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作者：王静锦州医科大学

学位级别：硕士

目的血管钙化(Vascular calcification,VC)是指血管系统中以磷酸钙复合物形式存在的矿物质沉积。任何动脉壁钙化的存在都会使死亡率和心血管事件的风险增加3-4倍。据血管的病变部位分为内膜钙化和中膜钙化。作为心血管疾病独立的危险因... 详细信息

目的血管钙化(Vascular calcification,VC)是指血管系统中以磷酸钙复合物形式存在的矿物质沉积。任何动脉壁钙化的存在都会使死亡率和心血管事件的风险增加3-4倍。据血管的病变部位分为内膜钙化和中膜钙化。作为心血管疾病独立的危险因素,血管钙化是血管疾病的共同病理基础。血管钙化是一个以羟基磷灰石沉积为特征的活跃过程,是细胞内外复杂的信号通路改变的结果。越来越多的证据表明,血管平滑肌细胞向成骨样细胞分化并生成基质囊泡在血管钙化中起着不可或缺的作用。E1A激活基因阻遏子基因(cellular repressor of E1A stimulated genes,creg)是一种小分子糖蛋白(220个氨基酸),在细胞内主要定位于核周内质网和溶酶体。研究表明,creg参与调节细胞的生长和分化。本实验室前期系列研究证明,使用外源性creg重组蛋白以剂量依赖的方式抑制血管紧张素Ⅱ引起的的血管重塑。此外,creg在维持血管平滑肌细胞的成熟表型、抑制血管平滑肌细胞迁移和增殖方面起重要作用。基于上述研究结果,本研究提出假说,作为调控血管平滑肌细胞分化的重要蛋白,creg可能参与血管钙化的发生和发展。本研究从动物学和细胞学两方面入手,应用creg转基因小鼠及creg杂合子小鼠制备血管钙化模型,动物学水平验证creg在血管钙化中的作用;其次,应用小鼠原代血管平滑肌细胞,给予高浓度磷酸盐(Phosphate,pi,2.6 mmol/L)刺激,细胞学水平明确creg在血管钙化中的作用并初步探索其作用机制。本研究为深入阐明血管钙化的调控机制提供新的实验依据和理论线索,并且可能为血管钙化等相关心血管疾病的防治提供新的干预靶点。方法一、creg在血管钙化中的作用研究1.动物学水平明确creg表达变化与血管钙化的相关性选择8周龄的C57BL/6J小鼠,采用连续5天皮下注射维生素D3(VitD3,15万单位/kg/day)的方法建立小鼠血管钙化模型。注射VitD3 14天后,采用Von Kossa、Alizarin red staining评估血管钙化的严重程度。荧光定量PCR、western blot检测血管中钙化相关蛋白包括骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、runt相关转录因子2(runt related transcription factor 2,RUNX2)及creg的表达变化。2.动物学水平明确creg在血管钙化中的作用选择8周龄的creg转基因小鼠(creg)及creg杂合子(creg)小鼠,采用连续5天皮下注射VitD3(15万单位/kg/day)的方法建立血管钙化模型。14天后,采用Von Kossa、Alizarin red staining评估血管钙化的严重程度。荧光定量PCR、western blot检测血管中钙化指标OPN、RUNX2及creg表达变化。二、creg在血管钙化中的机制研究1.细胞培养本研究采用小鼠原代血管平滑肌细胞为对象,应用腺病毒感染和si RNA基因沉默方法分别建立creg过表达和低表达的血管平滑肌细胞模型,采用pi刺激诱导细胞钙化。Western blot及荧光定量PCR方法检测钙化指标OPN、RUNX2、分化指标α-平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)及creg的变化。2.离体血管环的制备麻醉处死8周龄雄性C57BL/6J小鼠、creg小鼠、creg小鼠后,取出其主动脉,把外膜剥离干净。剪成长度约4 mm的动脉环。给予pi刺激3后,Von Kossa、Alizarin red staining用来评估血管钙化的严重程度,离体水平明确creg过表达或低表达对血管钙化的影响。3.质谱筛选差异蛋白将creg小鼠及其对照组小鼠钙化的血管送蛋白质谱分析,筛选差异蛋白。构建该差异蛋白过表达的腺病毒以及低表达的小干扰RNA,将creg或差异蛋白分别在小鼠原代血管平滑肌细胞中过表达或低表达,荧光定量PCR或western blot方法检测creg或差异蛋白的表达,明确两者的上下游调控关系。4.细胞学挽救实验在creg过表达的基础上给予FHL的小干扰RNA,、western blot方法检测钙化指标OPN、RUNX2的表达。结果一、creg在血管钙化中的作用研究1.动物学水平明确creg表达变化与血管钙化的相关性Von Kossa、Alizarin red staining结果显示,用皮下注射VitD3的方法可成功建立小鼠血管钙化模型。免疫组化染色显示注射VitD3组钙化指标OPN、RUNX2表达明显增多,而creg表达明显下降。荧光定量PCR、western blot方法结果显示,注射VitD3组钙化指标OPN、RUNX2蛋白和转录水平均明显升高,同时伴有分化指标α-SMA的和creg的表达降低。上述结果提示,creg表达与血管钙化存在明显的负相关性。2.动物学水平

关键词： creg FHL2 血管钙化平滑肌细胞

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A novel function of creg in metabolic disorders

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Medical Review 2021年第1期1卷 18-22页

作者： Yang Li Xiaoxiang Tian Quanyu Zhang Chenghui Yan Yaling Han Cardiovascular Research Institute and Department of Cardiology General Hospital of Northern Theater CommandShenyang 110016LiaoningChina

Metabolic disorders are public health problems that require prevention and new efficient drugs for treatment.Cellular repressor of E1A-stimulated genes(creg)is ubiquitously expressed in mature tissues and cells in mammals and plays a critical role in keeping cells or tissues in a mature,homeostatic state.Recently,creg turns to be an important mediator in the development of metabolic disorders.Here in this review,we briefly discuss the structure and molecular regulation of creg along with the therapeutic strategy to combat the metabolic disorders.

