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crbn/MUM1/C-MYC及BCL2信号对来那度胺治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤疗效的影响研究

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CRBN/MUM1/C-MYC及BCL2信号对来那度胺治疗弥漫性大B细胞淋巴瘤疗...

作者：王丽萍贵州医科大学

学位级别：硕士

目的:弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）的免疫表型和遗传学特征与临床预后及其治疗反应密切相关。羟脑苷脂（Cereblon,crbn）蛋白是来那度胺直接结合的靶分子,通过泛素化途径下调干扰素调节因子4/多发性骨... 详细信息

目的:弥漫性大B细胞淋巴瘤（diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL）的免疫表型和遗传学特征与临床预后及其治疗反应密切相关。羟脑苷脂（Cereblon,crbn）蛋白是来那度胺直接结合的靶分子,通过泛素化途径下调干扰素调节因子4/多发性骨髓瘤癌基因1（interferon regulatory factor 4/multiple myeloma oncogene 1,IRF4/MUM1）、人髓细胞增生原癌基因（cellular myelocytomatosis oncogene,C-MYC）的表达,从而抑制肿瘤细胞的增殖。来那度胺目前已用于复发难治性DLBCL或某些特殊表型的DLBCL的初治,但来那度胺治疗DLBCL的疗效预测及评估研究相对较少。本研究拟探讨来那度胺疗效与DLBCL中crbn、MUM1、C-MYC、B细胞淋巴瘤-2基因（B cell lymphoma 2,BCL2）免疫表型及分子遗传学的关系,为来那度胺疗效预测评估提供一定的依据。方法:通过医院临床伦理委员会审批,收集贵州医科大学附属肿瘤医院淋巴瘤科2016年1月至2020年10月确诊并用利妥昔单抗（Rituximab,R）、环磷酰胺（Cyclophosphamide,CTX）、多柔比星（doxorubicin,DOX）、长春新碱（Vincristine,Oncovin,VCR）、泼尼松（prednisone,PDN）（即R-CHOP）联合来那度胺治疗、临床病理资料完整的DLBCL57例作为实验组,同时收集贵州医科大学附院血液科确诊为DLBCL予R-CHOP治疗的39例作为实验对照组。治疗6个周期结束后4周复查影像学（CT/MRI）将完全缓解（complete response,CR）和部分缓解（partial response,PR）视为有效,疾病稳定（stable disease,SD）和疾病进展（progressive disease,PD）视为无效。免疫组织化学染色检测crbn、MUM1、C-MYC、BCL2、急性淋巴母细胞性白血病共同抗原（CD10）、B淋巴细胞瘤-6基因（B cell lymphoma-6,BCL6）、细胞增殖核抗原Ki-67（nuclear-associated antigen Ki-67）的蛋白表达,实时荧光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR,RT-q PCR）检测crbn m RNA表达量,将crbn和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）产物进行琼脂糖凝胶电泳验证,用聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction,PCR）扩增及一代测序检测crbn 11号外显子第384位点及第386位点突变。通过查阅病历和电话进行随访,并对实验数据进行统计学分析。结果:1、来那度胺+R-CHOP实验组57例病例,治疗后复查影像学疗效评估:CR 15例、PR 20例、SD 7例、PD 15例,有效35例,无效22例;R-CHOP对照组39例病例,治疗后复查影像学疗效评估:CR 7例、PR 11例、SD 6例、PD 15例,有效18例,无效21例;实验组和对照组治疗有效率分别为61.40%和46.15%,实验组疗效稍高于对照组,但无明显统计学差异（P=0.140）。来那度胺治疗组中生发中心型（GCB型）DLBCL 11例,非生发中心型（non-GCB型）DLBCL 46例,两组病例疗效差异无明显统计学意义（P=1.000）。2、生存分析:R-CHOP+来那度胺实验组较R-CHOP对照组具有更好的生存状况（P=0.028）。3、crbn表达:来那度胺治疗有效组与无效组之间crbn的表达（有效组vs无效组:m RNA为0.1149±0.0220 vs 0.0460±0.0083;蛋白表达为121.10±9.47 vs 53.50±7.72）有明显统计学差异,有效组明显高于无效组（t和P依次为2.197,0.0332和4.792,0.0001）;crbn蛋白与m RNA表达呈正相关关系（r=0.584,P＜0.001）。4、crbn突变检测:所有病例均未检测出crbn 11号外显子第384位点及第386位点突变。5、MUM1、C-MYC及BCL2表达:来那度胺有效组和无效组之间MUM1、C-MYC蛋白表达（有效组vs无效组:MUM1为114.70±13.51 vs 71.75±12.01;C-MYC为91.36±11.21 vs 50.85±13.06）有明显统计学差异,有效组明显高于无效组（t和P依次为2.229,0.0306和2.297,0.0257）;MUM1、C-MYC蛋白表达与crbn蛋白表达呈正相关关系（r=0.308,P=0.022;r=0.316,P

