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弱精子症患者精子中crisp2基因及蛋白的初步研究

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中华男科学杂志 2011年第3期17卷 203-207页

作者：景晓玮邢荣威周其赵余庆锋郭文彬陈思梅褚庆军冯春琼毛向明南方医科大学南方医院泌尿外科广东广州510515 青岛大学医学院附属威海医院泌尿外科山东威海264200 南方医科大学附属第三医院泌尿外科广东广州510515 南方医科大学南方医院生殖中心广东广州510515 南方医科大学基因工程研究所广东广州510515

目的:探讨弱精子症患者精子中富含半胱氨酸的分泌蛋白2(crisp2)mRNA及蛋白的表达水平,探讨其与精子活力的关系及相关的分子机制。方法:收集成年男性弱精子症患者精液78例,活力正常精液70例作为对照组,50% Percoll离心分离纯化后,提取精... 详细信息

目的:探讨弱精子症患者精子中富含半胱氨酸的分泌蛋白2(crisp2)mRNA及蛋白的表达水平,探讨其与精子活力的关系及相关的分子机制。方法:收集成年男性弱精子症患者精液78例,活力正常精液70例作为对照组,50% Percoll离心分离纯化后,提取精子总RNA及总蛋白,采用RT-PCR,SYBR Green实时定量PCR和Western印迹技术检测crisp2 mRNA及蛋白相对表达量。结果:crisp2基因在弱精子症患者精子中的表达量明显低于其在正常对照组精子中的表达量,下降达4.3倍;Western印迹发现crisp2蛋白在弱精子症组较正常对照组下降达1.71倍,两组之间的表达量有明显的统计学差异(Pcrisp2基因及蛋白在弱精子症患者精子中的表达下调可能与精子活力下降有密切联系,提示crisp2基因及蛋白可能成为弱精子症发病机制研究的一个分子靶标。

关键词：精子 crisp2 实时定量PCR 免疫印迹弱精子症

crisp2基因在不同类型精子发生障碍中的表达及其意义

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天津医药 2013年第11期41卷 1052-1054,I0003页

作者：江莉李慕军覃莉广西医科大学第一附属医院生殖中心 530021

目的探讨不同类型精子发生障碍男性精液中crisp2 mRNA的表达水平及其意义。方法 150例男性不孕患者分为正常组、弱精子组、少精子组各50例,提取精液细胞总RNA,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测定3组精子中crisp2基因的mRNA转... 详细信息

目的探讨不同类型精子发生障碍男性精液中crisp2 mRNA的表达水平及其意义。方法 150例男性不孕患者分为正常组、弱精子组、少精子组各50例,提取精液细胞总RNA,通过实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)测定3组精子中crisp2基因的mRNA转录水平并进行比较。结果 crisp2在正常组中的相对表达量(10.281±2.173)显著高于弱精组(2.092±0.969),差异有统计学意义(P20±2.794)差异无统计学意义(P>0.05),而弱精子组的crisp2相对表达量也显著低于少精组(Pcrisp2在不同精子发生障碍男性中的表达显著不同,crisp2表达的减少可能导致精子活力下降。

关键词：精子发生 RNA RNA 信使基因表达 crisp2

版纳微型猪近交系不育和可育公猪crisp2基因全长编码区序列克隆及睾丸差异表达分析

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云南农业大学学报（自然科学版） 2015年第5期30卷 698-705页

作者：陈园园潘伟荣霍金龙王淑燕王配查星琴曾养志云南农业大学动物科学技术学院云南省版纳微型猪近交系重点实验室云南昆明650201

crisp2作为弱精子症发生的重要候选基因,为深入研究crisp2与精子活力的关系及其在体内的调节与功能提供基础资料,本研究以版纳微型猪近交系(BMI)不育和可育公猪为试验动物,通过RT-PCR方法扩增得到crisp2基因全长编码区序列,不育和可育... 详细信息

