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作者：张兵霞华中科技大学

学位级别：硕士

目的:本课题拟敲低或过表达心肌细胞creb5,探究心肌缺血缺氧后creb5是否通过调控心肌细胞凋亡和氧化应激对心肌梗死发挥作用,以及具体调控机制。方法:(1)对H9C2细胞进行缺氧24h处理,通过荧光定量RT-PCR、Western blot检测缺氧前后H9C2... 详细信息

目的:本课题拟敲低或过表达心肌细胞creb5,探究心肌缺血缺氧后creb5是否通过调控心肌细胞凋亡和氧化应激对心肌梗死发挥作用,以及具体调控机制。方法:(1)对H9C2细胞进行缺氧24h处理,通过荧光定量RT-PCR、Western blot检测缺氧前后H9C2细胞中creb5的mRNA和蛋白表达水平;(2)通过结扎C57BL/6J小鼠心脏冠状动脉左前降支建立小鼠心肌梗死模型,28天后,通过荧光定量RT-PCR、Western blot检测各组心肌组织中creb5的mRNA和蛋白表达水平;(3)使用慢病毒感染H9C2细胞敲低或过表达creb5后,进行缺氧处理24h后,流式检测心肌细胞凋亡和ROS产生情况,WB检测凋亡和氧化应激相关蛋白表达情况,GPx、SOD分子活性试剂盒检测GPx、SOD分子活性;(4)进行小鼠心肌梗死造模后当天,使用慢病毒局部注射心肌组织,在小鼠心肌组织中过表达creb5,在术后day 0和day28,通过超声心动图评估小鼠心功能水平,并取出心脏标本检测心肌细胞凋亡和氧化应激情况;(5)使用慢病毒感染H9C2细胞下调creb5表达,缺氧处理24h后进行RNA-sequence测序,与对照组H9C2细胞进行差异基因分析和通路富集分析;(6)使用慢病毒感染H9C2细胞下调creb5表达,检测Akt、p-Akt、HIF-1α的蛋白表达情况,再使用MK-2206处理H9C2细胞抑制p-Akt表达,检测creb5表达情况,探究creb5与Akt之间上下游关系。H9C2细胞缺氧处理24h后,利用细胞核细胞浆蛋白分离试剂盒,再进行WB检测creb5在缺氧前后细胞核与细胞浆内的表达水平。结果:(1)H9C2细胞缺氧处理24h后,其creb5的mRNA和蛋白表达水平上升;(2)小鼠心肌梗死造模28天后,心肌组织中creb5的mRNA和蛋白表达水平也上升;(3)过表达creb5抑制H9C2细胞缺氧处理后凋亡:用干扰慢病毒感染H9C2细胞敲低creb5,缺氧处理24h后,流式细胞术检测显示敲低组相较于对照组凋亡增加,凋亡相关蛋白Bax增加,Bcl-2蛋白表达下降,CCK-8检测细胞活性降低。再通过慢病毒感染H9C2细胞过表达creb5,缺氧处理24h后,流式细胞术检测发现过表达组相较于对照组细胞凋亡减少,Bax蛋白表达下降,Bcl-2蛋白表达增加;(4)过表达creb5抑制H9C2细胞缺氧处理后氧化应激:用干扰慢病毒感染H9C2细胞敲低creb5,缺氧处理24h后,cell ROX荧光染色显示敲低组相较于缺氧组细胞ROS平均荧光强度增加,且抗氧化酶GPx、SOD活性下降,SOD1、SOD2蛋白表达下降,氧化产物p67phox蛋白表达升高。再用慢病毒感染H9C2细胞过表达creb5,缺氧24h后,检测相同指标,显示过表达组相较于缺氧组细胞内ROS减少,抗氧化酶GPx活性增加,SOD1、SOD2蛋白表达上升,氧化产物p67phox蛋白表达下降;(5)在心肌梗死模型小鼠心肌组织中过表达creb5,可以有效改善小鼠心肌梗死后心功能,抑制心肌细胞凋亡及氧化应激:用慢病毒局部注射心梗模型小鼠心肌组织过表达creb5,28天后,过表达组小鼠相较于心梗组小鼠心功能改善,Tunel和DHE染色显示过表达组小鼠相较于心梗组心肌细胞凋亡和ROS产生减少;(6)RNA-sequence测序通路富集分析结果显示,H9C2细胞缺氧处理后creb5表达与Akt通路相关。H9C2细胞敲低creb5缺氧处理后,与缺氧组相比敲低组p-Akt蛋白表达无明显变化。使用Akt抑制剂MK-2206抑制p-Akt表达缺氧处理后,creb5蛋白表达下降。H9C2细胞缺氧处理后,creb5在细胞浆内蛋白表达下降,并且在细胞核内蛋白表达明显升高。H9C2细胞敲低creb5缺氧处理后,与缺氧组相比敲低组HIF-1α表达下降。结论:creb5在H9C2细胞缺氧处理24h后表达上升;creb5在小鼠心肌梗死心肌组织中也表达上升;H9C2细胞过表达creb5抑制缺氧处理后细胞凋亡及氧化应激;在心肌梗死小鼠模型中过表达creb5抑制心肌细胞凋亡及氧化应激;抑制Akt磷酸化活性可使缺氧后心肌细胞creb5表达下降;creb5在缺氧后入核发挥作用;敲低creb5引起缺氧后心肌细胞HIF-1α表达下降。