关键词：淋巴瘤来那度胺 crbn MUM1 C-MYC BCL2 疗效

赖氨酸63位特异性去泛素化酶BRCC36调控多发性骨髓瘤细胞来那度胺敏感性的机制研究

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赖氨酸63位特异性去泛素化酶BRCC36调控多发性骨髓瘤细胞来那度胺...

作者：王步淞苏州大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)是成年人中第二常见的血液系统恶性肿瘤。包括来那度胺(Lenalidomide,Len)在内的免疫调节药物(IMiDs)是治疗多发性骨髓瘤的重要药物。免疫调节药物与E3泛素连接酶的底物受体crbn相结合... 详细信息

研究背景和目的:多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)是成年人中第二常见的血液系统恶性肿瘤。包括来那度胺(Lenalidomide,Len)在内的免疫调节药物(IMiDs)是治疗多发性骨髓瘤的重要药物。免疫调节药物与E3泛素连接酶的底物受体crbn相结合,促进crbn招募新底物,如转录因子Ikaros(IKZF1)和Aiolos(IKZF3),通过Cullin-4 RING E3(CRL4crbn)泛素连接酶增强其泛素化降解,最终抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖。然而随着时间的推移,患者经常对免疫调节药物耐受,如何增加免疫调节药物的敏感性从而降低患者对这类药物的耐受成为目前亟待解决的一个问题。在免疫调节药物耐受机制中,crbn-IKZF1/3分子轴是最重要的信号通路之一。因此尝试提高多发性骨髓瘤中crbn的蛋白水平或许可以改善多发性骨髓瘤对免疫调节药物的耐受。自噬溶酶体通路(Autophagy Lysosome Pathway,ALP)是细胞中蛋白质降解的主要途径之一。已有研究证明crbn可以通过蛋白酶体途径降解,但crbn是否可以通过自噬溶酶体途径降解尚未被证实。BRCC36(也称BRCC3)是K63位多聚泛素链特异性去泛素化酶(Deubiquitinase,DUB),它通过参与到BRISC和BRCA1-A复合体中发挥其去泛素化酶活性。BRCC36可以特异性切割K63位赖氨酸连接的多聚泛素链,使靶蛋白去泛素化,从而保护靶蛋白不受ALP途径降解。BRCC36参与到DNA损伤修复、免疫调节及炎症反应等生理过程,但是其在肿瘤中的作用还未知。且BRCC36是否可以影响crbn的自噬溶酶体途径降解从而影响免疫调节药物敏感性尚不清楚。在本论文中,本课题组首先发现了crbn新的相互作用蛋白BRCC36,随后证实了BRCC36可以调控crbn蛋白水平,接着进一步深入研究了 BRCC36和crbn在多发性骨髓瘤细胞对来那度胺敏感性中的功能及其分子机制。研究方法:首先,为了寻找新的crbn相互作用蛋白,本课题组使用邻近生物素标记TurboID和蛋白组学方法发现了 crbn相互作用蛋白BRCC36,通过免疫共沉淀实验以及免疫印迹实验来验证BRCC36和crbn两者的相互作用。同时在HEK293细胞系中过表达BRCC36和crbn,利用免疫荧光观察二者的共定位。接着通过在HEK293T细胞和多发性骨髓瘤细胞系中分别过表达和敲低BRCC36探究BRCC36对crbn的调控关系。对四种多发性骨髓瘤细胞系的细胞裂解液用免疫印迹实验探究BRCC36与crbn蛋白水平的相关性。并在HEK293T细胞中敲低SHMT2、RAP80来探究SHMT2、RAP80对crbn的调控关系。本课题组分别使用DMSO和SHIN1处理HEK293T细胞和多发性骨髓瘤细胞系,在细胞裂解液中用免疫印迹实验证实SHIN1对BRCC36和crbn蛋白水平的影响。为了获得BRCC36稳定敲低的HEK293T、HeLa和多发性骨髓瘤细胞系,利用敲低BRCC36的shRNA慢病毒对其进行侵染。在BRCC36稳定敲低的HEK293T细胞系中研究BRCC36对crbn泛素化修饰水平的影响。利用自噬溶酶体抑制剂BafA1探究BRCC36在crbn降解中的作用。最后通过利用免疫印迹实验和CCK-8细胞增殖实验在多发性骨髓瘤细胞株中探究BRCC36对crbn的调控以及在多发性骨髓瘤细胞对免疫调节药物来那度胺敏感性中的作用。研究结果:研究发现BRCC36与crbn在细胞质中存在相互作用。使用FLAG affinity gel和crbn抗体进行免疫共沉淀实验进一步证实了无论是外源性还是内源性的BRCC36与crbn均存在相互作用。在多发性骨髓瘤细胞系中发现BRCC36和crbn的蛋白水平呈正相关。然后利用siRNA在HEK293T、HeLa、RPMI-8226及LP1细胞中敲低BRCC36后发现crbn的蛋白水平明显下调,证实了 BRCC36对crbn蛋白的调控。用自噬溶酶体抑制剂Baf A1处理同时过表达BRCC36与crbn后的HEK293T细胞,发现Baf A1逆转了 BRCC36对crbn的保护作用,并在crbn的泛素化实验中发现敲低BRCC36显著增加了 crbn的K63位多聚泛素化。免疫共沉淀和免疫印迹实验证明了 BRCC36调控crbn是依赖其去泛素化酶活性,进而通过抑制溶酶体途径降解从而阻止crbn下调。在此基础上用SHMT2抑制剂SHIN1处理HEK293T细胞后,BRCC36蛋白水平明显上调,同时crbn蛋白水平也随之上调。这一现象随后也在多发性骨髓瘤细胞中得到证实。并且通过用SHIN1处理BRCC36稳定敲低的HeLa细胞株,发现敲低BRCC36阻断了 SHIN1对crbn的上调作用,证实了 SHIN1上调crbn依赖于BRCC36。在功能上,用CCK-8细胞增殖实验