crisp2作为弱精子症发生的重要候选基因,为深入研究crisp2与精子活力的关系及其在体内的调节与功能提供基础资料,本研究以版纳微型猪近交系(BMI)不育和可育公猪为试验动物,通过RT-PCR方法扩增得到crisp2基因全长编码区序列,不育和可育公猪序列无差异,提交Gen Bank数据库,获得登录号为"KP780059"。生物信息学分析显示,该基因编码244个氨基酸,蛋白分子量为27.05 ku,等电点为6.76。蛋白质结构分析得出,crisp2存在2个保守域,无跨膜结构,存在信号肽及1个亮氨酸富集的核输出信号,N端、C端均疏水;亚细胞定位显示该蛋白分泌到细胞周质的概率为94.1%。系统进化分析表明,猪与牛、绵羊的亲缘关系较近。同时,利用荧光定量PCR法确定了crisp2 mRNA在BMI不育及可育公猪14个组织中的表达量,发现其在睾丸中特异表达,crisp2基因在不育公猪睾丸中的表达量明显低于可育公猪,两组之间的表达量有显著的统计学差异(Pcrisp2表达的减少可能导致精子活力下降。本研究为进一步研究猪crisp2基因在精子发生方面的作用奠定研究基础。

关键词：猪 crisp2 精子发生生物信息学组织表达

绒山羊crisp2和PDIA3相互结合的研究

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绒山羊CRISP2和PDIA3相互结合的研究

作者：王美丽内蒙古大学

学位级别：硕士

哺乳动物的精卵融合过程是个复杂而精巧的事件,需要一些特异性蛋白相互作用来介导。其中精子上的PDIA3（ERp57）是蛋白二硫键异构酶（protein disulfide isomerase, PDI）家族的成员,具有催化二硫键的功能,crisp2是富含半胱氨酸的分泌... 详细信息

哺乳动物的精卵融合过程是个复杂而精巧的事件,需要一些特异性蛋白相互作用来介导。其中精子上的PDIA3（ERp57）是蛋白二硫键异构酶（protein disulfide isomerase, PDI）家族的成员,具有催化二硫键的功能,crisp2是富含半胱氨酸的分泌蛋白（cysteine secretory proteins, crisps）家族的成员,具有16个保守的半胱氨酸和它们所形成的复杂的二硫键,这两种蛋白质都参与了精卵的融合过程,但是到目前为止这两种蛋白质在精卵结合与融合过程中的作用机制尚不清楚。我们猜测PDIA3可能会催化crisp2分子中的二硫键从而引起其构象发生改变而介导精卵融合。为了验证这一想法,本实验构建了绒山羊PDIA3和crisp2成熟肽和分段真核表达载体,用免疫共沉淀和酵母双杂交技术检测了PDIA3与crisp2能否互相结合。首先根据本实验室克隆的绒山羊crisp2（GU362703.1）和PDIA3的cDNA序列（GU985268.1）,分析了它们的结构特点及其功能域后,将其各分为两段,即crisp2A （24～176aa,去掉信号肽后）、crisp2B （177～244aa）、PDIA3A （26～376aa,去掉信号肽后）和PDIA3B（377～505aa）段。在设计引物构建pcDNA真核表达载体的时候,给PDIA3（26～505aa）、PDIA3A和PDIA3B的C端加了HA标签,crisp2（24～376aa）、crisp2A和crisp2B的C端加了6His标签,使用抗HA标签和His标签的单克隆抗体进行免疫共沉淀。把构建好的真核表达载体分成五组,即pcDNA-Pdia3和pcDNA-crisp2、 pcDNA-Pdia3A和pcDNA-crisp2A、pcDNA-Pdia3A和pcDNA-crisp2B、pcDNA-Pdia3B和pcDNA-crisp2A、 pcDNA-Pdia3B和pcDNA-crisp2B。五组分别共转染人293T细胞系,进行了免疫共沉淀实验。实验结果显示：PDIA3A可以分别和crisp2A、crisp2B发生相互作用,而PDIA3B不能和crisp2的任何一段发生作用。此外,用上述片段成功构建了酵母双杂交载体pGBK-Pdia3、pGBK-Pdia3A、pGBK-Pdia3B、pGAD-crisp2、 pGAD-crisp2A和pGAD-crisp2B,然后像免疫共沉淀载体一样,也将酵母载体分成了五组,进行了五组酵母双杂交的实验。酵母双杂交的实验结果显示：PDIA3A可以分别和crisp2A、crisp2B发生相互作用,PDIA3B不能不参与任何作用。免疫共沉淀和酵母双杂交实验结果,初步证明了绒山羊PDIA3与crisp2之间存在相互作用,并且通过对两个蛋白进行分段表达鉴定,也初步找到了二者发生相互作用的具体结构域,即PDIA3A （而非PDIA3B）能分别与crisp2A和crisp2B结合。实验结果暗示crisp2可能是PDIA3的一种底物,为进一步鉴定由PDIA3直接引起crisp2分子内的二硫键改变奠定了基础。