关键词： creg insulin resistance metabolic disorders NAFLD obesity skeletal muscle energy metabolism.

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creg调控巨噬细胞极化的细胞学研究

CREG调控巨噬细胞极化的细胞学研究

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作者：吴鹏锦州医科大学

学位级别：硕士

目的动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是动脉血管脂质沉积和免疫炎症交互作用所致的慢性增生性血管重构过程。AS发病机制十分复杂,研究人员先后提出脂质浸润、内皮损伤等多种学说,但均不能全面解释AS的形成机制。1999年,Ross等提“AS... 详细信息

目的动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)是动脉血管脂质沉积和免疫炎症交互作用所致的慢性增生性血管重构过程。AS发病机制十分复杂,研究人员先后提出脂质浸润、内皮损伤等多种学说,但均不能全面解释AS的形成机制。1999年,Ross等提“AS是单核巨噬细胞与入侵动脉壁的病原性脂蛋白相互作用导致的慢性炎症反应过程”,这一观点得到广泛认可,为AS发生机制研究提供了新的方向。巨噬细胞是参与炎症反应最重要的免疫细胞之一,可在多种炎症介质的刺激下募集到损伤的靶血管处,进而通过分泌大量的炎症因子、吞噬氧化修饰的低密度脂蛋白及细胞碎片影响AS的发生、进展及消退。目前研究证实,巨噬细胞在不同微环境下,可以极化成为促炎的M1亚型和抑炎的M2亚型。巨噬细胞向M1极化增多、向M2极化减少被认为是AS发生发展的病理基础之一。但是,调控巨噬细胞极化的关键分子仍未阐明。E1A激活基因阻遏子基因(cellular repressor of E1A stimulated genes,creg)是一种小分子(220个氨基酸)糖蛋白,在细胞内主要定位于核周内质网和溶酶体。creg在分化成熟的组织中广泛表达,能促进心肌细胞、血管平滑肌细胞及内皮细胞等多种细胞的分化,被认为是一种重要的细胞分化稳态调节因子。此外,本实验室的前期研究发现,creg能对抗AS的发生发展并抑制巨噬细胞的炎症反应,但其机制尚不清楚。基于以上线索,本研究提出假说,即creg可能是调控巨噬细胞极化的关键因子。为检验该假说,本研究拟采用单核巨噬细胞系,在体外建立巨噬细胞极化模型,明确creg在巨噬细胞极化中的作用,并初步探讨其机制。本研究的实施将为巨噬细胞新的极化调控机制提供实验依据和理论线索,并可能为AS的防治提供新的干预靶点。方法(1)在体外培养小鼠单核巨噬细胞系RAW264.7,用脂多糖(lipopolysaccharide,LPS,100ng/ml)+伽马干扰素(interferon-γ,IFN-γ,20ng/ml)诱导其向经典活化型(M1)极化,用白细胞介素4(interleukine-4,IL-4,20ng/ml)诱导其向替代活化型(M2)极化,建立巨噬细胞极化模型。以未诱导细胞作为对照组。通过流式细胞术、ELISA、蛋白印迹法(Western blot)及定量PCR方法,检测M1型及M2型巨噬细胞比例及标志物表达,验证巨噬细胞极化模型是否建立成功。进一步通过Western blot、定量PCR及免疫荧光染色检测M1型及M2型巨噬细胞标记物、creg及溶酶体标志物表达[包括溶酶体相关膜蛋白1(lysosomal associated membrane protein 1,LAMP-1)、溶酶体相关膜蛋白2(lysosomal associated membrane protein 2,LAMP-2)及溶酶体整合膜蛋白2(lysosome integral membrane protein 2,LIMP-2)],明确creg表达水平与巨噬细胞极化及溶酶体标志物的相关关系。(2)应用腺病毒感染和siRNA基因沉默方法分别建立creg低表达和过表达巨噬细胞模型,应用流式细胞术检测M1型和M2型巨噬细胞比例,Western blot方法检测M1型、M2型巨噬细胞标记物表达及溶酶体标志物表达,明确creg与巨噬细胞极化的因果关系。(3)在过表达creg蛋白的RAW264.7细胞中,应用siRNA技术建立LAMP-1低表达的巨噬细胞模型,应用流式细胞术检测M1型和M2型巨噬细胞比例,Western blot方法检测M1和M2型巨噬细胞标志物、creg蛋白及溶酶体标志物表达,明确creg是否通过影响溶酶体途径调控巨噬细胞极化。结果(1)流式细胞术检测结果显示,与未诱导对照组相比,LPS+IFN-γ诱导巨噬细胞向M1型极化后,PE-F4/80、FITC-CD16/32双阳性标记的M1型巨噬细胞比例达(83.18±3.07)%;IL-4诱导巨噬细胞向M2极化后,PE-F4/80、FITC-CD206双阳性标记的M2型巨噬细胞比例达(42.79±2.70)%。Western blot和ELISA结果发现,M1型巨噬细胞中高表达iNOS蛋白并大量分泌促炎症因子MCP-1、TNF-α;而M2型巨噬细胞中高表达CD206蛋白并大量分泌抑炎因子IL-10、TGF-β1。以上结果表明,我们成功建立了巨噬细胞极化模型。此外,定量PCR及Western blot结果显示,与对照组相比,creg和溶酶体标志物(LAMP-1、LAMP-2及LIMP-2)的转录及蛋白水平表达在M1型极化组中降低,而在M2型极化组中增加,提示creg及溶酶体水平与巨噬细胞极化存在正相关关系。(2)Western blot结果发现,腺病毒感染巨噬细胞后creg表达明显增加,而siRNA转染巨噬细胞后creg表达显著降低,表明我们

