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CLARITY技术构建肝脏透明化模型及技术相关应用

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CLARITY技术构建肝脏透明化模型及技术相关应用

作者：袁小川广西医科大学

学位级别：硕士

目的:探索一种基于CLARITY技术的快速肝组织透明化手段,通过条件优化对肝硬化动物模型进行免疫荧光标记三维成像,并基于该技术开发一种石蜡切片的抗体洗脱术。方法:（1）水凝胶灌注大鼠,取出肝脏待水凝胶凝固后切为1mm薄片。切片随机分... 详细信息

目的:探索一种基于CLARITY技术的快速肝组织透明化手段,通过条件优化对肝硬化动物模型进行免疫荧光标记三维成像,并基于该技术开发一种石蜡切片的抗体洗脱术。方法:（1）水凝胶灌注大鼠,取出肝脏待水凝胶凝固后切为1mm薄片。切片随机分为两组,对照组采用常规被动脂质清除法处理,实验组置于特制电泳装置中,在外加电场条件下洗涤脂质,通过提高电泳温度并量化组织透明度,探索最优肝透明化条件。（2）使用肝透明优化条件对DEN诱导的大鼠肝硬化模型进行脂质清除,利用多种大鼠器官组织探索免疫荧光标记成像条件,对大鼠肝硬化模型组织实施激光共聚焦显微镜扫描三维成像。（3）将CLARITY技术的水凝胶固定、脂质清除和抗体洗脱特性应用于石蜡切片,探索石蜡切片的透明化方法的最佳条件,进行抗体洗脱,并与常规酸洗脱进行对比。通过对比免疫荧光标记切片洗脱前后荧光信号变化及积分荧光强度测定来确定抗体洗脱效果。结果:（1）实验组在12V电压下37℃电泳48h时肝切片相对透明度达到最高并保持至96h,随后相对透明度开始下降,而在48h电泳清除脂质后提高温度继续电泳48h,肝组织切片相对透明度可进一步提高且对照组脂质清除速度明显低于实验组。（2）通过组织透明化处理成功标记了大鼠肾和脑中的正常的组织结构（基底膜和星形胶质细胞）的空间分布情况。大鼠肝硬化模型通过病理检验证明诱导成功,激光共聚焦显微镜扫描三维成像成功显示了透明化肝硬化组织的血管、假小叶和肝细胞在空间结构上的分布和关系。（3）4um的组织切片、水凝胶固定加上阳离子防脱载玻片的使用可以增强石蜡切片对洗脱的耐受。经过透明化步骤处理的石蜡切片使用4%SDS在60℃条件下可以获得最佳的抗体洗脱效果,效果显著优于常规酸洗脱方式,即洗脱后切片平均积分荧光强度下降最多,且抗体复染效果良好。结论:肝组织切片在12V电压下37℃电泳48h再辅以52℃电泳48h可以实现较快速的脂质清除。使用肝快速透明化手段处理DEN诱导的大鼠肝硬化组织,通过激光共聚焦显微镜扫描成像可以显示肝硬化组织的高分辨精细结构在三维空间的位置关系和分布。CLARITY技术与石蜡切片具有良好的吻合性,对石蜡切片进行透明化处理可以使切片经过免疫荧光标记后再进行反复的抗体洗脱复染,且能保护组织的形态结构和抗原结合位点不发生改变。

关键词： CLARITY 电泳温度三维成像抗体洗脱

改良CLARITY技术及其在肝脏组织结构学的应用研究

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改良CLARITY技术及其在肝脏组织结构学的应用研究

作者：代全楷广西医科大学

学位级别：硕士

目的:比较4种不同浓度水凝胶在鼠脑、肝、肾组织中的应用,探索各种组织透明化过程中水凝胶浓度的最优比,其次为优化改良CLARITY肝脏组织水凝胶固定透明化技术,基于该技术对肝癌模型鼠三维结构的应用研究。方法:1、按照原始水凝胶中丙烯... 详细信息