关键词：心肌梗死 creb5 细胞凋亡氧化应激

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PCNP通过creb5促进胶质母细胞瘤的恶性进展

PCNP通过CREB5促进胶质母细胞瘤的恶性进展

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作者：赵琛中南大学

学位级别：硕士

研究背景:胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤。临床上将胶质瘤分为Ⅰ-Ⅳ级,其中Ⅳ级胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)恶性程度最高。寻找调节GBM恶性进展的关键分子及其作用机制是有意义的研究课题。PCNP(PEST-containing nuclear protein... 详细信息

研究背景:胶质瘤是最常见的原发性颅内肿瘤。临床上将胶质瘤分为Ⅰ-Ⅳ级,其中Ⅳ级胶质母细胞瘤(glioblastoma,GBM)恶性程度最高。寻找调节GBM恶性进展的关键分子及其作用机制是有意义的研究课题。PCNP(PEST-containing nuclear protein)是一种新型指状蛋白,其在多种肿瘤中均有促进肿瘤发生发展的作用,但在GBM的恶性进展中的作用及其机制尚未阐明。研究目的:研究PCNP是否促进GBM的恶性进展及其分子机制。研究方法与结果:首先利用胶质瘤复发前后的临床样本进行蛋白组学分析,发现在复发后的病人组织样本中PCNP高表达。然后通过CGGA数据库进一步确认了PCNP与胶质瘤预后具有相关性。采用荧光定量PCR(q-PCR)和蛋白免疫印迹(Western Blot)在正常胶质细胞系与不同级别的胶质瘤细胞系中进一步发现了PCNP在GBM细胞中高表达。通过CCK-8、平板克隆实验、划痕实验、Transwell实验等发现在LN229和U251细胞中敲降PCNP可以抑制GBM细胞的增殖、迁移和侵袭,在SF126细胞中过表达PCNP可以促进GBM细胞的增殖、迁移和侵袭。通过成球实验以及Western Blot发现过表达PCNP的GBM细胞中的干性水平明显升高。进一步通过转录组测序、免疫共沉淀、Western Blot、免疫荧光等实验探究PCNP调控GBM细胞恶性进展的分子机制,结果表明PCNP通过促进GBM细胞中转录因子creb5的表达和核移位水平并进一步上调MAKP信号通路。最后利用稳定敲降PCNP的LN229-sh PCNP细胞系,建立动物移植瘤模型,发现敲降PCNP能够抑制GBM移植瘤的生长。结论:本研究明确了PCNP能够促进GBM的恶性进展。揭示了PCNP通过促进creb5介导GBM恶性进展的分子机制,为GBM的临床治疗提供了潜在的干预靶点。图28个,表格5个,参考文献55篇

关键词：胶质瘤 PCNP 组学 creb5 MAPK

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creb5在大肠癌转移中的调控机制

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遗传 2014年第7期36卷 679-684页

作者：齐鲁丁彦青南方医科大学基础医学院病理学系广州510515 南方医科大学南方医院病理科广州510515

大肠癌转移过程中所涉及的细胞信号调控网络非常复杂,寻找调控网络中的关键调控点对阐明大肠癌转移机制以及寻找药物治疗靶点均具有重要意义。研究表明,creb5(cAMP responsive element binding protein 5)可能为大肠癌转移相关信号调控... 详细信息