关键词：绒山羊 PDIA3 crisp2 免疫共沉淀酵母双杂交蛋白相互作用

SPACA3与SPACA1、PDIA3及crisp2之间的相互作用鉴定

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SPACA3与SPACA1、PDIA3及CRISP2之间的相互作用鉴定

作者：乔燕内蒙古大学

学位级别：硕士

受精是哺乳动物有性生殖的基本过程,精卵融合是受精过程的关键步骤,它是由多个分子共同参与并协助完成的过程。研究发现,哺乳动物的精卵融合除了必需有精子的IZUMO1与卵子的JUNO相互作用外,还需要PDIA3、crisp2、SPACA3以及SPACA1等多... 详细信息

受精是哺乳动物有性生殖的基本过程,精卵融合是受精过程的关键步骤,它是由多个分子共同参与并协助完成的过程。研究发现,哺乳动物的精卵融合除了必需有精子的IZUMO1与卵子的JUNO相互作用外,还需要PDIA3、crisp2、SPACA3以及SPACA1等多种其他精子或卵子上的蛋白相互作用。本研究用酵母双杂交和免疫共沉淀技术在分子水平上鉴定了大鼠SPACA1与SPACA3之间的相互作用。并利用间接免疫荧光技术对SPACA1与SPACA3、PDIA3与SPACA3、PDIA3与crisp2在大鼠和绵羊精子上进行共定位。为全面理解精卵融合的分子机制提供了新的资料。首先,我们克隆了大鼠spaca1和spaca3的cDNA及绵羊pdia3、crisp2和spaca3的cDNA,构建pGBK-spaca1与pGAD-spaca3酵母表达载体和pCMV-C-HA-spaca1与pCMV-C-Flag-spaca3真核表达载体,分别用酵母双杂交和免疫共沉淀的实验方法鉴定发现SPACA1与SPACA3之间存在相互作用。鉴定蛋白的细胞和亚细胞定位需要抗体。为了制备大鼠SPACA1和SPACA3以及绵羊PDIA3、crisp2和SPACA3的抗体,我们构建了大鼠pET-28a-spaca1、pET-28a-spaca3、绵羊pGEX-pdia3、pGEX-crisp2和pGEX-spaca3原核表达载体,分别转入*** BL21(DE3)细胞中诱导表达,得到了SPACA1-HIS、SPACA3-HIS、PDIA3-GST、crisp2-GST和SPACA3-GST重组融合蛋白。用SPACA3-HIS、PDIA3-GST免疫家兔、SPACA1-HIS、crisp2-GST、SPACA3-GST免疫小鼠,得到了兔抗大鼠SPACA3、兔抗绵羊PDIA3血清和小鼠抗大鼠SPACA1、小鼠抗绵羊crisp2、小鼠抗绵羊SPACA3腹水多克隆抗体。然后,以自制兔抗大鼠SPACA3血清和小鼠抗大鼠SPACA1腹水多克隆抗体为一抗,鉴定了SPACA1和SPACA3在大鼠睾丸组织和精子上的定位。结果显示:SPACA1存在于精子细胞和睾丸曲细精管中成熟精子上,在支持细胞和间质细胞中均不表达;SPACA3表达于大鼠睾丸组织的间质细胞、精原细胞和精母细胞中,主要存在于成熟精子中。精子发生顶体反应后,SPACA1与SPACA3能共定位于精子头部赤道段。以自制兔抗绵羊PDIA3血清、小鼠抗绵羊crisp2和小鼠抗绵羊SPACA3腹水多克隆抗体为一抗,鉴定了PDIA3、crisp2以及SPACA3在绵羊精子上的共定位。结果显示:Ca诱导的精子顶体反应发生后,SPACA3与PDIA3共定位于精子头部的赤道段,而PDIA3与crisp2不存在共定位。论文结果说明,精子溶酶体相关蛋白SPACA3与SPACA1和PDIA3在精子顶体反应后发生相互作用,共同参与精子与卵子结合或融合过程,而crisp2与PDIA3可能独立参与精卵结合或融合过程,二者的相互作用不发生在精子上,可能发生在细胞生物学的其他过程中。

