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代谢流分析在CHO细胞代谢研究中的应用进展

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中国生物制品学杂志 2022年第3期35卷 363-368,378页

作者：彭婷(综述) 梅文枫(审校) 福建医科大学免疫治疗研究院福建福州350122

CHO细胞可进行正确的翻译后修饰,如蛋白折叠、糖基化,且其表达的重组蛋白可分泌至胞外,更便于后续纯化,已成为抗体药物的首选表达宿主。代谢流分析(metabolic flux analysis,MFA)又称代谢通量分析,可通过同位素示踪剂绘制胞内流动的代... 详细信息

CHO细胞可进行正确的翻译后修饰,如蛋白折叠、糖基化,且其表达的重组蛋白可分泌至胞外,更便于后续纯化,已成为抗体药物的首选表达宿主。代谢流分析(metabolic flux analysis,MFA)又称代谢通量分析,可通过同位素示踪剂绘制胞内流动的代谢途径来量化这些代谢表型,其综合底物吸收及产物形成速率、生物合成、化学计量反应、中间代谢物的生物合成等数据,可为重新构建细胞代谢提供关键的量化信息。13C-MFA是以13C标记实验为基础的MFA,已成为研究CHO细胞工程改造后的变化及指导培养基和生物工艺优化的重要工具之一。本文就13C-MFA流程及近年MFA在CHO细胞代谢研究中的应用进展作一综述。

关键词：代谢流分析 CHO细胞同位素标记

重组猪干扰素β在CHO细胞中的表达及其抗口蹄疫病毒活性的研究

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中国兽医科学 2023年第2期53卷 143-149页

作者：王凌云郝荣增茹毅常辉杨洋李亚军张丽伟卢炳州刘艳红龚真莉井波齐萌郑海学塔里木大学动物科学与技术学院新疆阿拉尔843300 中国农业科学院、兰州兽医研究所、家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046

构建猪IFN-β重组真核表达质粒pcDNA3.1-PoIFN-β,转染悬浮培养的CHO细胞,进行上清分泌表达;通过CHO细胞表达系统,成功分泌表达和制备纯化的rPoIFN-β。通过CCK-8试验,分析rPoIFN-β对细胞的毒性,结果显示纯化的rPoIFN-β对细胞无明显毒... 详细信息

构建猪IFN-β重组真核表达质粒pcDNA3.1-PoIFN-β,转染悬浮培养的CHO细胞,进行上清分泌表达;通过CHO细胞表达系统,成功分泌表达和制备纯化的rPoIFN-β。通过CCK-8试验,分析rPoIFN-β对细胞的毒性,结果显示纯化的rPoIFN-β对细胞无明显毒性;采用VSV/PK-15系统检测rPoIFN-β抗病毒活性效价,结果显示其抗病毒活性效价为4.54×10^(7)U/mg;制备的rPoIFN-β可显著抑制O型和A型FMDV在PK-15细胞的复制,表现出较强的抗病毒活性;通过分析rPoIFN-β对细胞ISGs的诱导作用,发现rPoIFN-β能够显著刺激12种ISGs的表达。研究结果表明,本试验制备纯化的rPoIFN-β具有较低的细胞毒性和较高的抗病毒活性效价,为口蹄疫防控制剂的开发和研究提供了基础数据。

关键词：猪IFN-β CHO细胞蛋白表达抗病毒活性口蹄疫病毒

代谢相关酶过表达对CHO细胞瞬时表达anti-h LAG3的影响

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生物工程学报 2021年第1期37卷 312-320页

作者：刘立苹杨昭沈宗毅喻长远北京化工大学生命科学与技术学院北京100029

为提高CHO细胞重组蛋白表达量,对比研究了过表达代谢相关酶丙酮酸羧化酶(PYC2)、苹果酸酶Ⅱ(MDH2)、丙氨酸转氨酶1(ALT1)、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、氨基甲酰磷酸合成酶Ⅰ(CPSⅠ)和代谢相关蛋白牛磺酸转运蛋白(TAUT)及透明颤菌血红蛋白(V... 详细信息