大肠癌转移过程中所涉及的细胞信号调控网络非常复杂,寻找调控网络中的关键调控点对阐明大肠癌转移机制以及寻找药物治疗靶点均具有重要意义。研究表明,creb5(cAMP responsive element binding protein 5)可能为大肠癌转移相关信号调控网络中的关键基因。文章基于大肠癌表达谱数据,根据creb5基因表达值的大小对大肠癌的相关分子事件进行了富集分析,发现这些分子事件与肿瘤转移密切相关。根据creb5能够和c-Jun结合成为异二聚体的特点,联合分析转录因子AP-1结合位点的富集情况,筛选出在creb5基因高表达组中表达上调、具有AP-1结合位点、且属于癌症通路的基因16个,这些基因所构成的分子网络与细胞迁移功能类相关度最高。细胞迁移功能类主要由5个基因——CSF1R、MMP9、PDGFRB、FIGF和IL6所构成,因此creb5可能是通过调控这5个关键基因进而促进大肠癌的转移。

关键词： creb5 大肠癌转移生物信息学

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creb5通过调控TGFB2促进结直肠癌免疫抑制微环境的形成

CREB5通过调控TGFB2促进结直肠癌免疫抑制微环境的形成

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作者：刘蕾南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是最常见的癌症之一,在全球癌症中发病率和死亡率均居第三位。转移是结直肠癌患者死亡的主要原因,转移性结直肠癌患者5年生存率仅为12%-14%,因此研究结直肠癌转移的潜在机制至关重要。... 详细信息

研究背景和目的:结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是最常见的癌症之一,在全球癌症中发病率和死亡率均居第三位。转移是结直肠癌患者死亡的主要原因,转移性结直肠癌患者5年生存率仅为12%-14%,因此研究结直肠癌转移的潜在机制至关重要。肿瘤微环境(Tumor Microenvironment,TME)即肿瘤生长的环境,免疫反应是其生物学特性之一。肿瘤在发展过程中受免疫应答机制的不断调节,逐渐形成免疫抑制性微环境,介导肿瘤免疫逃逸,从而促进肿瘤转移。cAMP 反应元件结合蛋白 5(cAMP responsive element binding protein 5,creb5)是一种转录激活因子,对cAMP反应元件(cAMP response element,CRE)具有高度亲和力,在结直肠癌的侵袭和转移过程中具有重要功能。研究表明,creb5参与炎症反应调节,在阿片类药物诱导的免疫抑制中发挥作用。此外,creb5所属的ATF/creb家族在免疫应答中具有重要的作用,可以抑制组织损伤和自身免疫反应,在肿瘤免疫监测的背景下可能具有致病性。然而creb5在结直肠癌免疫微环境中的作用和机制尚未阐明。在本研究中,我们旨在探讨creb5对结直肠癌免疫抑制微环境的作用和机制,为开发新的免疫诊治分子标志和靶点提供科学依据,为改善结直肠癌预后提供理论基础。研究方法:1.在小鼠结直肠癌细胞MC38中建立creb5稳定过表达株,MC38K中建立creb5稳定干扰细胞株。通过小鼠皮下成瘤实验检测creb5在体内对结直肠癌生长和侵袭的影响。2.采用流式细胞分析和免疫荧光检测creb5对结直肠癌中免疫细胞浸润的影响。3.采用TCGA数据库,通过GSEA基因富集的方法分析结直肠癌中与creb5高表达相关的信号通路,并分析潜在的靶基因。4.通过q-PCR实验检测creb5对TGFB2表达的影响。5.采用creb5稳定细胞株与RAW264.7细胞共培养的方法,通过流式细胞学分析和RT-PCR实验研究creb5通过上调TGFB2的表达对RAW264.7极化影响。研究结果:1.过表达creb5后MC38结直肠癌细胞在C57BL/6J小鼠体内的生长速度显著增加,干扰creb5后MC38K结直肠癌细胞在C57BL/6J小鼠体内的生长受到显著抑制。2.过表达creb5后MC38肿瘤侵袭能力显著增强。3.过表达creb5后MC38肿瘤中MDSCs和M2巨噬细胞的浸润增加,CD8+T细胞的浸润减少。干扰creb5后MC38K肿瘤中MDSCs和M2巨噬细胞的浸润减少,CD8+T细胞的浸润增加。4.GSEA基因富集分析显示TGFβ信号通路在creb5高表达组中显著富集。5.creb5促进结直肠癌细胞TGFB2转录水平表达。6.creb5通过TGFB2促进结直肠癌中M2型巨噬细胞的极化。

