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课题1、抗cmv pp65抗原单克隆抗体的制备、抗原血症检测的方法学建立及临床比对试验课题2、北京地区低危人群梅毒血清学筛查模式改进

课题1、抗CMV pp65抗原单克隆抗体的制备、抗原血症检测的方法学...

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作者：陈兰兰北京协和医学院

学位级别：硕士

[研究背景1人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,Hcmv/cmv)是人体常见的隐性感染病毒之一,在人群中的血清阳性率较高,虽然对于免疫功能正常的人体一般不会引起严重的临床后果。但是,当机体免疫功能因疾病进展或医源性因素受到损伤或抑制... 详细信息

[研究背景1人巨细胞病毒(human cytomegalovirus,Hcmv/cmv)是人体常见的隐性感染病毒之一,在人群中的血清阳性率较高,虽然对于免疫功能正常的人体一般不会引起严重的临床后果。但是,当机体免疫功能因疾病进展或医源性因素受到损伤或抑制时,长期潜伏于患者体内cmv转为激活感染,引起严重的临床后果。cmv pp65抗原蛋白(巨细胞病毒低基质磷蛋白)是cmv UL83基因编码、分子量约65KD的被膜蛋白,是巨细胞病毒活动性复制时产量最多的病毒蛋白,也是目前公认的cmv活动性感染早期、快速诊断指标。但是,目前国内cmv pp65抗原检测试剂盒几乎均为国外进口,价格昂贵。中国市场尚无国产的cmv pp65抗原血症检测试剂盒。[研究目的]本研究的主要目的是利用巨细胞病毒抗原制备抗cmv pp65抗原的单克隆抗体,并以自制单抗隆抗体为基础建立检测外周血cmv pp65抗原血症的实验方法,为国产试剂盒的研发奠定基础。[研究方法]cmv AD169株接种人胚胎肺成纤维细胞MRC-5细胞,得到不同感染时间(24h、48h和72h)的病毒包涵体,超声波破碎和甲醛灭活法制备巨细胞病毒抗原,与商业购买的巨细胞病毒pp65重组抗原分别免疫BALB/C小鼠,标准方法制备抗巨细胞病毒pp65单克隆抗体。然后利用所得单克隆抗体建立检测外周血巨细胞病毒抗原血症检测的实验方法,并与进口试剂盒cmv Brite进行比对,应用SPSS17.0统计软件分析两种方法的一致性。[研究结果]1.经筛选共得到两株抗cmv pp65抗原的杂交瘤细胞株,克隆株名称分别为29F1-1和13D1-3。按照小鼠免疫球蛋白亚型鉴定试剂盒说明书进行亚型鉴定,13D1-3克隆株分泌的单抗为IgG1型,29F1-1单抗为IgG2a型。抗体特异性好,与HSV-1、HSV-2、MRC-5、BGMK、VZV均无交叉反应。两株杂交瘤细胞诱导的小鼠腹水含大量单克隆抗体,13D1-3抗体滴度1：5000,29F1-1抗体滴度达1：2000。经ProteinG亲和层析法纯化后仍具有良好的免疫学特性。2.以3.7%甲醛浓度固定外周血白细胞,0.5%IGEPAL CA-630透化处理,0.5%BSA0.01M PBS封闭,13D1-3单克隆抗体作为第一抗体,FITC标记的羊抗鼠IgG作为第二抗体建立外周血cmv pp65抗原血症检测方法。本实验室自建方法与cmv BriteTM Kit试剂盒比对,阳性符合率=88.8%,阴性符合率=98.9%,总符合率=97.3%, kappa值=0.895,吻合度较高。[研究结论]成功制备了抗巨细胞病毒pp65单克隆抗体,并建立以13D1-3单克隆抗体为基础的检测外周血cmvpp65抗原血症的方法,与cmv Brite试剂盒比对具有良好的符合性,可进一步临床应用研究。[研究背景]梅毒(Syphilis)是由苍白密螺旋体(Treponema pallidum)感染的性传播疾病(sexually transmitted diseases, STD),也可通过血液或伤口传播。目前梅毒仍然是世界上重要的公众健康问题,全球每年新增梅毒感染病例将近1200万。美国CDC推荐的以梅毒螺旋体非特异性抗体试验为初筛试验的传统筛查方案(Traditional screening algorithm),由于传统方案诊断梅毒漏诊率高,敏感性低已逐渐被淘汰。国外一些实验室逐渐采用梅毒血清学逆向筛查方案(reverse screening algorithm),既首先使用梅毒螺旋体特异性抗体试验进行初筛,阳性标本再使用梅毒螺旋体非特异性抗体试验评估活动性,但推荐这种模式的国家和地区其筛查对象主要是孕妇或其他有危险性行为的人群。而在中国,由于特殊的医疗环境,进行梅毒血清学筛查的人群除了孕妇、高危性行为人群外,所有进行侵入性或有创性医疗诊治的患者都要进行梅毒血清学筛查,因此,西方国家建议的逆向筛查模式可能不适于中国人群,尤其是在一些大型综合性医院就诊的低危人群患者。[研究目的]通过分析梅毒血清学逆向筛查模式,查找该模式存在的问题,并在其基础上进行改进,提出适用于中国地区低危人群的梅毒血清学筛查模式。[研究方法]雅培公司化学发光微粒子免疫分析法(CMIA)对来协和医院就诊的患者进行梅毒血清学初筛,阳性标本进行梅毒螺旋体颗粒凝集试验(TppA)复检并同时行梅毒快速血浆反应素环状卡片试验(RPR)。CMIA初筛与TppA复检不符的标本进行荧光螺旋体抗体吸收试验(FTA-ABS)验证。[研究结果]2013年8月份至2014年1月份在北京协和医院共有4127

关键词：巨细胞病毒单抗隆抗体 cmv pp65抗原血症梅毒筛查化学发光微粒子免疫分析试验梅毒螺旋体乳胶颗粒凝集试验

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