关键词：去泛素化酶BRCC36 crbn K63位多聚泛素化 SHIN1 多发性骨髓瘤 IKZF1/3

羟脑苷脂(crbn)在来那度胺抗骨髓瘤活性中的分子机制

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中国实验血液学杂志 2018年第4期26卷 1240-1243页

作者：樊文静范枝俏杨美娟潘耀柱白海兰州大学第二临床医学院甘肃兰州730030 兰州军区兰州总医院全军血液病专科中心甘肃兰州730050 甘肃中医药大学甘肃兰州730000

羟脑苷脂(Cereblon,crbn)是一种具有离子蛋白酶活性的大脑相关蛋白,可与DNA损伤结合蛋白-1(DDB1)、滞蛋白4(Cullin4,Cul4A或Cul4B)和调节因子Cullins 1(RoC1)相互作用形成功能性E3泛素连接酶复合物(crbn-CRL4),结合底物后通过泛素-蛋白... 详细信息

羟脑苷脂(Cereblon,crbn)是一种具有离子蛋白酶活性的大脑相关蛋白,可与DNA损伤结合蛋白-1(DDB1)、滞蛋白4(Cullin4,Cul4A或Cul4B)和调节因子Cullins 1(RoC1)相互作用形成功能性E3泛素连接酶复合物(crbn-CRL4),结合底物后通过泛素-蛋白酶体途径进行蛋白水解。它也是免疫调节剂(IMiD)抗骨髓瘤作用的必需靶蛋白。来那度胺与crbn结合时会招募新的底物,使其结合在crbn-CRL4上,导致其泛素化和蛋白酶体依赖的降解增加,从而产生抗骨髓瘤活性。与该复合物结合的底物有IKZF1、IKZF3蛋白和谷氨酰胺合成酶(GS)等,来那度胺处理后的IKZF1和IKZF3的crbn依赖性降解也是H2O2介导的氧化应激的结果。除了泛素化依赖外,来那度胺还能通过介导非泛素依赖性途径,以竞争性阻止crbn结合CD147-MCT1,以调节其抗肿瘤活性;其还能通过调节miRNA水平,crbn结合下游蛋白AGO2的表达在多发性骨髓瘤(MM)细胞中起作用。来那度胺抗骨髓瘤活性的分子机制有很多种,本文从泛素化途径和非泛素化途径2方面就crbn在来那度胺抗骨髓瘤活性的分子机制作一综述。

关键词： crbn 来那度胺多发性骨髓瘤泛素连接酶复合物

沙利度胺及其衍生物治疗骨髓增生异常综合征的研究进展

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中国实验血液学杂志 2021年第6期29卷 1967-1971页