关键词：结直肠癌 creb5 免疫抑制微环境 TGFB2 M2巨噬细胞极化

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creb5在心肌梗死后心肌细胞凋亡中的作用及机制研究

CREB5在心肌梗死后心肌细胞凋亡中的作用及机制研究

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作者：陈杰华中科技大学

学位级别：硕士

背景心肌梗死（Myocardial Infarction,MI）是常见的心血管急危重症,起病急,预后差,严重影响国民的身体健康。MI是在冠状动脉病变的基础上,冠状动脉的血流急剧减少或中断,引起心肌组织急性、持续性的缺血性心肌坏死。同时,心肌细胞损伤... 详细信息

背景心肌梗死（Myocardial Infarction,MI）是常见的心血管急危重症,起病急,预后差,严重影响国民的身体健康。MI是在冠状动脉病变的基础上,冠状动脉的血流急剧减少或中断,引起心肌组织急性、持续性的缺血性心肌坏死。同时,心肌细胞损伤会引起心肌局部持续的炎症和纤维化,从而引起心脏收缩和舒张功能障碍。目前与心肌梗死相关的研究主要集中在细胞凋亡、线粒体功能障碍、炎性因子、免疫反应等领域。尽管这些领域已经开展了大量相关研究,但心肌梗死发生发展机制仍未阐明。creb是一种细胞转录因子,能和c AMP反应元件的特定DNA序列结合,从而影响基因的转录。creb5是creb蛋白家族的一员,先前的研究发现creb5在调节肿瘤细胞生长、增殖、分化中起着至关重要的作用。已确认creb5在几种类型的人类癌症中均表达升高,如卵巢癌、肝细胞癌和前列腺癌。人肝细胞癌细胞中creb5可促进细胞增殖和迁移。此外,creb5可调控直肠癌细胞的细胞凋亡。我们前期针对心肌梗死后患者心肌组织的单细胞测序结果发现creb5在心肌细胞中表达明显升高,然而creb5在心肌梗死疾病进程中发挥的作用及机制仍然未知。方法1.实验组（心肌梗死后心力衰竭行心脏移植患者）及对照组（意外死亡志愿捐献）人来源心肌组织均由心血管病国家重点实验室友情提供,取左心室前壁全层心室壁组织（每组3份）,免疫荧光染色检测样本中creb5阳性心肌细胞比例。12只8周龄雄性C57/BL小鼠随机分为假手术组（Sham,n=6）和心梗组（MI,n=6）。根据分组选择是否结扎小鼠冠脉左前降支,4周后获取小鼠左心室前壁全层心室壁组织,荧光定量RT-PCR、Western blot及免疫组化检测creb5表达情况。2.提取并培养乳鼠原代心肌细胞,缺氧24h后检测心肌细胞creb5表达情况。细胞实验分为2组进行:normal组（心肌细胞置于37℃,5%CO2的正常培养箱）、hypoxia组（心肌细胞置于95%N2、5%CO2的培养箱）。荧光定量RTPCR检测creb5m RNA表达水平,Western blot检测creb5蛋白表达水平。构建sh RNA慢病毒表达载体敲低心肌细胞creb5基因表达,检测creb5对缺氧引起的心肌细胞凋亡的影响。细胞实验分组:normal NT组（心肌细胞感染sh NT慢病毒置于37℃,5%CO2的正常培养箱）、hypoxia NT组（心肌细胞感染sh NT慢病毒置于95%N2、5%CO2的培养箱）、normal sh creb组（心肌细胞感染sh creb慢病毒置于37℃,5%CO2的正常培养箱）、hypoxia sh creb组（心肌细胞感染sh creb慢病毒置于95%N2、5%CO2的培养箱）。荧光定量RT-PCR检测creb5和凋亡相关基因表达水平,TUNEL法检测细胞凋亡情况。3.为了进一步探究creb5在全基因组水平对心肌细胞表达谱的影响,我们分别提取normal NT、normal+sh creb5、hypoxia NT、hypoxia sh creb5四个不同处理组心肌细胞的RNA建库并进行转录组高通量测序。4.动物实验准备工作:收集、浓缩、纯化慢病毒,将40只8周龄雄性C57小鼠随机分为4组:sham+NT组（假手术组+注射sh NT慢病毒）、sham+sh creb5组（假手术组+注射sh creb5慢病毒）、MI+NT组（心梗组+注射sh NT慢病毒）、MI+sh creb5组（心梗组+注射sh creb5慢病毒）,每组各10只。根据分组选择是否结扎小鼠冠脉左前降支并在梗死区边缘注射相应慢病毒,1周后每组各取两只小鼠提取左心室前壁全层心室壁组织,提取组织RNA和蛋白质,荧光定量RT-PCR检测creb5m RNA表达水平,Western blot检测creb5蛋白表达水平。5.通过心脏超声分别检测第0、1、2、4周各组小鼠心功能的变化情况。Masson染色检测心肌梗死面积大小。结果1.免疫荧光染色检测发现心肌梗死患者心肌组织标本中creb5阳性心肌细胞比例高于正常心肌组织,提示心肌梗死后心肌组织creb5表达升高。Sham组和MI组小鼠心脏组织免疫组织化学染色和Western blot实验的结果显示creb5在小鼠MI组心脏组织中的表达水平高于Sham组。荧光定量RT-PCR结果显示心肌梗死后creb5m RNA表达水平高于Sham组。2.荧光定量RT-PCR、Western blot结果显示心肌细胞在缺氧24h后creb5 m RNA和creb5蛋白表达明显升高,敲低creb5基因表达后凋亡相关基因Bax表达明显下降。TUNEL染色结果显示敲低乳鼠心肌细胞creb5基因表达可以有效减少缺氧导致的心肌细胞凋亡。3.RNA-seq高通量测序分析结果显示正常情况下敲低心肌细胞creb5表达可引起细胞增殖、凋亡、脂肪酸代谢、组蛋白去乙酰化等相关基因