为提高CHO细胞重组蛋白表达量,对比研究了过表达代谢相关酶丙酮酸羧化酶(PYC2)、苹果酸酶Ⅱ(MDH2)、丙氨酸转氨酶1(ALT1)、鸟氨酸转氨甲酰酶(OTC)、氨基甲酰磷酸合成酶Ⅰ(CPSⅠ)和代谢相关蛋白牛磺酸转运蛋白(TAUT)及透明颤菌血红蛋白(VHb)对Expicho-S瞬时表达anti-hLAG3的影响。结果表明,过表达上述7种蛋白均能不同程度提高抗体产量。其中,过表达OTC、CPSI、MDH2和PYC2分别能够使Expicho-S抗体产量提高29.2%、27.6%、24.1%和20.3%。并且,过表达OTC和MDH2能够明显提高细胞培养初期的抗体生产速率,提前4 d达到与对照组相近的抗体产量。过表达OTC和MDH2对anti-hLAG3对抗原的亲和力基本无影响。大多数情况下,7种蛋白对细胞生长基本无影响。此外,过表达MDH2和ALT1同样能够提高H293T细胞的抗体产量。总的来说,代谢相关蛋白的过表达可以应用于瞬时表达系统,提高哺乳动物细胞的抗体产量。

关键词：代谢相关酶 CHO细胞瞬时表达 anti-hLAG3 细胞工程

重组人血清白蛋白在CHO细胞中的高效表达及其培养工艺优化

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中国生物制品学杂志 2023年第9期36卷 1054-1061,1071页

作者：牛宇辉李洪珊李殿玉吴贝李向茸冯若飞西北民族大学生物医学研究中心生物工程与技术国家民委重点实验室甘肃兰州730030 西北民族大学生命科学与工程学院甘肃兰州730030

目的在中国仓鼠卵巢(cho)细胞中高效表达人血清白蛋白(human serum albumin,HSA),并优化其培养工艺,为HSA的规模化生产奠定基础。方法利用基因重组技术构建HSA的真核表达载体,并将其电转染至全悬浮CHO细胞中,利用G418及有限稀释法筛选... 详细信息

目的在中国仓鼠卵巢(cho)细胞中高效表达人血清白蛋白(human serum albumin,HSA),并优化其培养工艺,为HSA的规模化生产奠定基础。方法利用基因重组技术构建HSA的真核表达载体,并将其电转染至全悬浮CHO细胞中,利用G418及有限稀释法筛选获得可稳定高表达HSA的单克隆细胞株,通过在基础培养基中添加葡萄糖、丁酸钠及补料培养基等方式进行细胞培养工艺优化,以提高HSA表达量;最终在5 L生物反应器上进行放大培养验证。结果成功构建了重组表达质粒pcDNA3.1-HSA,并在全悬浮CHO细胞中实现分泌表达后,又经过2次单克隆筛选,获得高表达HSA的2次单克隆细胞株cho-rHSA-7H2A9和cho-rHSA-7H2D12,表达量分别达到29.37和25.26 mg/L;通过培养工艺优化使HSA表达量达到100.00 mg/L左右;最终使5 L生物反应器上HSA表达量提升至166.16 mg/L,与第1次单克隆细胞上清中HSA表达量相比,提高了30倍左右。结论实现了HSA在CHO细胞中的高效表达,为进一步在生物制品领域规模化生产HSA及解决市场供应问题奠定了基础。

关键词：重组人血清白蛋白 CHO细胞高效表达

表达长效生长激素的CHO细胞培养工艺的优化及放大

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中国生物制品学杂志 2022年第2期35卷 209-214,227页

