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Luminal/extracellular domains of chimeric ci-m6pr-C proteins interfere with their retrograde endosome-to-TGN trafficking in the transient expression system

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The Journal of Biomedical Research 2018年第4期32卷 245-256页

作者： Fei Chang Na Li Kang Yan Yumin Huang Hongfei Xu Yongjian Liu Jiangsu Key Laboratory of Xenotransplanation Department of Medical GeneticsNanjing Medical University Department of Orthopedics the First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University Department of Pharmacology & Chemical Biology University of Pittsburgh School of Medicine

The membrane trafficking of cation-independent mannose 6-phosphate receptor（ci-m6pr） between the transGolgi network（TGN） and endosomal compartments is not only critical for maintaining lysosomal function but also a well-known event for understanding molecular and cellular mechanisms in retrograde endosome-to-TGN *** it has been well established in literature that the C-terminus of bovine ci-m6pr determines its retrograde trafficking,it remains unclear whether the luminal domain of the protein plays a role on these sorting *** this study,we found that partial deletion of luminal domain of human ci-m6pr mistargeted the mutant protein to nonTGN ***,replacing the luminal domain of both bovine and human ci-m6pr with that from irrelevant membrane proteins such as CD8 or Tac also altered the TGN targeting of the chimeric *** the other hand,only short sequence from HA fused with the transmembrane domain and C-terminus of the receptor,HA-hcim6pr-tail,resulted in its preferential targeting to TGN as for the full length receptor,strongly suggesting that sorting of the receptor may be influenced by luminal ***,using this luminal truncated form of HA-hcim6 pr as a model cargo,we found that the trafficking of the chimeric protein was regulated by the retromer complex through interacting with *** conclusion,our study strongly suggested that the disrupted luminal domain from hci-m6pr or other irrelevant membrane proteins interfere with the process of membrane trafficking and TGN targeting of ci-m6pr.

关键词： ci-m6pr TGN targeting retrograde trafficking SNX5

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靶向膜蛋白降解的双特异性抗体

靶向膜蛋白降解的双特异性抗体

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作者：赵俗贵州大学

学位级别：硕士

膜蛋白作为细胞间相互作用的主要参与者,其功能的异常与多种疾病直接相关。传统小分子抑制剂与抗体能够抑制或阻断膜蛋白与其配体之间的相互作用,但往往存在抑制不彻底或诱发耐药性的问题。新兴的膜蛋白降解技术LYTAC利用抗体与化学合成... 详细信息

膜蛋白作为细胞间相互作用的主要参与者,其功能的异常与多种疾病直接相关。传统小分子抑制剂与抗体能够抑制或阻断膜蛋白与其配体之间的相互作用,但往往存在抑制不彻底或诱发耐药性的问题。新兴的膜蛋白降解技术LYTAC利用抗体与化学合成的ci-m6pr糖肽配体融合而成的双功能分子介导膜蛋白在溶酶体中降解,使其彻底丧失蛋白质功能,为膜蛋白功能异常所致相关疾病的治疗带来了新的思路。然而糖基化修饰的抗体合成困难,难以实现模块化,极大地限制了LYTAC的广泛应用,为了克服这一局限性,本课题开发了一个基于ci-m6pr的完全基因编码的双特异性抗体靶向膜蛋白降解平台,利用内源性ci-m6pr介导的内化来实现高效地向溶酶体递送并降解膜蛋白,为治疗膜蛋白相关疾病的降解剂的开发提供了一个模块化的策略。基于纳米抗体具有分子量小、免疫原性低、易于优化及大规模生产等优势,我们提出了筛选ci-m6pr纳米抗体替代其糖肽配体的策略,以解决糖基化修饰抗体合成困难的问题。第一步,我们通过免疫羊驼、噬菌体展示等方法筛选获得了13个高亲和力的ci-m6pr纳米抗体,并借助流式细胞术和共聚焦成像验证了ci-m6pr纳米抗体能够高效结合细胞表面的ci-m6pr,并依赖ci-m6pr内化至溶酶体中。第二步,我们构建了基于ci-m6pr的双特异性抗体用于膜蛋白降解:以PD-1的降解为例,借助融合表达及Knobs-into-holes技术分别构建了non-Ig G-like与Ig G-like靶向降解PD-1的双特异性抗体,通过流式和免疫印迹法发现在细胞水平上两种形式的双特异性抗体均能够在100 n m浓度下表现出高效的降解作用,且其降解效率受到时间、浓度、纳米抗体的结合力、结合表位等因素的影响,表明基于ci-m6pr纳米抗体的双特异性抗体具有用于膜蛋白降解的可行性。为了进一步探究该双特异性抗体是通过溶酶体还是泛素蛋白酶体降解膜蛋白,我们用蛋白酶体抑制剂和溶酶体抑制剂对细胞进行预处理,结果表明该双特异性抗体主要通过ci-m6pr介导的溶酶体途径发挥降解作用。鉴于PD-1与PD-L1结合会抑制T细胞的激活,我们借助T细胞激活实验证明了该双特异性抗体能够通过降解PD-1的方式消除二者之间的信号传递,从而有效激活T细胞。最后的动物实验表明该双特异性抗体在小鼠体内依然保持高效的PD-1降解活性,这意味着该双特异性抗体具有在活体中通过降解膜蛋白以治疗相关疾病的潜力。

关键词：蛋白质降解膜蛋白 ci-m6pr 溶酶体途径

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