关键词： creb5 心肌梗死凋亡

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Hsa＿circ＿0035505在胃癌中的表达及与miR-582-3p/creb5的相关性研究

Hsa＿circ＿0035505在胃癌中的表达及与miR-582-3p/CREB5的相关性...

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作者：肖唱中国医科大学

学位级别：硕士

目的:胃癌是对人类健康的主要危害,研究表明,90%的早期胃癌患者可以通过切除来治愈。然而,现有的肿瘤标志物,如癌胚抗原、糖类抗原19-9等在胃癌诊断中的阳性率较低。因此,探索更加有效的胃癌诊断和治疗的分子靶标将具有重要意义。环状RN... 详细信息

目的:胃癌是对人类健康的主要危害,研究表明,90%的早期胃癌患者可以通过切除来治愈。然而,现有的肿瘤标志物,如癌胚抗原、糖类抗原19-9等在胃癌诊断中的阳性率较低。因此,探索更加有效的胃癌诊断和治疗的分子靶标将具有重要意义。环状RNA(circular RNAs,circ RNAs)是近年来发现的在真核细胞中广泛存在的非编码RNA,可作为分子“海绵”吸附miRNA和转录调节因子。近年来,circ RNAs的异常表达在包括胃癌在内的许多人类疾病中得到报道。目前关于hsa＿circ＿0035505在胃癌中的研究未见报道,本研究拟检测hsa＿circ＿0035505在胃癌细胞及组织中的表达,进一步分析其表达与胃癌患者临床病理因素的关系,并初步研究其在胃癌演进过程中可能发挥作用的分子机制。研究方法:1.收集2017年-2020年肿瘤外科手术切除的胃癌及配对非癌组织标本213例,所有标本均来源于中国医科大学附属第一医院肿瘤外科。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测hsa＿circ＿0035505在胃癌细胞和213例胃癌及配对正常胃粘膜组织中的表达情况,分析其与胃癌临床病理因素的相关性。2.通过qRT-PCR检测miR-582-3p在33例、creb5在78例胃癌及配对正常胃粘膜组织中的表达情况,对hsa＿circ＿0035505、miR-582-3p和creb5在33例匹配胃癌组织中的表达进行Spearman相关性分析。对creb5的表达与78例胃癌患者临床病理因素相关性进行分析。Western blot检测胃癌及配对正常胃粘膜组织中creb5蛋白的表达情况。Kaplan-Meier方法用于分析胃癌患者的预后。3.通过qRT-PCR检测PXDN和AKT在45例胃癌及配对正常胃粘膜组织中的表达情况,并对AKT和creb5、PXDN在45例匹配胃癌组织中的表达分别进行Spearman相关性分析。并利用TCGA和GEO数据库对creb5和PXDN共同表达时对胃癌患者临床病理因素和预后进行统计分析。利用c Bio Portal和Metascape数据库预测creb5和PXDN的生物学功能。4.采用Graph Pad Prism 5.0.1作图,SPSS 19.0版软件进行数据处理。计量资料的比较采用t检验,计数资料的比较采用χ检验。生存分析采用Kaplan-Meier法。以P5为差异有统计学意义。结果:1.