关键词：精卵融合 SPACA1 SPACA3 crisp2 PDIA3

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与大鼠crisp2相互作用蛋白的初步筛选

与大鼠CRISP2相互作用蛋白的初步筛选

作者：杨晓鹏内蒙古大学

学位级别：硕士

有性生殖是自然界中非常重要的一种繁殖方式,主要存在于哺乳类动物中。雄性动物产生的精子与雌性动物产生的卵细胞两者结合到一起形成受精卵,然后受精卵发育成为新的个体。在精子与卵子融合的过程中,涉及到许多蛋白质分子之间的相互作用... 详细信息

有性生殖是自然界中非常重要的一种繁殖方式,主要存在于哺乳类动物中。雄性动物产生的精子与雌性动物产生的卵细胞两者结合到一起形成受精卵,然后受精卵发育成为新的个体。在精子与卵子融合的过程中,涉及到许多蛋白质分子之间的相互作用,特别是膜蛋白之间的相互识别,对于精卵融合有着十分重要的意义。迄今为止,尽管在精子和卵子之间已经鉴定出至少三对相互作用蛋白,但只有精子表面蛋白IZUMO1与卵子表面蛋白JUNO之间的相互作用是精卵融合所必需的。此外,还有一种精子表面蛋白对精卵融合有着重要影响,那就是crisp2—一种富含半胱氨酸的分泌蛋白,敲除crisp2基因会显著抑制精子与正常卵子融合的效率。crisp2蛋白本身就能与卵子表面结合,说明卵子上也有crisp2的受体,但位于卵子表面且能与crisp2结合的蛋白一直未被鉴定出来。本实验通过构建酵母双杂交诱饵重组载体p GBK-crisp2,从实验室保存的大鼠卵巢c DNA文库中筛选与crisp2相互作用的蛋白,以期找到能与crisp2结合的卵子蛋白。实验一共筛选到三个c DNA:creb3l1,tl0aea56yl02和chromosome20,其中只有creb3l1属于已知基因,剩余的两个结果并不属于完整的基因,只是一些RNA或者DNA片段。下一步即可验证CREB3L1蛋白是否位于卵子表面,能否与crisp2结合。为了鉴定crisp2蛋白与CREB3L1其在卵子表面上的受体共定位,本实验克隆了大鼠crisp2的c DNA,构建了p GEX-crisp2原核表达重组载体,在大肠杆菌BL21(DE3)中成功表达了crisp2-GST重组融合蛋白。以此重组蛋白免疫昆明白雌性小鼠,获得了小鼠抗大鼠crisp2-GST重组蛋白多克隆抗体,将利用该抗体检测CREB3L1卵子上的定位和与crisp2蛋白结合的细节。

关键词：原核表达 crisp2 酵母双杂交 cDNA文库

弱精子症患者精子中crisp2基因及其蛋白产物的初步研究

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弱精子症患者精子中CRISP2基因及其蛋白产物的初步研究

作者：景晓玮南方医科大学

学位级别：硕士

不孕不育是全世界关注的研究课题。目前,不孕不育的发病率有逐年上升的趋势。有统计研究表明在不孕不育中夫妇中由男方因素导致的已上升到了50%。而近来有研究显示,在因不孕不育而就诊的夫妇中,由于男性因素所导致的不育提高到了2/3。... 详细信息