关键词： creg 巨噬细胞极化溶酶体动脉粥样硬化

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creg对大鼠脑出血神经细胞凋亡的作用及机制研究

CREG对大鼠脑出血神经细胞凋亡的作用及机制研究

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作者：庞超大连医科大学

学位级别：硕士

目的:脑出血（intracerebral hemorrhage,ICH）是一种常见的神经系统疾病,其死亡率较高,大约有半数病人于发病数日内死亡,幸存者中多留有不同程度的后遗症,对病人的生存质量产生了巨大影响。随着治疗方法的进步,对ICH的处理已经不仅仅... 详细信息

目的:脑出血（intracerebral hemorrhage,ICH）是一种常见的神经系统疾病,其死亡率较高,大约有半数病人于发病数日内死亡,幸存者中多留有不同程度的后遗症,对病人的生存质量产生了巨大影响。随着治疗方法的进步,对ICH的处理已经不仅仅局限在手术清除血肿、挽救生命方面;如何减少神经细胞的凋亡,减轻ICH对脑组织的损伤,降低脑出血患者致死及病残率,提高治愈率是当前脑血管疾病防治的重要研究课题之一。ICH后的继发性脑损伤（主要是神经细胞的损害）的机制是多方面的,其中在脑出血后神经损伤的发展中起着重要作用的有:基质金属蛋白酶2、炎症细胞因子、微管相关蛋白-2、血管内皮细胞生长因子以及补体系统,若能找到一种调控因子作用于神经细胞,能够减少ICH的致残率（减少神经细胞的凋亡）,将会对ICH病人预后生活质量的改善有着极大的帮助。E1A激活基因阻遏子（creg）是新近被发现的一个细胞转录调控基因。在人单核细胞、人造血祖细胞和体外培养的人VSMCs、小鼠ES细胞等多种细胞中creg蛋白可广泛表达并促进细胞成熟分化。为进一步观察creg对ICH血肿周围神经细胞的影响,本研究以大鼠脑出血模型为研究对象,应用外源性creg蛋白,治疗ICH造成的脑组织损伤,减少神经细胞凋亡,保护脑组织,促进神经系统功能恢复。方法: 1.建立大鼠脑出血模型:大鼠称体质量后用10%水合氯醛（0.035mL/kg）腹腔注射麻醉,固定于脑立体定位仪上,按照大鼠脑立体定位图谱进行定位:采用自体血脑内注入法建立大鼠脑出血模型。 2.入选实验的动物随机分为正常组、模型组、creg治疗组与假手术组,每组分为1、3、5d三个时间点,分为3个亚组,每个亚组n=5,每组15只。正常组和模型组不作任何干预;creg治疗组按15μg/kg剂量脑内注射,1次/d;假手术组按相同剂量在相同时间点给予生理盐水,1次/d。各组动物饲养环境、条件均相同:分笼普通饲养,自由饮水摄食,室温23℃,湿度50%-60%。用Bederson评分法观察各组大鼠行为学评分变化。 3.术后相应时间点处死大鼠,脑组织的取材:免疫组织化学染色creg和VEGF或Western blot分析VEGF和cleaved caspase-3的表达;RT-PCR测定Bcl-2 mRNA和Bax mRNA的表达;TUNEL染色和Annexin V/PI双染色检测细胞凋亡情况。结果: 1.Bederson法评分≥3分的大鼠作为合格脑出血模型入选本实验;2.经过creg治疗后,免疫组化结果显示VEGF在细胞上的定位和creg呈正相关,伴随着creg表达的增多而增多;Western blot结果显示VEGF表达增多,cleaved caspase-3表达减少;RT-PCR测定发现Bcl-2与Bax比率下降;经TUNEL染色和Annexin V/PI检测发现神经细胞凋亡数目减少;而脑出血组和假手术组则各项检查结果均与creg治疗组各项结果相反。结论:creg能够减轻大鼠脑出血模型血肿灶周围神经细胞的凋亡,可以减少脑损伤。

关键词：大鼠出血模型 creg 神经细胞

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creg基因调控人动脉内皮细胞迁移和增殖的作用及其机制研究

CREG基因调控人动脉内皮细胞迁移和增殖的作用及其机制研究

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作者：陶杰第四军医大学

学位级别：硕士

目的经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后支架内再狭窄(ISR)以及支架内迟发性血栓形成是心血管介入界尚未攻克的难题,内皮细胞(ECs)的损伤及功能障碍是ISR的始动因素和迟发性血栓形成的重要原因,促进ECs的修复成为防治ISR和迟发性血栓的一个... 详细信息

