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NAT10 promotes cell proliferation by acetylating cep170 mRNA to enhance translation efficiency in multiple myeloma

Acta Pharmaceutica Sinica B 2022年第8期12卷 3313-3325页

作者： Rongfang Wei Xing Cui Jie Min Zigen Lin Yanyan Zhou Mengjie Guo Xiaojuan An Hao Liu Siegfried Janz Chunyan Gu Hongbo Wang Ye Yang Nanjing Hospital of Chinese Medicine Affiliated to Nanjing University of Chinese Medicine Nanjing 210022China School of Pharmacy Key Laboratory of Molecular Pharmacology and Drug Evaluation(Yantai University)Ministry of EducationCollaborative Innovation Center of Advanced Drug Delivery System and Biotech Drugs in Universities of ShandongYantai UniversityYantai 264005China School of Medicine&Holistic Integrative Medicine Nanjing University of Chinese MedicineNanjing 210023China Department of Hematology Affiliated Hospital of Shandong University of Traditional Chinese MedicineJinan 250014China Division of Hematology and Oncology Medical College of WisconsinMilwaukeeWI 53226USA Bohai Rim Advanced Research Institute for Drug Discovery Yantai 264003China

Multiple myeloma(MM) is still an incurable hematologic malignancy, which is eagerly to the discovery of novel therapeutic targets and methods. N-acetyltransferase 10(NAT10) is the first reported regulator of mRNA acetylation that is activated in many cancers. However, the function of NAT10 in MM remains unclear. We found significant upregulation of NAT10 in MM patients compared to normal plasma cells, which was also highly correlated with MM poor outcome. Further enforced NAT10 expression promoted MM growth in vitro and in vivo, while knockdown of NAT10 reversed those effects. The correlation analysis of acetylated RNA immunoprecipitation sequencing(ac RIP-seq) and ribosome profiling sequencing(Ribo-seq) combined with RIP-PCR tests identified centrosomal protein 170(cep170) as an important downstream target of NAT10. Interfering cep170 expression in NAT10-OE cells attenuated the acceleration of cellular growth caused by elevated NAT10. Moreover,cep170 overexpression promoted cellular proliferation and chromosomal instability(CIN) in ***, remodelin, a selective NAT10 inhibitor, suppressed MM cellular growth, induced cellular apoptosis in vitro and prolonged the survival of 5TMM3VT mice in vivo. Collectively, our data indicate that NAT10 acetylates cep170 mRNA to enhance cep170 translation efficiency, which suggests that NAT10 may serve as a promising therapeutic target in MM.

关键词： Multiple myeloma Target NAT10 Acetylation cep170 Chromosomal instability Translation Remodelin

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1q43区域SNP与支气管肺发育不良相关的分子机制研究

1q43区域SNP与支气管肺发育不良相关的分子机制研究

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作者：高静陕西师范大学

学位级别：硕士

支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是一种常见的慢性肺部疾病,以初期肺损伤为主要特征,其发生率与新生儿出生体重、胎龄呈负相关关系。随着医疗技术迅速发展,早产儿存活率提高,BPD发生率也随之升高,即使投入了大量临床... 详细信息