作者：汪尹静文江高峰倪健周咏明武汉科技大学附属天佑医院血液科湖北武汉430000 武汉科技大学附属天佑医院医学转化中心湖北武汉430000 美国哈佛大学医学院布里格母女子医院肿瘤临床药剂科美国波士顿MA02115

沙利度胺及其衍生物因具有抗血管生成和免疫调节作用而用于骨髓增生异常综合征(MDS)的治疗,近年来,有研究发现其不仅在伴del(5q)的较低危MDS患者中疗效显著,在非del(5q)MDS的治疗中也显示出优势。另外,其分子靶点及新底物的发现使得新... 详细信息

沙利度胺及其衍生物因具有抗血管生成和免疫调节作用而用于骨髓增生异常综合征(MDS)的治疗,近年来,有研究发现其不仅在伴del(5q)的较低危MDS患者中疗效显著,在非del(5q)MDS的治疗中也显示出优势。另外,其分子靶点及新底物的发现使得新一代免疫调节药(IMiDs)的开发及基于IMiDs的蛋白水解靶向嵌合体的药物设计成为可能。本文就沙利度胺及其衍生物的作用机制及临床应用新进展作一综述,为MDS的治疗提供更加科学、合理、有效的方案。

关键词：骨髓增生异常综合征沙利度胺来那度胺 crbn

沙利度胺抗肿瘤机制及其作用靶点crbn的研究进展

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中国药理学通报 2015年第6期31卷 745-749页

作者：黄海宁张浩汪海中南大学药学院湖南长沙410007 天津卫生学环境医学研究所心血管药物研究中心北京100850

沙利度胺及其衍生物(来那度胺、泊马度胺)为小分子谷氨酸衍生物,具有很强的免疫调节作用,此外,它们还具有其它重要的生物学作用,如抑制血管新生、致畸,更重要的是,它们具有明显的抗肿瘤活性,能够抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡,特别是... 详细信息

沙利度胺及其衍生物(来那度胺、泊马度胺)为小分子谷氨酸衍生物,具有很强的免疫调节作用,此外,它们还具有其它重要的生物学作用,如抑制血管新生、致畸,更重要的是,它们具有明显的抗肿瘤活性,能够抑制肿瘤细胞增殖,促进细胞凋亡,特别是针对多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)的临床治疗中已经发挥重要作用。近年来通过对沙利度胺分子靶标的筛选和其靶分子cereblon(crbn)发现,为其药理机制的研究提供了新的思路,并为开发新一代无毒副作用和具有更高效抗肿瘤活性的新一代沙利度胺衍生物提供了新的线索。该文将从沙利度胺及其衍生物的作用机制、最新靶点及对MM的治疗作一简单综述。

关键词：沙利度胺血管生成多发性骨髓瘤 crbn 免疫调节肿瘤治疗致畸

crbn基因突变引起轻型智力发育迟滞分子机制

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生物技术 2014年第6期24卷 38-41页

作者：陈佩林陈峰陈方敏张千千南通大学生命科学学院江苏南通226019 江苏师范大学生命科学学院江苏徐州221116

[目的]为了研究crbn基因与常染色体隐性遗传非综合征轻型智力发育迟滞(ARNSMR)的关系。[方法]从293T细胞中克隆了crbn和crbn突变体基因(crbnm),并克隆至pc DNA-GFP、pc DNA-Flag质粒中,将重组质粒用脂质体转染到293T细胞中,Co-IP与GFP-C... 详细信息

[目的]为了研究crbn基因与常染色体隐性遗传非综合征轻型智力发育迟滞(ARNSMR)的关系。[方法]从293T细胞中克隆了crbn和crbn突变体基因(crbnm),并克隆至pc DNA-GFP、pc DNA-Flag质粒中,将重组质粒用脂质体转染到293T细胞中,Co-IP与GFP-crbn、crbnm融合蛋白相互作用的293T细胞蛋白,通过PAGE胶电泳、银染分析差异蛋白。同时我们还做了crbn和crbnm蛋白稳定性和泛素化修饰研究。[结果]发现crbn基因无义突变后没有改变蛋白的细胞定位,但影响了相互作用蛋白,同时突变的crbn蛋白自我泛素化修饰增强,与野生型相比更容易降解。[结论]crbn基因的无义突变后蛋白泛素化修饰增强,细胞内相互作用蛋白发生改变,从而影响了crbn基因的功能。

