA设计原则设计了四对,根据比较结果分析,选出最佳的一对用于检测RAA。4.成功建立基于crispr/cas13a检测PRV的方法并进行体系优化。结果显示一管反应为最佳,且进行cas13a和cr RNA最佳浓度体系的优化,结果显示cas13a浓度为400 n M,cr RNA浓度为400 n M时,荧光监测体系反应1 h得到可靠结果,试纸条监测体系最短20 min反应得到可靠结果。5.检测了该方法的特异性、灵敏性以及重复性。将PRV与PCV2、PCV3、PRRSV、CSFV、ASFV阳性样品通过该检测方法检测后仅PRV检测结果呈阳性,表明该检测方法具有良好的特异性;检测10-10copies/μL的PCR产物,结果显示该检测方法可检测PRV的下限为10 copies/μL,经过多批次检测不同拷贝数阳性样品后,批内变异系数小于5%,批间变异系数小于10%,表明该检测方法具有良好的重复性。综上所述,本研究建立了一种在恒温条件下实现快速检测PRV的方法,结果可在荧光和试纸条方式直接判读,该方法在无需大型仪器的条件下就可完成,具有操作简单、要求低、耗时短,这在养猪业的预防和检疫中成为有力工具,为PRV的诊断及流行病学调查提供了一种新的技术。

关键词：猪伪狂犬重组酶介导等温核酸扩增技术 crispr/cas13a 检测方法