作者：梁久佳刘玉林刘涵俞露张凯宁刘景会李利长春生物制品研究所细胞因子室吉林长春130012 长春理工大学生命科学学院吉林长春130022

目的在NewBrunSwick31014 L生物反应器中培养表达重组人长效生长激素(recombinant human growth hormone Fc fusion protein,rhGH-Fc)的CHO细胞,优化工艺参数以提高表达量,并进行NewBrunSwick31014 L到New-BrunSwick51040 L生物反应器的工艺放大。方法在原有14 L培养工艺基础上,调节转速、通气速率等参数,并对参数调整时期进行工艺优化。通过对渗透压、乳酸、铵离子、钾离子等代谢过程产物的检测来确保代谢正常,利用HPLC法测定表达量。再根据经验公式算出可线性放大的体积依赖型参数,保持原有培养方案及补料策略不变的情况下,结合不同放大经验方法确定操作窗口,从而进行工艺放大。结果14 L生物反应器优化工艺乳酸累积量低于20 mmol/L、最终铵离子累积量为8 mmol/L、钾离子累积量为14 mmol/L、渗透压为425 osmol/kg,降温后比耗糖速率为0.12 g/(10^(9) cells·d),表达量为0.9 g/L。经检测,放大至40 L生物反应器,整个培养过程耗糖曲线及代谢产物均与14 L生物反应器中一致,表达量为1.0 g/L。结论成功优化了rhGH-Fc工程细胞大规模培养的工艺,并进行了规模放大,为rhGH-Fc的后续开发奠定了基础。

关键词：生长激素 Fc融合蛋白 CHO细胞生物反应器工艺放大

CHO细胞强化流加培养过程的理性设计与建立

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中国生物工程杂志 2023年

作者：苏影张炜坚万宇翔沈天放张欣然张如悦谭文松赵亮上海倍谙基生物科技有限公司海正药业杭州有限公司华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室

目的：由于强化流加培养工艺（intensified fed batch of ultra-high seeding density，uHSD-IFB）的接种密度与运行密度较高，传统低密度培养工艺的流加策略往往不能提供充足的营养物质用于该过程的细胞维持与产物表达，最终导致过程... 详细信息

目的：由于强化流加培养工艺（intensified fed batch of ultra-high seeding density，uHSD-IFB）的接种密度与运行密度较高，传统低密度培养工艺的流加策略往往不能提供充足的营养物质用于该过程的细胞维持与产物表达，最终导致过程产率低、经济性下降；通过优化流加培养基以及补料方案，成功建立CHO细胞强化流加培养基过程，从而提高目的蛋白产量。方法：以一株表达单克隆抗体的cho-K1细胞株为研究对象，通过代谢动力学与化学计量学分析，设计出以葡萄糖为控制模型的两阶段动态反馈流加策略，并结合实验设计（design of experiment，DoE）筛选并优化流加培养基中关键微量元素的营养浓度。结果：优化设计后的uHSD-IFB过程有效缓解了uHSD-IFB过程营养物质的耗竭与代谢副产物累积之间的矛盾，实现了超高接种密度培养工艺的细胞生长与产物合成的目的；累积产量相较于优化前提高了95%，日体积产量提高了约97%。结论：该补料策略有助于快速建立高细胞密度、高产物表达的高接种密度强化流加培养过程。

关键词： CHO细胞过程强化动态反馈流加理性设计葡萄糖控制模型

稳定表达猪δ冠状病毒S1蛋白CHO细胞系的构建与鉴定

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河南农业科学 2023年第6期52卷 131-138页

作者：孙雪珂丁培阳王思桥刘思源李明慧常泽杰陈艺兰李瑞琪张改平河南农业大学生命科学学院河南郑州450002 河南省农业科学院动物免疫学重点实验室河南郑州450002 郑州大学生命科学学院河南郑州450001 江苏高校动物重要疾病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

为构建稳定表达猪δ冠状病毒(PDCoV)S1蛋白的CHO细胞系,利用电转染技术将重组质粒pCGS3-S1转染至CHO细胞,通过有限稀释法筛选稳定表达重组S1蛋白的单克隆细胞系。利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析方法对重组S1蛋白进行纯化,采用间接EL... 详细信息

为构建稳定表达猪δ冠状病毒(PDCoV)S1蛋白的CHO细胞系,利用电转染技术将重组质粒pCGS3-S1转染至CHO细胞,通过有限稀释法筛选稳定表达重组S1蛋白的单克隆细胞系。利用阴离子交换层析和凝胶过滤层析方法对重组S1蛋白进行纯化,采用间接ELISA方法检测重组S1蛋白活性。将纯化的重组S1蛋白免疫BALB/c小鼠,通过间接ELISA、间接免疫荧光试验(IFA)及病毒中和试验对重组S1蛋白免疫原性进行检测。结果显示,稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO细胞系成功建立,并获得了纯度高于90%、产量为28.5 mg/L的重组S1蛋白;且重组S1蛋白与PDCoV阳性血清反应性良好,具有良好的免疫原性,中和效价为1∶128。综上,成功建立了稳定表达PDCoV S1蛋白的CHO细胞系,且纯化获得的重组S1蛋白具有良好的生物学活性。