关键词： ARNSMR crbn 银染泛素化修饰

一种用于筛选具有抗肿瘤活性的沙利度胺衍生物分子平台的建立

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国际药学研究杂志 2015年第2期42卷 189-193页

作者：黄海宁张雁芳龙超良李春悦龙学辉崔文玉张浩汪海天津卫生学环境医学研究所心血管药物研究中心北京100850 中南大学药学院长沙410007

目的建立用于筛选具有抗肿瘤活性的沙利度胺衍生物的分子平台。方法从人胎肝c DNA文库中分别扩增cereblon(crbn)和Ikaros家族锌指蛋白1(Ikaros family zinc finger protein 1,IKZF1)c DNA,并将其克隆入p XJ40-myc和pc DNA3-FLAG载体中,... 详细信息

目的建立用于筛选具有抗肿瘤活性的沙利度胺衍生物的分子平台。方法从人胎肝c DNA文库中分别扩增cereblon(crbn)和Ikaros家族锌指蛋白1(Ikaros family zinc finger protein 1,IKZF1)c DNA,并将其克隆入p XJ40-myc和pc DNA3-FLAG载体中,将其转染293T细胞,通过检测沙利度胺及其衍生物对crbn和IKZF1蛋白相互作用的改变,间接反映其在肿瘤抑制中的作用。结果 crbn和IKZF1在293T细胞中均得到表达,沙利度胺及其两个衍生物可显著增强crbn和IKZF1的结合。结论成功建立了用于筛选具有抗肿瘤活性的沙利度胺衍生物分子平台,初步发现2个沙利度胺衍生物可显著增强crbn和IKZF1的结合,提示其具有潜在的抗癌活性。

关键词：药物筛选沙利度胺衍生物 crbn Ikaros家族锌指蛋白

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相对定量法分析小鼠crbn基因表达

安徽农业科学 2010年第25期38卷 13628-13630页

作者：张俭斌陈佩林南通大学生命科学学院江苏南通226007

[目的]研究crbn基因与常染色体隐性遗传非综合征轻型精神发育迟滞(ARNSMR)的关系,探讨小鼠crbn基因mRNA在不同组织中的表达情况。[方法]应用RT-PCR和Real-time PCR技术,研究了小鼠crbn基因在肺、肝、心脏、肾和大脑中的表达情况。[结果... 详细信息

[目的]研究crbn基因与常染色体隐性遗传非综合征轻型精神发育迟滞(ARNSMR)的关系,探讨小鼠crbn基因mRNA在不同组织中的表达情况。[方法]应用RT-PCR和Real-time PCR技术,研究了小鼠crbn基因在肺、肝、心脏、肾和大脑中的表达情况。[结果]小鼠crbn基因mRNA在肺、大脑中表达量较高,在心脏中表达量最低。[结论]小鼠crbn基因广泛表达于不同组织,除了与学习、记忆功能相关外,可能还有其他功能。

关键词： crbn RT-PCR Real-time PCR

基于crbn靶点的抗多发性骨髓瘤靶向药物研究

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基于CRBN靶点的抗多发性骨髓瘤靶向药物研究

作者：张静洁广西医科大学

学位级别：硕士

多发性骨髓瘤(MM,multiple myeloma)是一种血液恶性肿瘤,它是由单克隆浆细胞的异常增生所引起的。MM的发病率较高,居于血液恶性肿瘤第二位,占全部肿瘤的1%,初治后易复发,主要病人为中老年群体。它的特征为异常浆细胞(产生单克隆免疫球蛋... 详细信息