目的:比较4种不同浓度水凝胶在鼠脑、肝、肾组织中的应用,探索各种组织透明化过程中水凝胶浓度的最优比,其次为优化改良CLARITY肝脏组织水凝胶固定透明化技术,基于该技术对肝癌模型鼠三维结构的应用研究。方法:1、按照原始水凝胶中丙烯酰胺(A)、甲叉双丙烯酰胺(B)、多聚甲醛(P)的终浓度比,制备A4B4P4(A:B:P=4%:0.05%:4%)、A2B2P4(A:B:P=2%:0.025%:4%)、A1B1P4(A:B:P=1%:0.0125%:4%)、A4B4P0(A:B:P=4%:0.05%:0)水凝胶。选取8只昆明小鼠随机分为4组,每组2只,分别采用A4B4P4、A4B4P0、A2B2P4、A1B1P4水凝胶进行灌注,然后行组织固定及透明化处理。计算经4种水凝胶处理后小鼠脑、肝、肾组织的相对透明度及蛋白损失量,同时对脑、肝、肾组织进行免疫荧光标记,完成三维重建。2、利用双相水凝胶进行肝组织固定,将固定好的组织切成1mm厚的切片,随机分为两组,SDS组和SDS+脂肪酶组,SDS组采用十二烷基硫酸钠SDS清除液进行被动脂质清除9天,SDS+脂肪酶组先采用SDS清除液被动脂质清除5天,随后浸泡于脂肪酶溶液中4天,两组均进行透明灰度值测定,并给予细胞核DAPI染色检测标记深度。3、选取25只SD大鼠,随机分为对照组和造模组,造模组进行18周腹腔注射二乙基亚硝胺DEN,对照组进行18周腹腔注射生理盐水。分别将对照组和造模组肝脏组织进行苏木素-伊红染色,同时分别对两组肝脏组织进行透明化,同时然后进行免疫荧光标记,完成三维重建,并测量管腔平均面积。结果:1、A2B2P4组、A1B1P4组小鼠脑组织相对透明度均高于A4B4P4、A4B4P0组(均PCLARITY技术,发现双相水凝胶组织固定联合脂肪酶浸泡脂质被动清除技术可以快速实现鼠肝组织透明化。基于肝癌模型鼠,利用改良CLARITY技术对肝癌组织进行三维结构重建,实现了研究组织三维结构中空间位置关系分布,为CLARITY技术在肝脏组织病理学研究作出推动作用。

关键词： CLARITY 水凝胶脂肪酶肝癌模型鼠三维重建

CLARITY技术在小鼠急性肾损伤模型中的应用

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右江民族医学院学报 2018年第5期40卷 409-413页

作者：明志勇邬国斌赵荫农广西医科大学附属肿瘤医院广西南宁530021 广西医科大学研究生院广西南宁530021

目的基于小鼠急性肾损伤模型探讨CLARITY技术在病理诊断中应用的价值。方法将24只昆明小鼠随机均分为实验组和对照组,每组(各12只)分别建立左侧输尿管完全梗阻模型,0d、2d、4d、6d后每次取3只实验组小鼠进行透明化处理,对照组行常规HE... 详细信息

目的基于小鼠急性肾损伤模型探讨CLARITY技术在病理诊断中应用的价值。方法将24只昆明小鼠随机均分为实验组和对照组,每组(各12只)分别建立左侧输尿管完全梗阻模型,0d、2d、4d、6d后每次取3只实验组小鼠进行透明化处理,对照组行常规HE染色。联合应用肉眼观察法、激光共聚焦显微镜观察法和常规显微镜观察法检测肾脏组织的形态学改变。采用TissueFAXS^(TM) Cytometry组织细胞定量分析系统对共聚焦显微镜二维图片中的肾小管上皮细胞数量和肾小管管腔面积进行定量分析。结果肉眼观梗阻侧肾脏,随着时间延长,肾体积增大、充血、水肿,肾盂和输尿管扩张,肾实质结构逐渐萎缩,肾盏融合,肾皮质开始变薄;实验组和对照组均观察到肾脏梗阻后肾小管上皮细胞扁平化、扩张,随着梗阻时间延长,逐渐出现肾小管萎缩消失、组织结构破坏,典型形态消失,纤维结缔组织增生,肾脏出现纤维化;实验组采用激光共聚焦显微镜扫描发现同一个组织的不同层面肾小管上皮细胞数量和肾小管管腔面积分布明显不同。结论透明化技术可观察急性肾损伤后肾脏不同组织层面的病理改变,比HE染色的二维层面提供更多的信息,在病理学和形态学研究领域有较高的应用价值。

关键词： CLARITY 输尿管梗阻三维成像急性肾损伤

基于被动扩散原理的CLARITY大鼠海马透明技术

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基于被动扩散原理的CLARITY大鼠海马透明技术

第十二次全国中西医结合实验医学专业委员会暨第七次湖南省中西医结合神经科专业委员会学术年会

作者：张云翔吴清勤冯娟郭大庆夏阳尧德中电子科技大学神经信息教育部重点实验室

目的:2013年Deisseroth等人在《nature》上报道了一种透明(CLARITY)技术,该技术是一种将完整的组织迅速转化成光学透明和高分子可渗透的纳米孔径水凝胶结构,同时保留组织精细结构和重要生物大分子的技术。目前CLARITY技术已经成功用于... 详细信息

关键词： CLARITY 海马脑功能

运用CLARITY技术获取完整透明的小鼠大脑的研究

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运用CLARITY技术获取完整透明的小鼠大脑的研究

第十二次全国中西医结合实验医学专业委员会暨第七次湖南省...