通过qRT-PCR检测hsa＿circ＿0035505在胃癌细胞系及213例胃癌及配对正常胃黏膜组织的表达,结果显示:hsa＿circ＿0035505在胃癌细胞和组织中的表达升高;其高表达与胃癌患者的肿瘤浸润深度、淋巴结转移和p TNM分期等病理因素有关。2.qRT-PCR检测miR-582-3p在胃癌细胞系及33例胃癌及配对正常胃黏膜组织的表达,结果显示:miR-582-3p在胃癌细胞系中表达降低;与配对正常胃粘膜组织相比,miR-582-3p在胃癌组织中的表达水平显著降低。qRT-PCR检测creb5在胃癌细胞系及78例胃癌组织及配对正常胃黏膜组织的表达,结果显示:creb5在胃癌细胞系中的表达升高;与配对正常胃粘膜组织相比,creb5在胃癌组织中的表达水平显著升高。其高表达与胃癌患者的年龄、肿瘤浸润深度、淋巴结转移和p TNM分期等病理因素有关。Western blot结果显示:与配对正常胃粘膜组织相比,胃癌组织中creb5的蛋白水平明显升高。Kaplan-Meier分析结果显示:与creb5低表达组相比,creb5高表达组的中位总体生存时间(OS)和中位首次进展时间(FP)均显著缩短。相关性分析结果显示:在33例胃癌组织中,hsa＿circ＿0035505的表达与miR-582-3p的表达呈负相关,miR-582-3p的表达与creb5的表达成负相关,hsa＿circ＿0035505与creb5在胃癌组织中的表达成正相关。3.通过qRT-PCR检测PXDN在45例胃癌组织及配对正常胃黏膜组织的表达,结果显示:PXDN在GC组织中的表达上调。creb5和PXDN在GC组织中的表达呈正相关关系。二者共同高表达与胃癌患者的年龄、肿瘤部位、WHO组织学分型、Borrmann分型、Lauren分型、肿瘤浸润深度、淋巴结转移、远处转移和p TNM分期等病理因素密切相关。与creb5和PXDN低表达的胃癌患者相比,creb5和PXDN高表达的胃癌患者显示出较差的总体生存时间;与单基因高表达组相比,creb5和PXDN共同表达的胃癌患者预后更差。AKT与creb5、PXDN在胃癌组织中的表达均呈正相关关系。Metascape网站富集分析结果显示,creb5相关基因和PXDN相关基因均参与血管发育、细胞形态发生和分化和细胞外基质粘附等生物过程。结论:1.Hsa＿circ＿0035505在胃癌细胞和组织中的表达升高,其高表达与胃癌患者的

关键词：胃癌 Hsa＿circ＿0035505 miR-582-3p creb5 PXDN PI3K/AKT 预后

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miR-200c/CTSL轴通过外泌体介导A549细胞对紫杉醇和顺铂耐药

miR-200c/CTSL轴通过外泌体介导A549细胞对紫杉醇和顺铂耐药

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作者：刘雅丽苏州大学

学位级别：硕士

目的:研究miRNA-200c（miR-200c）富集的外泌体递送是否参与溶酶体组织蛋白酶L（cathepsinL,CTSL）介导的A549细胞对紫杉醇和顺铂耐药,并探索其潜在的分子机制。方法:（1）使用A549、A549紫杉醇耐药（A549/TAX）和A549顺铂耐药（A549/DD... 详细信息