目的经皮冠状动脉介入治疗(PCI)术后支架内再狭窄(ISR)以及支架内迟发性血栓形成是心血管介入界尚未攻克的难题,内皮细胞(ECs)的损伤及功能障碍是ISR的始动因素和迟发性血栓形成的重要原因,促进ECs的修复成为防治ISR和迟发性血栓的一个热点。E1A激活基因阻遏子(creg)是新近发现的一个细胞转录调控基因,其在分化成熟的组织、细胞中广泛表达,而在去分化的组织中低表达。已有研究表明creg可促进体外培养的人血管平滑肌细胞(VSMCs)分化成熟,抑制其增殖、凋亡,说明creg对VSMCs的稳态起着调控作用,具有对抗ISR发生的潜在价值。而creg对动脉ECs的生物学效应尚未见报道。本研究以体外培养的人动脉ECs为研究对象,应用逆转录病毒载体介导creg在动脉ECs中过表达及表达下调,观察creg表达在动脉ECs迁移、增殖中的作用,并初步探讨其作用机制。方法(1)用脂质体转染法将重组人creg逆转录病毒表达载体pLNCX-creg、creg干扰RNA逆转录病毒表达载体pLNCX-shRNA-creg及带绿色荧光蛋白(GFP)的空载体pLNCX-GFP转染phoenix 293细胞,包装出完整的逆转录病毒后,感染动脉ECs,分别经G418和嘌呤霉素筛选,挑取单细胞克隆培养,获得稳定感染的细胞克隆。将细胞分为4组进行实验:正常组、GFP转染对照组、creg过表达组和creg表达下调组。(2)RT-PCR检测抗性基因表达;Western blot检测感染前后动脉ECs中creg蛋白表达。(3)刮伤试验、Transwell迁移模型观察感染前后动脉ECs迁移的变化,明胶酶谱分析检测明胶酶活性改变。(4)细胞计数、流式细胞分析检测感染前后ECs的增殖改变。(5)Western blot检测信号通路蛋白PI3K、p-Akt、p-JNK、p-ERK、p-p38的表达以及与ECs迁移、增殖和creg蛋白调控相关的尿激酶型纤溶酶原激活剂(u-PA)、内皮细胞型一氧化氮合成酶(eNOS)、血管内皮生长因子(VEGF)的表达;ELISA检测培养上清中VEGF、胰岛素样生长因子Ⅱ(IGFII)的分泌。(6)在各组细胞中分别添加LY 294002、SP 600125、PD 98059和SB 203580以抑制P13K-Akt、JNK-MAPK、ERK-MAPK和p38-MAPK信号通路,应用Transwell迁移模型观察各组细胞迁移的改变;在各组细胞中添加上述信号通路阻断剂,流式细胞分析检测各组细胞增殖的改变。(7)在过表达creg的ECs中添加重组人IGFII(rhIGFII)、重组人IGFII受体(rhIGF2R)和anti-IGF2R中和抗体;在creg表达下调组细胞中添加重组人VEGF(同时添加或不添加VEGF中和抗体),应用Transwell迁移模型观察不同处理组细胞迁移的变化,探讨IGFII、VEGF在creg调控动脉ECs迁移中的作用。结果(1)将重组逆转录病毒表达载体pLNCX-GFP、pLNCX-creg及pLXSN-shRNA-creg用脂质体法分别感染phoenix 293细胞,包装生产病毒,感染人动脉ECs,经过G418及嘌呤霉素筛选、挑取单克隆,分别得到表达GFP、creg过表达及表达下调的动脉ECs克隆。(2)感染细胞的分别表达G418或嘌呤霉素抗性基因;Western blot结果显示,与正常ECs及GFP感染组ECs比较,pLNCX-creg逆转录病毒感染组ECs中creg蛋白表达上调;而感染pLNCX-shRNA-creg逆转录病毒的ECs中creg蛋白表达明显下调。(3)creg过表达促进ECs迁移。a.刮伤实验及Transwell迁移模型提示:与GFP对照组和未感染细胞相比,creg过表达促进动脉ECs迁移,而creg表达下调抑制动脉ECs迁移;b.明胶酶谱分析提示:与对照组相比,creg表达下调组明胶酶明显减低;而creg过表达组与对照组相比呈增加趋势,但无明显差异。(4)细胞计数及流式细胞分析结果表明:creg过表达的动脉ECs增殖能力增强,而creg表达下调组增殖能力减弱。(5)a.Western blot结果显示:与对照组相比,PI3K/Akt信号转导蛋白表达在creg过表达组增加,而在creg表达下调组减少;MAPK信号转导通路中p-ERK、p-JNK、p-p38均无明显变化。b.Western blot结果提示:与对照组相比,u-PA、eNOS和VEGF在creg过表达组ECs中表达增加,在creg表达下调组表达减低。c.ELISA结果提示:creg过表达ECs培养液中VEGF分泌增多,IGFII分泌减少,而creg表达下调组VEGF分泌减少,IGFII分泌增多。(6)a.Transwell迁移模型的信号通路阻断研究结果提示:creg过表达通过PI3K/Akt信号转导通路促进动脉ECs迁移;b.

关键词： creg 内皮细胞细胞迁移细胞增殖

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creg调控高糖高脂诱导大鼠心肌细胞凋亡的作用及机制研究

CREG调控高糖高脂诱导大鼠心肌细胞凋亡的作用及机制研究

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作者：齐艳萍锦州医科大学

学位级别：硕士

目的糖尿病是一种以慢性血糖升高为特征的代谢性疾病,主要分为1型和2型,其中2型糖尿病尤为常见。糖尿病在全球呈广泛流行趋势,中华医学会糖尿病学分会的糖尿病流行病学调查结果显示,2017年我国2型糖尿病患者已超过1亿,位居世界首位。其... 详细信息