多发性骨髓瘤(MM,multiple myeloma)是一种血液恶性肿瘤,它是由单克隆浆细胞的异常增生所引起的。MM的发病率较高,居于血液恶性肿瘤第二位,占全部肿瘤的1%,初治后易复发,主要病人为中老年群体。它的特征为异常浆细胞(产生单克隆免疫球蛋白)在骨髓内恶性增殖,从而引起骨折和骨髓功能衰竭,同时伴有骨破坏引起的血钙水平升高。不断积累的恶性细胞取代了骨髓中的正常功能性浆细胞,导致贫血、白细胞减少症和血小板减少症。目前,治疗多发性骨髓瘤仍然是一个难题。随着分子生物学的发展,靶向药物的运用为多发性骨髓瘤患者带来了治疗的希望。骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome,MDS)是一组异质性克隆性疾病,它源于造血髓系定向干细胞能干细胞。外周血细胞减少、骨髓造血细胞发育异常和无效造血等为该疾病的主要特征。常见于老年群体。免疫调节剂类药物对MDS有较好的疗效。免疫调节剂(immunomodulatory drug,IMi Ds)是结构上类似N-(2,6-二氧代-3-哌啶基)-邻苯二甲酰亚胺(沙利度胺)的药物。沙利度胺为第一代IMi Ds,于2006年被FDA批准,用于多发性骨髓瘤(MM)的治疗。随后,第二代、第三代IMi Ds,来那度胺和泊马度胺相继被FDA批准,用于多发性骨髓瘤(MM)的治疗。研究发现,IMi Ds药物具有免疫调节、抗肿瘤和抗炎的作用。其发展过程比较曲折,第一代药物沙利度胺用于治疗孕妇的妊娠反应。后来因为海豹婴儿事件而被认为是毒药,禁止使用。在后续研究中发现沙利度胺具有免疫调节、抗炎和抗肿瘤等作用而被老药新用,具有较大的研究价值。2014年,Lu G的课题组和Krnke J的课题组分别发表一篇Science文章,证实IMi Ds类药物的作用靶点为crbn蛋白,并探索了crbn的下游作用途径。来那度胺与crbn蛋白结合后,从而使2个转录因子IKZF1和IKZF3泛素化降解。它们的降解促进了T细胞产生白介素IL-2(T细胞生长因子),并且抑制IRF4和MYC的表达,从而产生免疫调节的作用。本文针对IMi Ds类药物作用的crbn蛋白靶点,以泊马度胺和来那度胺为先导化合物,并基于对文献报道化合物进行的构效关系分析总结和运用DS等分子虚拟对接技术,设计了两类免疫调节剂药物。第一类目标化合物是在异吲哚的C4位引入酚羟基,再通过连接链与芳香杂环连接,得到类似2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氧基)-N-(1-(吡啶-3-基)乙基)乙酰胺的化合物,从而使化合物的C4位得到了更大的扩展,增大该类化合物的亲和力,更好地结合crbn蛋白,增大转录因子IKZF1和IKZF3的降解率,促进IL-2的生成,发挥免疫调节的作用。第二类目标化合物是将异吲哚C3位上的羰基改成N原子,然后引入亲脂性基团,再连接L-谷氨酰胺环,得到类似3-(7-氨基-3-氧代-1-苯基-1,3-二氢-2H-吲唑-2-基)哌啶-2,6-二酮化合物,从而引导CRL4泛素连接酶诱导的CK1α降解。另外,考虑到谷氨酰胺环的的C2位、C6位羰基和N1位氨基分别与crbn的疏水色氨酸、亲水组氨酸形成氢键。将C6位羰基换成氨基,C5位引入羰基,生成四氢哒嗪-3,6-二酮六元环,增大氢键作用。设计了第一类目标化合物的合成路线。首先以5-氢-呋喃-2-酮和三甲基乙酰氯为原料合成2,2-二甲基丙酸2-呋喃基酯(1),再与马来酸酐通过狄尔斯-阿尔德反应得环加成中间体(2),用浓硫酸低温处理,脱去桥环得中间体(3),该中间体再与3-氨基-2,6-哌啶二酮盐酸盐反应得第一类目标化合物骨架3-羟基-N-(2,6-二氧-3-哌啶基)苯邻二甲酰亚胺(4),进行取代和缩合反应得第一类目标化合物。设计了第二类目标化合物的合成路线。首先以2-氯-3-硝基苯甲酸为原料,与苯肼衍生物的盐酸盐反应,得中间体(1),然后进行分子内合环,得中间体(2),其在氢化钠低温催化后,再与氯乙酸甲酯反应,得中间体(3),经水合肼肼解,得中间体(4),其与氯乙酰氯进行取代反应后,再进行分子内成环,得第二类目标化合物。本文合成Ⅰ类和Ⅱ类共20个目标化合物,并全部采用H-NMR、ESI-MS的方法进行了结构确证,证明与所设计的分子结构符合。对目标化合物进行了初步的生物活性评价。评价方法是采用ELISA试剂盒检测受试化合物对脂多糖(LPS)刺激PBMC的TNF-α表达抑制作用,目前发现有2个化合物对LPS刺激的TNF-α表达有显著的抑制作用(P<0.05)。通过对两类目标化合物的结构与活性评价数据分析,初步总结了构效关系。发现第一类化合物对TNF-α的抑制作用较好,提示在C4位引入醚连接杂环链对化合物的TNF-α抑制活性有益。

关键词： crbn 免疫调节剂多发性骨髓瘤药物设计与合成活性筛选