目的:研究miRNA-200c（miR-200c）富集的外泌体递送是否参与溶酶体组织蛋白酶L（cathepsinL,CTSL）介导的A549细胞对紫杉醇和顺铂耐药,并探索其潜在的分子机制。方法:（1）使用A549、A549紫杉醇耐药（A549/TAX）和A549顺铂耐药（A549/DDP）细胞。试剂盒法提取细胞外泌体,通过Zeta电位分析仪,透射电镜,western blot和荧光共聚焦显微镜示踪法进行外泌体的鉴定和摄取分析;（2）A549细胞转染miR-200c inhibitor,在此基础上分别转染Smad2/creb5过表达质粒或小干扰RNA;A549/TAX 或 A549/DDP 细胞转染 miR-200c mimics,并分别联合转染 Smad2/creb5过表达质粒或小干扰RNA。q-PCR检测各细胞及提取的外泌体中miR-200c的表达变化,western blot检测 CTSL、磷酸化Smad2或creb5以及EMT相关蛋白,CCK8、细胞流式和彗星实验检测细胞对紫杉醇或顺铂的敏感性,transwell和划痕实验评估细胞的侵袭迁移能力;（3）皮下裸鼠移植瘤实验瘤内注射富集miR-200c的外泌体进一步评估miR-200c外泌体递送在CTSL介导的A549细胞紫杉醇和顺铂耐药中的作用。结果:（1）与A549细胞相比,A549/TAX和A549/DDP细胞中miR-200c低表达,CTSL 高表达,A549 细胞转染 miR-200c inhibitor 后,CTSL、磷酸化 Smad2 和 creb5表达量均上升,A549/TAX和A549/DDP细胞转染miR-200c mimics后,CTSL和磷酸化Smad2或creb5均减少;（2）通过联合干扰A549细胞中Smad2或creb5,能有效抑制单纯miR-200c inhibitor组中CTSL表达的上调,增加细胞凋亡,降低侵袭迁移;（3）而在转染miR-200cmimics的A549/TAX或A549/DDP细胞中进一步过表达Smad2或creb5,CTSL的表达量反而升高,耐药性增加,EMT现象加剧;（4）富集miR-200c的外泌体体内外有效递送可升高受体A549/TAX和A549/DDP细胞miR-200c水平,可能通过降低磷酸化Smad2和creb5来下调CTSL表达,从而逆转A549细胞紫杉醇和顺铂耐药。结论:相比A549细胞,A549/TAX和A549/DDP表达低水平miR-200c及高水平磷酸化Smad2或creb5和CTSL蛋白。而且miR-200c可以通过外泌体的递送作用升高受体细胞miR-200c水平,可能通过降低磷酸化Smad2和creb5来下调CTSL,从而逆转A549细胞紫杉醇和顺铂耐药。

关键词：外泌体化疗耐药 A549/TAX A549/DDP CTSL miR-200c p-Smad2 creb5

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应用生物信息学筛选结直肠癌转移相关基因

应用生物信息学筛选结直肠癌转移相关基因

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作者：齐鲁南方医科大学

学位级别：硕士

结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一,其发病率高,早期症状不明显,转移早,对人体危害很大。转移是影响患者生存及预后的重要因素,因此筛选与结直肠癌转移及患者生存相关的分子标志物以及转移相关细胞信号调控网络中的关键调控点,对结直肠癌的... 详细信息