目的糖尿病是一种以慢性血糖升高为特征的代谢性疾病,主要分为1型和2型,其中2型糖尿病尤为常见。糖尿病在全球呈广泛流行趋势,中华医学会糖尿病学分会的糖尿病流行病学调查结果显示,2017年我国2型糖尿病患者已超过1亿,位居世界首位。其中,30岁以上人群中,2型糖尿病患病率达11.6%。每年有490万人死于糖尿病,其中约50%人死于心血管并发症。糖尿病患者中,不依赖于动脉粥样硬化、高血压及其他潜在病理因素发生的左心室功能障碍性疾病称为糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy,DCM)。研究报道认为,2型糖尿病患者中,DCM的发病机制主要是心肌细胞自噬功能障碍,而持续高糖及高脂环境是引起心肌细胞自噬功能障碍的主要因素。发生2型糖尿病时,心肌细胞在高糖和高脂环境下,发生胰岛素抵抗,心肌细胞的能量代谢平衡被打破,细胞内蛋白质和脂质氧化增强,引起细胞自噬功能障碍,使受损细胞器及有害的代谢产物无法清除,因而导致心肌细胞死亡,发生DCM。虽然已经明确凋亡在DCM发生中的作用,但调控凋亡的具体机制尚未明确。因此,明确DCM中潜在的凋亡调控机制已成为亟待解决的医学问题。E1A激活基因阻遏子基因(cellular repressor of E1A stimulated genes,creg)是小分子糖蛋白,是重要的心肌保护因子,可通过多种途径参与心肌保护作用。本实验室近年研究发现:(1)creg蛋白在心肌组织中高表达;(2)心肌梗死、血管紧张素Ⅱ或缺血再灌注等病理性损伤可使心肌细胞中的creg表达显著下调,而补充外源性creg蛋白则可挽救上述病理因素引起的心肌损伤;(3)更为重要的是,研究还证实creg是定位于溶酶体的糖蛋白,可通过调控溶酶体的发生和功能从而影响心肌成纤维细胞自噬功能。基于上述研究结果,我们假设creg作为心肌细胞自噬稳态的内源性关键调控基因,可能参与了DCM发生。然而creg在DCM中参与凋亡调控的具体机制尚未明确。因此,本研究的主要目的是从细胞学角度入手,明确creg调控高糖高脂刺激下心肌细胞凋亡的作用及可能机制。方法(1)采用不同浓度棕榈酸(0.2mM、0.4mM、0.6mM、0.8mM),及不同浓度高糖(10mM、15mM、25mM、33mM)刺激大鼠H9C2心肌细胞,western-blot检测creg蛋白表达水平,确定高糖高脂的最佳刺激浓度。同时,在高糖高脂刺激的不同时间点(12h、24h、36h、48h),检测creg蛋白表达变化,确定高糖高脂的最佳作用时间。(2)为明确高糖高脂作用下creg与心肌细胞自噬的相关性,构建creg过表达及creg低表达的H9C2心肌细胞模型,并采用高糖高脂刺激24h。Western-blot检测自噬体蛋白(autophagy marker light chain 3BⅡ,LC3BⅡ)、自噬底物蛋白P62、溶酶体相关膜蛋白1(lysosome-associated membrane protein 1,LAMP1)、凋亡蛋白cleaved-caspase3表达;免疫荧光染色检测溶酶体酶casthepsinB和casthepsinD表达;流式细胞术检测心肌细胞凋亡比例。(3)为明确creg是否通过调控自噬影响心肌细胞凋亡,分别采用自噬抑制剂氯喹(10mM)及自噬激动剂白藜芦醇(10mM)对creg过表达H9C2心肌细胞及creg低表达H9C2心肌细胞进行干预24h,再给予高糖高脂刺激24h。采用western-blot、免疫荧光染色以及流式细胞术分别检测creg蛋白、LC3BⅡ、P62、LAMP1、cathepsinB、cathepsinD及Cleaved-caspase3表达变化。结果(1)采用不同浓度棕榈酸及高糖刺激H9C2心肌细胞,western-blot结果发现高糖浓度为33mM和棕榈酸浓度为0.4mM条件下,creg蛋白表达明显减少。因此,确定高糖和棕榈酸的最佳刺激浓度分别为33mM和0.4mM。此外,在高糖高脂刺激24h后,creg蛋白显著降低,并随刺激时间延长,creg表达逐渐下降。(2)H9C2心肌细胞在高糖(33mM)和高脂(0.4mM)刺激24h后,western-blot检测发现creg蛋白表达降低,LC3BⅡ和P62表达增多,LAMP1表达减少,凋亡蛋白cleaved-caspase3增加。免疫荧光检测显示溶酶体酶cathepsinB和cathepsinD减少。同时,流式细胞术发现心肌细胞凋亡明显增加。以上结果提示:在高糖高脂刺激下,H9C2心肌细胞中creg蛋白表达减少,溶酶体数量及功能异常,自噬功能障碍,细胞凋亡增多。(3)为进一步明确creg在高糖高脂刺激下对心肌细胞自噬的作用,采用腺病毒creg及creg siRNA分别构建creg过表达(Ad-creg)及creg低表达(creg-siRNA)的H9C2心肌细胞。Western-bl

关键词： creg 糖尿病糖尿病性心肌病高糖高脂自噬溶酶体凋亡

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creg对人动脉内皮细胞单层通透性的影响及调控机制的研究

CREG对人动脉内皮细胞单层通透性的影响及调控机制的研究

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作者：王占胜大连医科大学

学位级别：硕士

目的：血管生成方法的探索给治疗缺血性心脏病带来了突破性进展,其目的是通过增加有功能冠状动脉分支或侧枝循环,达到恢复缺血心肌血供,改善患者症状和预后的目的。而血管通透性增加是血管生成序列事件的一个环节。细胞因子和炎症介质... 详细信息