作者：吴清勤冯娟夏阳尧德中电子科技大学生命科学与技术学院

CLARITY是一项能使脑透明并且提供完整神经网络三维成像的新型脑组织处理技术,对脑结构及其功能研究具有重要意义。目前,该技术已经开展运用于疾病模型的研究。在本文中,我们通过自制、并优化电泳装置,获得了光学上完全透明的小鼠大脑,... 详细信息

CLARITY是一项能使脑透明并且提供完整神经网络三维成像的新型脑组织处理技术,对脑结构及其功能研究具有重要意义。目前,该技术已经开展运用于疾病模型的研究。在本文中,我们通过自制、并优化电泳装置,获得了光学上完全透明的小鼠大脑,这位后续深入开展AD干预的研究提供了样品的保证。

关键词： CLARITY 脑科学 3D成像

基于被动扩散原理的CLARITY大鼠海马透明技术

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基于被动扩散原理的CLARITY大鼠海马透明技术

第十二次全国中西医结合实验医学专业委员会暨第七次湖南省...

作者：张云翔吴清勤冯娟郭大庆夏阳尧德中电子科技大学神经信息教育部重点实验室

目的:2013年Deisseroth等人在《nature》上报道了一种透明(CLARITY)技术,该技术是一种将完整的组织迅速转化成光学透明和高分子可渗透的纳米孔径水凝胶结构,同时保留组织精细结构和重要生物大分子的技术。目前CLARITY技术已经成功用于斑马鱼、小鼠全脑、以及人脑切片的透明,并开始应用于一些脑疾病模型研究。CLARITY技术中的一个关键环节是在保留蛋白质和核酸的基础上快速除去脂质。通常采用电泳或被动扩散的方法去除脂质,但电泳时温度太高可能导致蛋白质变性、组织变黄,进而影响透明效果。本研究中,我们运用基于被动扩散原理的CLARITY技术将大鼠的海马透明。方法:对SD雄性大鼠进行心脏灌注后取得大鼠全脑,依次进行多聚甲醛组织固定、聚丙烯酰胺水凝胶包埋、剥离海马、用Cleaning Buffer进行海马透明,通过拍照记录结果。结果:多聚甲醛固定和聚丙烯酰胺水凝胶包埋后的大鼠全脑呈乳白色,从其中剥离出的海马也呈乳白色且柔软富有弹性;Cleanigg Buffer洗涤后的海马组织从周边开始逐渐透明化,至洗涤第7天时呈现完全透明状态,完全透明之后的海马与透明之前的海马相比体积发生了较大膨胀,提示限制组织结构的脂质去除后水凝胶吸水膨大。结论:本文采用基于被动扩散原理建立的CLARITY技术,在尽量保存脑组织精细结构的情况下对大鼠的海马进行了透明,该方法不仅操作简便,而且可以尽量避免电泳过程对脑组织结构的破坏,同时,用于局部脑组织透明的周期短,本工作可为进一步研究海马相关的脑功能和脑疾病(如癫痫等)提供一种新的实验手段。

关键词： CLARITY 海马脑功能

运用CLARITY技术获取完整透明的小鼠大脑的研究

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运用CLARITY技术获取完整透明的小鼠大脑的研究

第十二次全国中西医结合实验医学专业委员会暨第七次湖南省中西医结合神经科专业委员会学术年会

作者：吴清勤冯娟夏阳尧德中电子科技大学生命科学与技术学院

关键词： CLARITY 脑科学 3D成像

采用常规电泳设备建立CLARITY透明脑技术

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生物技术通讯 2014年第4期25卷 557-559页

作者：王大炜程韵王婷婷陈晓萍浙江工业大学生物与环境工程学院浙江杭州310032

目的:CLARITY是一种全新的组织形态学研究技术,在脑结构与功能研究中具有重要用途。探讨能否采用常规电泳设备开展该项技术。方法:从ICR雌性小鼠取得新鲜脑组织,依次进行多聚甲醛组织固定、聚丙烯酰胺水凝胶包埋、SDS电泳洗涤,通过拍照... 详细信息

目的:CLARITY是一种全新的组织形态学研究技术,在脑结构与功能研究中具有重要用途。探讨能否采用常规电泳设备开展该项技术。方法:从ICR雌性小鼠取得新鲜脑组织,依次进行多聚甲醛组织固定、聚丙烯酰胺水凝胶包埋、SDS电泳洗涤,通过拍照记录结果。结果:多聚甲醛固定和水凝胶包埋后的脑组织呈乳白色,柔软富有弹性;电泳洗涤后的脑组织从周边开始逐渐透明化,至洗涤第10 d时呈现均匀的半透明状态,可用于三维神经网络原位分析。结论:研究结果为采用常规电泳设备开展CLARITY技术提供了基础数据。

关键词： CLARITY 聚丙烯酰胺凝胶包埋 SDS电泳透明脑

模糊化与清晰化交错运用：大陆坚持“九二共识”之基本方式

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台、港、澳研究