结直肠癌是常见的恶性肿瘤之一,其发病率高,早期症状不明显,转移早,对人体危害很大。转移是影响患者生存及预后的重要因素,因此筛选与结直肠癌转移及患者生存相关的分子标志物以及转移相关细胞信号调控网络中的关键调控点,对结直肠癌的早期诊断、预后评估以及药物靶点的选择均有着重要意义。基因表达谱能够反映出组织或细胞在某一特定状态下的基因表达情况。在结直肠癌发生,发展和转移的各个阶段,由于分子机制的变化,基因表达谱也会发生相应的改变。为了筛选结直肠癌转移相关分子标志物,需要对正常及肿瘤状态下的基因表达谱中变化程度较大的基因进行筛选。为了筛选与结直肠癌患者生存相关的基因,需要结合患者生存时间及基因表达调控情况进行筛选。为了寻找结直肠癌转移机制中细胞信号调控网络的关键调控点,又需要对受调控作用较多的基因进行筛选。因此本研究主要通过对结直肠癌基因表达谱数据进行挖掘与分析,通过比较转移后结直肠癌组织表达谱数据与正常结直肠组织表达谱数据,筛选与结直肠癌转移相关的分子标志物,通过分析结直肠癌患者生存时间及对应的基因表达谱的情况,筛选与结直肠癌患者生存相关的基因,并通过分析与结直肠癌转移以及患者生存时间相关基因的受调控情况,寻找结直肠癌转移分子机制中的关键调控点,进一步通过分析此基因可能的调控机制,联合细胞生物学活性的实验验证,探讨此基因在结直肠癌转移分子机制中的作用。 1、结直肠癌转移相关分子标志物的筛选由于结直肠癌在转移过程中基因表达会出现相应变化,为了筛选结直肠癌转移相关分子标志物,需要寻找基因表达变化程度最大的基因。由于个体差异,生活环境等因素的不同,同一阶段的结直肠癌表达谱数据可能会有所差别,为了得到最稳定的分子标志物,选择三组结直肠癌表达谱数据分别进行筛选并取交集。通过对比正常结直肠组织数据和处于早期转移(淋巴结转移期)的结直肠癌组织数据,筛选出差异表达变化倍数为10倍且P值小于0.01的差异基因。三组筛选结果取交集,最终筛选出了与结直肠癌早期转移相关的差异表达基因共16个,其中表达上调的9个基因分别为VSNL1,PSAT1,KIAA1199,ABHD7, MMP7,JUB,CLDN1,KRT23,FOXQ1;表达下调的7个基因分别为SFRP1, SLC4A4,CHGA,GCG,GUCA2B,CLDN8,CD177。由于上调的差异表达基因在肿瘤诊断中更有意义,为了验证筛选出的差异表达基因的特异性和敏感性,将筛选出的9个上调差异表达基因基于表达谱数据进行聚类分析、主成分分析、ROC曲线分析并对未曾报道过结直肠癌表达情况的部分基因进行荧光定量PCR的实验验证。最终确定筛选出的差异表达基因特异性和敏感性较高,有望能够成为联合诊断的分子标签。2、结直肠癌转移相关基因表达调控分析由于筛选出的结直肠癌转移相关分子标志物主要基于基因的差异表达情况,且筛选出的基因数量少,特异性和敏感性较高。由于结直肠癌转移过程中表达出现变化的基因较多,为了更好的理解转移的分子机制,需要对表达出现变化的基因受调控情况进行进一步分析,筛选受调控影响较大的基因。因此,选择具有TNM分期信息的结直肠癌表达谱数据,对处于T1T2期和M1期的数据进行GSEA分析,选择niRNA结合位点和转录因子结合位点基因集,筛选出在转移后M1期表达上调基因上游调控区富集的miRNA结合位点和转录因子结合位点。通过合并数据,筛选出具有miRNA结合位点较多的基因有13个,同样,筛选出具有转录因子结合位点较多的基因有41个。对这两组基因取交集,最终筛选出同时具有较多miRNA结合位点及转录因子结合位点的基因为KLF12和creb5。 3、结直肠癌患者生存相关基因的筛选肿瘤转移与患者生存时间关系密切,肿瘤是否发生转移关系到患者的治疗及预后。由于受调控影响较大的基因在结直肠癌转移相关分子机制中更为重要,且筛选与患者生存时间相关的基因,能够对患者预后进行评估。因此以患者生存时间为切入点,筛选受调控影响较大且与患者生存时间密切相关的基因。在此,选择具有生存时间信息的结直肠癌表达谱数据,筛选并获得与结直肠癌患者生存时间相关的基因235个。对235个基因进行KEGG通路富集分析发现,这些基因主要参与细胞粘附,ECM受体相互作用,阿米巴样运动等与结直肠癌细胞迁移高度相关的分子事件。同时对235个基因上游转录因子结合位点进行富集分析,获得25个出现频率较高的转录因子结合位点,选择含有上述转录因子结合位点数大于7个的基因有30个,其中,含有上述转录因子数目最多的基因为creb5,含有上述25个转录因子结合位点中的13个转录因子结合位点。将30个基因与结直肠癌上调表达基因集取交集,获得与结直肠癌患者生存时间相关,受转录因子调控较多,且在结直肠癌中表达上调的基因有6个,分别为STX2,PODXL,KLK6,GRB10,EHBP1和creb5。使用表达谱数据对这6个基因进行生存分析,生存曲线显示这6个基因与结直肠

关键词：结直肠癌转移生物信息学分子标志物 creb5

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