目的：血管生成方法的探索给治疗缺血性心脏病带来了突破性进展,其目的是通过增加有功能冠状动脉分支或侧枝循环,达到恢复缺血心肌血供,改善患者症状和预后的目的。而血管通透性增加是血管生成序列事件的一个环节。细胞因子和炎症介质大多数是通过改变内皮细胞(ECs)肌动蛋白骨架,使ECs收缩或回缩,细胞间隙增大,导致细胞单层通透性增高;并可破坏血管ECs间粘附连接蛋白VE-cadherin,引起ECs间隙形成,通透性增加。E1A激活基因阻遏子(creg)是新近发现的一个细胞转录调控因子,其在分化成熟的组织、细胞中广泛表达,而在去分化的组织中低表达。已有研究表明creg可促进体外培养的人血管平滑肌细胞(VSMCs)分化成熟,抑制其增殖、凋亡,并可促进动脉ECs的增殖与迁移,提示creg对血管的稳态起着调控作用,然而creg对ECs通透性有何影响尚未见报道。本研究以体外培养的人动脉ECs为研究对象,应用逆转录病毒载体介导creg在动脉ECs中过表达及表达下调,观察creg表达对动脉ECs单层通透性的影响,并探讨creg调节血管ECs通透性的机制。方法： 1.采用Transwell chamber弥散模型,分别检测creg过表达(Overexpression, EO)、表达下调(Suppression, ES)及正常表达(Normal,EN)的人动脉ECs单层通透性的改变。用酶联免疫吸附实验(ELISA)检测ECs的VEGF分泌并添加VEGF中和抗体处理,观察对ECs单层通透性的影响。 2.利用异硫氰酸盐标记的鬼笔碱对EO、EN及ES的肌动蛋白骨架F-actin进行染色,在荧光倒置显微镜下观察ECs肌动蛋白骨架F-actin分布变化及加入VEGF中和抗体后对ECs肌动蛋白骨架F-actin重排的影响。 3.应用免疫荧光染色的方法,在荧光倒置显微镜下观察培养融合至单层的EO、EN及ES三组ECs粘附连接蛋白VE-cadherin及紧密连接蛋白claudin-5表达的变化以及加入VEGF中和抗体处理后对ECs粘附连接蛋白VE-cadherin及紧密连接蛋白claudin-5表达变化的影响。结果： 1.creg过表达的EO组细胞单层通透性明显增加(0.0490±0.0016),与EN对照组(0.0376±0.0061)比较差异显著(pcreg表达下调的ES组单层通透性下降(0.0324±0.0114),与EN对照组0.0376±0.0061)比较差异显著(pcreg过表达的EO组细胞中VEGF分泌量最高(1392.00±5.83)pg/ml,而creg表达下调的ES组细胞中VEGF分泌量最低(391.40±4.04)pg/ml,三者(EO组、EN组、ES组)均有显著差异(pcreg过表达可能通过VEGF介导的信号途径引起体外培养的人动脉ECs骨架蛋白F-actin重构及粘附连接蛋白VE-cadherin、紧密连接蛋白claudin-5表达减少,使血管ECs单层通透性增加。

关键词： creg 血管内皮细胞细胞骨架 VE-cadherin claudin-5 VEGF 内皮通透性

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creg对小鼠胚胎干细胞血管发生的调控作用及机制研究

CREG对小鼠胚胎干细胞血管发生的调控作用及机制研究

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作者：张娜大连医科大学

学位级别：硕士

目的:治疗冠心病在终末期可以采用细胞替代性血管新生,此种方法已经受到的广泛关注。其治疗原理就是希望使缺血区的小血管再生增多以及侧枝循环形成以得到充分的血液供应。然而,目前的血管发育研究对参与血管发生的细胞因子、受体以及... 详细信息