关键词：猪δ冠状病毒 S1蛋白 CHO细胞稳定表达蛋白质纯化

酵母抽提物FM888对CHO细胞生长的影响

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中国生物制品学杂志 2022年第10期35卷 1184-1190页

作者：万莹铚李秋霞张宏岐邹坤肖萌伍业旭张松邓锐三峡大学生物与制药学院三峡大学天然产物研究与利用湖北省重点实验室湖北宜昌443002 三峡大学医学院湖北宜昌443002 安琪酵母股份有限公司湖北宜昌443003 湖北宏裕新型包材股份有限公司湖北宜昌443000

目的探讨酵母抽提物(yeast extract,YE)FM888对CHO细胞生长的影响。方法以cho悬浮细胞为研究对象,在EmCD cho® Medium培养基中分别添加1、2、3、5 g/L的FM888,进行摇瓶批式培养,台盼蓝拒染法和细胞计数仪测定活细胞密度和细胞活率。... 详细信息

目的探讨酵母抽提物(yeast extract,YE)FM888对CHO细胞生长的影响。方法以cho悬浮细胞为研究对象,在EmCD cho® Medium培养基中分别添加1、2、3、5 g/L的FM888,进行摇瓶批式培养,台盼蓝拒染法和细胞计数仪测定活细胞密度和细胞活率。用添加1、2 g/L FM888的EmCD cho® Medium培养基培养CHO细胞,生化分析仪检测细胞的生化代谢(葡萄糖、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸和铵根离子的含量)情况;采用相应试剂盒检测乳酸脱氨酶(lactate dehydrogenase,LDH)、肌酸激酶(creatine kinase,CK)、谷丙转氨酶(alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate aminotransferase,AST)的活力;流式细胞术检测细胞的周期分布及凋亡情况。结果培养基中加入1、2 g/L的FM888可促进CHO细胞生长,确保培养过程中维持较高活细胞密度和细胞活率;CHO细胞培养前期,葡萄糖、乳酸和铵根离子在培养体系中的浓度均高于空白对照组(未添加FM888),谷氨酰胺低于空白对照组,能够促进细胞代谢活动,培养后期逐渐下降;可减少细胞损伤及CHO细胞酶的释放;可增加CHO细胞S期的比例,促进细胞增殖;可降低CHO细胞凋亡率。结论培养基中添加1、2 g/L的FM888能促进CHO细胞的生长、代谢和增殖,并维持较高的细胞活力。

关键词：酵母抽提物FM888 CHO细胞细胞代谢细胞增殖

稳定表达猪流行性腹泻病毒S蛋白的CHO细胞系的构建

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中国动物传染病学报 2023年

作者：贺笋季春辉张慧敏唐慧芬肖升东杜久斌天康制药股份有限公司

为构建稳定表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的CHO细胞系，为PEDV的诊断及亚单位疫苗的构建提供材料，本研究对PEDV S基因进行了遗传进化分析后将其插入UCOE-mu-p真核表达载体并通过脂质体转染法将其整合到CHO细胞基因组中，利用两轮嘌... 详细信息

为构建稳定表达猪流行性腹泻病毒(PEDV)S蛋白的CHO细胞系，为PEDV的诊断及亚单位疫苗的构建提供材料，本研究对PEDV S基因进行了遗传进化分析后将其插入UCOE-mu-p真核表达载体并通过脂质体转染法将其整合到CHO细胞基因组中，利用两轮嘌呤霉素加压筛选出稳定表达的PEDV S蛋白单克隆细胞系。同时利用SDS-PAGE、Western blot、HPLC和病毒中和实验对表达产物进行检测和鉴定。结果显示：筛选出的高表达细胞系在1至15代均表达稳定，且在此期间的表达量保持在0.61 g/L，SDS-PAGE、Western blot和HPLC结果均与预期相符，病毒中和实验结果显示免疫1月龄仔猪后中和抗体水平达到1：60，为PEDV的诊断及亚单位疫苗的构建奠定基础。

关键词：猪流行性腹泻病毒 CHO细胞 S蛋白单克隆细胞系免疫原性