不孕不育是全世界关注的研究课题。目前,不孕不育的发病率有逐年上升的趋势。有统计研究表明在不孕不育中夫妇中由男方因素导致的已上升到了50%。而近来有研究显示,在因不孕不育而就诊的夫妇中,由于男性因素所导致的不育提高到了2/3。对于由男性因素所导致的不育的临床研究表明,男性精子活力低下是其主要的因素之一,临床称之为弱精子症。临床导致弱精子症病因众多,其中包括感染、精液液化异常、免疫因素、内分泌因素、Kartagener's综合征、染色体异常、精索静脉曲张以及微量元素缺乏和不良生活习惯等因素。正是由于弱精症病因众多,发病机制尚不明确,所以临床无法采取有效的、针对性的治疗措施,其治疗效果也不令人满意,很多不孕不育夫妇最终只能选择人工辅助生殖。有研究发现,在一份正常的精液样本中,在低活力精子中一些基因的表达明显低于高活力精子。一些基因(如Tektin-2、DNAI1、DNAH5、DNAH11)也已被证实与弱精子症的发生有关。上述这些研究表明精子中某些基因mRNA的表达水平的差异是与弱精子症发生、发展是密切相关的。为了能更好的揭示这一现象,前期我们采用基因芯片技术对弱精子症基因表达谱进行了研究,并从中筛选获得部分弱精子症差异表达基因。按照基因表达上调或下调2倍以上并且两组样本t检验p265个弱精子症特异表达基因,其中307个基因在弱精子症组中表达上调,958个基因在弱精子症组中表达下调(Log2Ratio≤1或Log2Ratio≥1 P265个弱精子症特异表达基因,其中307个基因在弱精子症实验组中表达上调,958个基因在弱精子症实验组中表达下调)进行深入发掘,从中筛选出与弱精子症密切相关的弱精子症特异表达基因,并对其生物学功能以及与弱精子症发生、发展关系进行深入研究。方法：1.将前期基因芯片检测数据经GeneSpring10.0表达谱分析软件分析所得的1265个弱精子症特异表达基因,其中307个基因在弱精子症实验组中表达上调,958个基因在弱精子症实验组中表达下调(Log2Ratio≤或Log2Ratio≥1 P2.运用上述生物信息学软件对上述差异基因进行生物信息学分析挖掘,对其功能进行功能分析以及信号转导通路分析。结果：1.差异基因GATHER分析将弱精子症特异表达基因上传导入GATHER在线软件进行分析,软件共计可识别基因1205个。对差异基因进行GO分类分析发现,差异基因主要与细胞生理过程和物质新陈代谢有关,如G蛋白偶联的信号转导通路、细胞蛋白质／大分子物质新陈代谢有关;2.差异基因PANTHER分析将弱精子症特异表达基因导入PANTHER在线分析软件,共计有932个基因可被识别,通过软件分析结果发现,可被识别的差异基因pathway分析发现在整合素信号转导通路、白介素信号转导通路、过氧化应激反应、TGF-β信号转导通路以及凋亡信号转导通路是上调的,而在肾上腺素／去甲肾上腺素合成、5-羟色胺合成、bZIP转录因子转录调节、组胺合成通路是下调的。3. ToppGene分析分别将在弱精子症中上调表达差异基因307个、下调表达差异基因958个上传导入ToppGene进行在线功能分析。上调基因中共有234个可被识别,下调基因中共有663个可被识别。经过软件对差异基因参与生物学分析发现,在弱精子症中上调表达的差异基因主要与细胞免疫应答、抗原识别与呈递、细胞死亡、凋亡以及介导细胞程序化死亡有关。而下调表达基因则主要与蛋白水解、细胞蛋白质大分子物质代谢、修饰相关的蛋白质及大分子物质代谢、蛋白K48泛素化过程以及微管细胞骨架构成有关。结论：1.通过生物信息学挖掘发现弱精子症精子在活力下降的同时,精子的基本生命活动也下降,同时更易于发生凋亡、死亡。2.参与细胞骨架构成、微管运动、

关键词：精子 crisp2 弱精子症基因芯片生物信息学

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crisp2蛋白研究进展

国际生殖健康／计划生育杂志 2021年第4期40卷 323-327页

作者：姚宇童祁丛迪娜·叶尔努尔吴诗琪马婕刘强(审校) 上海交通大学医学院基础医学院 200025

crisps(cysteine rich secretory proteins)蛋白家族有4个成员,crisp2是唯一在睾丸中表达的crisps成员,组织特异性较高。精母细胞表达和分泌crisp2,不受雄激素的影响。crisp2分布于生精上皮内,定位于精母细胞和支持细胞间的连接处,可以... 详细信息

crisps(cysteine rich secretory proteins)蛋白家族有4个成员,crisp2是唯一在睾丸中表达的crisps成员,组织特异性较高。精母细胞表达和分泌crisp2,不受雄激素的影响。crisp2分布于生精上皮内,定位于精母细胞和支持细胞间的连接处,可以增强精母细胞连接到支持细胞上的能力;继而存在于圆形精子细胞及延长型精子细胞,可结合到精子尾部和头部顶体,并最终定位于精子尾部以及顶体。crisp2可能与精子顶体RyR3受体结合调节Ca^(2+)内流;此外,crisp2可能还具有调节RyR受体之外的其他离子通道(如抑制K^(+)通道)的功能。研究表明,crisp2参与了精子成熟和获能的全程,也在精卵结合的过程中起一定作用。综述crisp2蛋白在睾丸的表达和分布、调控以及作用。

关键词： crisp2 精卵结合精子卵子相互作用不育,男(雄)性弱精子症 TPX1