目的:治疗冠心病在终末期可以采用细胞替代性血管新生,此种方法已经受到的广泛关注。其治疗原理就是希望使缺血区的小血管再生增多以及侧枝循环形成以得到充分的血液供应。然而,目前的血管发育研究对参与血管发生的细胞因子、受体以及相关的信号转导分子的了解还十分局限,参与血管发生的重要调控因子仍有待实验研究来发现。胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)是可以在体外正常培养条件下进行了无限性的传代增殖的多能性细胞系。ESC可以自发形成具有内、中、外三胚层结构的胚胎小体(embryoid bodies,EBs)在培养条件适合的情况下,并能分化形成卵黄囊样血管网结构以模拟体内早期胚胎血管发生过程,可以说,ESC是研究早期血管发育的最经典的模型。E1A激活基因阻遏子(cellular repressor of E1A- stimulated genes,creg)是一种新的转录调控相关因子。它可以抑制细胞增殖,促进细胞分化。我室前期研究发现,creg不仅可以作为维持成熟血管平滑肌细胞(smooth muscle cells,SMCs)分化表型的重要调控分子之一。还可以在胚胎发育早期的单层血管内皮细胞(endothelium cells,EC)中表达,并一直持续至血管成熟。上述研究提示:creg是参与细胞分化外和调控胚胎早期血管发生的重要调控因子。为阐明creg在胚胎早期血管发生中表达的意义,本研究以体外培养的小鼠ESC-R1为对象,逆转录病毒为载体,制备creg基因过表达和表达沉默的ESC,观察creg表达对ESC分化及血管发生的影响。方法: 1 .应用pCXN2-FLAG-creg-IRES-EGFP、pDS-shRNA-creg和pDS- shRNA-GFP逆转录病毒真核表达载体,感染小鼠ESC-R1,筛选获得稳定的ESC克隆(分别命名为R1-wtcreg、R1-shcreg和R1-GFP);用小鼠胚胎成纤维细胞株(STO)作为饲养细胞,进行R1、R1-wtcreg、R1-GFP和R1-shcreg培养,倒置显微镜观察四种ESC的生长情况。 2.当ESC生长至亚融合状态时,去除LIF悬浮培养制备EBs。倒置相差显微镜下观察不同发育时间点,R1/EBs、R1-wtcreg/EBs和R1-shcreg/EBs的分化情况。 3.收集悬浮培养5.5天的R1/EBs和R1-wtcreg/EBs,制备冰冻切片。免疫荧光染色观察内胚层标志物甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)和基底膜标志物层粘连蛋白(Laminin,LN)分化情况。 4.选取悬浮培养3天且形态发育良好的R1/EBs和R1-wtcreg/EBs,移植入Matrix胶中继续培养7天后,DiI-Ac-LDL染色观察ECs的分化情况。 5.Western-blot方法检测R1/EBs、R1-wtcreg/EBs和R1-shcreg /EBs中creg、VEGF及Flk-1的蛋白表达;向R1-shcreg /EBs培养基中添加10μl/mL的重组creg蛋白或者向R1-wtcreg/EBs培养基中添加15 ng/mL antiVEGF后,观察细胞的分化情况和VEGF和Flk-1蛋白的表达变化。 6 .定量RT-PCR和Western-blot分别检测R1/EBs、R1-GFP/EBs和R1-shcreg/EBs中creg表达;应用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)染色和小鼠心肌荷瘤实验检测pDS-shRNA-creg感染后ESC的干性和全能分化能力是否发生改变。 7 . Annexin V/PI流式细胞分析方法检测R1/EBs、R1-GFP/EBs和R1-shcreg/EBs凋亡情况;定量RT-PCR和Western-blot分别检测上述三组EBs细胞中cleaved caspase-3 mRNA和蛋白的表达。结果: 1.经pCXN2-FLAG-creg-IRES-EGFP、pDS-shRNA-creg和pDS- shRNA-GFP逆转录病毒真核表达载体感染后,R1、R1-wtcreg和R1-shcreg的细胞进行EBs培养,行Western Blot检测证明筛选成功(实验室已证实)。各感染组干细胞在体外培养条件下生长良好。 2.倒置相差显微镜观察发现,悬浮培养的R1-wtcreg/EBs较R1/EBs更易分化。悬浮培养7天后,大部分R1-wtcreg/EBs已发育成卵黄囊血管网结构,正常小鼠R1/EBs要悬浮培养124天才可发育形成卵黄囊血管网结构,而R1-shcreg/EBs生长缓慢、未见胚层分化现象、细胞培养基中代谢废物和细胞碎片较多。 3.收集悬浮培养第5.5天的各组EBs,制备冰冻切片行免疫荧光染色观察发现,R1-wtcreg/EBs形成的LN及AFP较R1/EBs完整、界限清晰,而R1-shcreg /EBs组染色未

关键词： creg 胚胎干细胞血管发生分化内皮细胞

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OX-LDL增加DNA甲基化水平抑制人creg基因表达的细胞学研究

OX-LDL增加DNA甲基化水平抑制人CREG基因表达的细胞学研究

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作者：刘姗锦州医科大学

学位级别：硕士

目的动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种常见的血管病变,其特点是动脉血管壁炎症的发生和脂质斑块的形成。目前认为,AS是血脂、血糖和炎症等危险因素与遗传易感基因相互作用的结果。随着遗传学研究手段的发展,传统的基因调控模式... 详细信息

目的动脉粥样硬化(Atherosclerosis,AS)是一种常见的血管病变,其特点是动脉血管壁炎症的发生和脂质斑块的形成。目前认为,AS是血脂、血糖和炎症等危险因素与遗传易感基因相互作用的结果。随着遗传学研究手段的发展,传统的基因调控模式已经很难完全解释心血管疾病和环境变量之间的互作关系。心血管疾病中的表观遗传调控作用越来越受到关注。表观遗传学指在不改变核苷酸序列的情况下,调节基因转录。表观遗传调控是基因与环境相互作用的桥梁,DNA甲基化是目前研究最明确也是最广泛的表观遗传标记。近年研究证实,全基因组DNA甲基化程度与AS发生密切相关。局部DNA高甲基化调控通过改变AS调控相关基因表达参与了AS发生及演进,但具体的作用靶点和作用机制仍然不十分清楚。E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated genes,creg)是转录相关调控因子,是从子宫颈内膜癌Hela细胞cDNA文库中克隆出来。本实验室前期研究发现,creg是重要的组织和细胞分化稳态调控因子。creg在人正常血管内皮细胞中高表达,而creg在AS血管内皮细胞中的转录和翻译水平表达均显著降低。我们进一步研究证实,过表达creg基因能够对抗AS发生,但其下调的分子机制一直未阐明。我们应用生物信息学软件分析发现,人creg基因的第一外显子区存在大量的CpG岛,提示DNA甲基化可能参与AS血管内皮细胞中creg基因表达的调控。基于以上研究结果,我们提出科学假说,creg基因通过调控DNA甲基化参与AS的发生。因此,本研究以DNA甲基化调控为切入点,探讨在AS独立危险因素氧化型低密度脂蛋白(Oxidized low density lipoprotein,OX-LDL)刺激下,creg在人原代脐静脉内皮细胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中表达下调的甲基化调控机制,并为AS的防治提供新的理论基础和治疗靶点。方法(1)采用OX-LDL和DNA甲基转移酶抑制剂(5-Aza-2’-deoxycytidine,5-Aza-CdR)分别作用于原代培养的HUVEC,通过Western blot和定量PCR检测creg、甲基转移酶(DNA methyltransferases,DNMTs)的表达。初步确定人creg基因表达与甲基化的相关性。(2)通过生物信息学软件预测分析明确人creg基因启动子区的CpG岛的位置;通过构建creg启动子区荧光素酶报告基因载体并进行基因表达活性检测分析,明确CpG岛对creg基因表达的调控作用及具体调控区域。(3)应用OX-LDL增加原代培养HUVEC细胞甲基化水平,应用5-Aza-CdR抑制原代HUVEC甲基化表达后,提取HUVEC基因组DNA,进行焦磷酸测序,以明确creg基因启动子区关键CpG岛甲基化位点。进一步通过构建含creg基因关键CpG岛甲基化突变位点的荧光素酶报告基因载体和荧光素酶活性检测,明确具体的甲基化位点对creg基因表达的调控作用。结果(1)应用不同浓度的OX-LDL(50μg/mL和100μg/mL)作用原代HUVEC,Western blot和定量PCR检测creg和DNMTs的表达。结果显示:随着OX-LDL浓度的增加,DNMT1、DNMT3a和DNMT3b在RNA和蛋白水平表达均显著增加,creg表达减少。将不同浓度的5-Aza-CdR(10μM、50μM和100μM)作用原代HUVEC细胞抑制DNMT1、DNMT3a、DNMT3b表达后,creg转录及表达显著增加。以上结果提示:人creg基因转录表达与HUVEC甲基化水平负性相关。(2)通过生物信息学软件预测发现,人creg基因的第一外显子区存在明显的CpG岛(-48/+588)。进一步应用含有不同启动子片段的荧光素酶报告基因载体活性检测证实,CpG岛对creg表达呈负性转录调控作用,其中+79/+255为关键负性转录调控区。(3)分别应用OX-LDL(50μg/mL和100μg/mL)和5-Aza-CdR(10μM、50μM和100μM)作用于原代HUVEC后,行creg启动子+79/+255区域的焦磷酸测序。结果发现,经过OX-LDL处理后,creg基因关键CpG岛甲基化水平较对照组增加,而经过5-Aza-CdR处理后,creg基因关键CpG岛甲基化水平较对照组减少。以上结果表明,OX-LDL促进creg基因启动子区CpG岛(+201/+255)片段的甲基化水平增高。随后,分别构建+201/+255片段中8个CG位点突变的荧光素酶报告基因载体并行荧光素酶活性检测分析。结果证实,creg基因启动子区的关键甲基化调控位点为+201/+202。综上所述,creg基因启动子区甲基化变化影响creg基因的表达,关键的甲基化调控位点为+201/+202。结论在OX-L

关键词： creg AS DNA甲基化内皮细胞氧化型低密度脂蛋白

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慢病毒介导的E1A激活基因阻遏子（creg）基因对661W细胞光损伤抗凋亡能力影响的实验研究

慢病毒介导的E1A激活基因阻遏子（CREG）基因对661W细胞光损伤抗...

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作者：谢飞内蒙古民族大学

学位级别：硕士

目的:将慢病毒介导的creg基因转染至661W细胞,通过观察过表达creg基因修饰的661W细胞在光损伤条件下的抗凋亡能力,评价creg基因对光感受器细胞光损伤时的保护作用,探讨其作用机制。方法:1、培养细胞,对661W细胞株和293T细胞株进行复苏... 详细信息

目的:将慢病毒介导的creg基因转染至661W细胞,通过观察过表达creg基因修饰的661W细胞在光损伤条件下的抗凋亡能力,评价creg基因对光感受器细胞光损伤时的保护作用,探讨其作用机制。方法:1、培养细胞,对661W细胞株和293T细胞株进行复苏后传代培养、冻存并计数。2、构建慢病毒介导的creg基因表达载体。3、转染661W细胞,Western blot验证慢病毒介导的creg基因转染661W细胞的表达;获得慢病毒介导creg基因稳定转染的661W细胞和GFP空载体对照661W细胞。4、制备661W细胞和661W细胞光损伤模型并将正常的661W细胞(661W)设为正常空白组。5、Hoechst/PI染色法检测各组细胞形态学的改变情况,观察各组细胞形态学上的差异;BCA法测定各组细胞蛋白浓度,蛋白质免疫印迹法检测各组细胞中不同凋亡相关蛋白Caspase3/8/9、Bax及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平。6、应用P38抑制剂SB203580、JNK抑制剂SP600125及ERK抑制剂PD98059预处理各组细胞,Western blot检测光损伤后MAPK凋亡信号通路中关键蛋白P38、JNK、ERK及它们的磷酸化形式的表达量,对蛋白条带灰度值统计和定量分析,从而对creg基因修饰的661W细胞是否对光损伤诱导的细胞凋亡有抑制作用及其作用机制进行评估。结果:1、pLvx-puro-creg质粒成功转染至293T病毒包装细胞中且转染效率大于70%。2、慢病毒成功感染至661W细胞中,嘌呤霉素重复筛选后建立稳定的661W细胞系。3、creg蛋白的Western印迹分析证实了慢病毒介导的E1A激活基因阻遏子(creg)基因感染的成功。4、细胞形态学检测分析LD661W与其他组LD661W和LD661W相比较,细胞凋亡明显减少(Pcreg基因转染661W细胞可获得稳定转染的661W细胞系。2、携带creg基因的视网膜光感受器样细胞(661W细胞)抑制光损伤凋亡能力明显增强。3、MAPK信号通路中的JNK及P38是抑制视网膜光损伤感光细胞凋亡的关键信号通路。

关键词： creg 661W细胞光损伤 Caspase MAPK信号通路抗凋亡

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