支气管肺发育不良(bronchopulmonary dysplasia,BPD)是一种常见的慢性肺部疾病,以初期肺损伤为主要特征,其发生率与新生儿出生体重、胎龄呈负相关关系。随着医疗技术迅速发展,早产儿存活率提高,BPD发生率也随之升高,即使投入了大量临床和分子研究,BPD发病率仍无明显好转,这也已经成为临床上一个非常棘手的问题。BPD的发病因素主要有早产、肺发育不成熟、机械通气、遗传、感染和营养不良等多种因素,其中遗传因素占50%以上。人类可遗传变异中单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)是最为常见的一种,占已知遗传多态性的90%以上。应用全基因组关联分析(genome wide association study,GWAS)发现人类基因组1q43区域中 SNP标记rs2105146 位于中心体蛋白基因cep1 70(centronsomal protein 170KD)的内含子区,与BPD密切相关。但GWAS也有一定的局限性,所发现的rs2105146只是标签SNP,真实致病位点往往不是标签SNP,而是与之连锁的其他位点,并且GWAS也无法揭示所发现变异的致病机制。本研究在GWAS的基础上,运用等位基因差异表达(allele-specific expression,ASE)直接确定顺式调控因素SNP对cep1 70表达是否存在影响,通过染色质构象捕获技术、双荧光报告检测、染色质免疫沉淀技术和转录因子过表达等多种功能基因组学手段确定人类基因组1q43区域中BPD的真实致病位点和致病机制。主要结果如下:(1)利用千人基因组计划数据分析IBS(Iberian Population in Spain)群体中与rs2105146连锁的SNP位点,发现共有71个连锁SNP。进一步分析东亚人群,发现 CHB(Han Chinese in Beijing)和JPT(Japanese in Tokyo)群体也具有类似的连锁模式。这些SNP 中,rs6701379位于cep1 70基因的3’-UTR区(3’untranslated region),其他SNP位点均位于非编码区。(2)应用ASE分析编码区SNP rs6701379的结果显示48个肺部组织样品中有12个为杂合子个体,并且A等位基因的表达量显著低于G的表达量(P=0.000002),表明rs6701379或与其连锁的位点可顺式调控cep170的表达。(3)运用染色质构象捕获技术(3C-qPCR)筛选与cep170启动子区存在相互作用的基因组片段,共发现了4个与cep1 70存在相互作用的基因组片段,其上存在8个 SNP(rs6429410、rs12406630、rs12406654、rs200997665、rs151302646、rs75388769、rs74651335和rs1766026),可能通过改变增强子活力影响cep170表达。(4)通过构建pGL3-promoter-SNP重组质粒,定点突变SNP位点和双荧光报告检测等实验证明了rs1766026、rs12406654、rs200997665、rs75388769和rs151302646等5个位点是功能性突变,且这些位点位于非编码区,通过增强子模式调控基因的表达。(5)运用染色质免疫沉淀技术确定了rs1766026、rs12406654、rs200997665和rs151302646 分别位于转录因子CUX1(cut like homeobox 1)、TBX20(T-box transcription factor 20)、HNF4A(hepatocyte nuclear factor 4 alpha)和CUX1的DNA结合区域。(6)通过构建和转染转录因子pEGFP-N1过表达载体以及双荧光报告检测实验确定了转录因子CUX1、TBX20、HNF4A和CUX1过表达可以调控目标基因表达。其中TBX20对基因表达呈负相关作用,抑制基因的表达。本研究通过探讨1q43区域的SNP对BPD易感基因cep170的调控机制,为进一步阐明BPD的发生、发展机制提供了新方向。对于新功能性位点的确定,可为BPD诊断、预防和治疗提供新的依据。此外,本研究通过应用ASE和3C-qPCR技术研究基因组功能区域,提供了一个良好的范例。

关键词：支气管肺发育不良等位基因差异表达 cep170 增强子单核苷酸多态性

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BUB1B通过中心体分离途径引起多发性骨髓瘤增殖机制研究

BUB1B通过中心体分离途径引起多发性骨髓瘤增殖机制研究

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作者：钟思霞南京中医药大学

学位级别：硕士

多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)是一种血液系统恶性浆细胞肿瘤性疾病,其特征为单克隆免疫球蛋白及骨髓浆细胞异常增生,主要在肾脏、心脏及肝脏等器官内累积。多发性骨髓瘤常伴有多发性溶骨性损害、高钙血症、贫血、肾脏损害。随着... 详细信息

多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)是一种血液系统恶性浆细胞肿瘤性疾病,其特征为单克隆免疫球蛋白及骨髓浆细胞异常增生,主要在肾脏、心脏及肝脏等器官内累积。多发性骨髓瘤常伴有多发性溶骨性损害、高钙血症、贫血、肾脏损害。随着近些年多发性骨髓瘤的发病率居高不下,治疗MM的新疗法大量涌现,包括一般治疗,造血干细胞移植,放疗和化疗。化疗其中包括(靶向药物如蛋白酶体抑制剂(硼替佐米、卡非佐米)和免疫调节剂等;糖皮质激素如地塞米松、强的松等)。尽管对于MM患者的治疗取得重大进展,但由于恶性肿瘤具有复发、转移、耐药的特性,导致当前阶段MM患者预后不良。因而对于多发性骨髓瘤的研究刻不容缓。本课题前期通过高通量筛选出与MM患者疾病的发生发展存在密切联系的BUB1B基因(BUB1有丝分裂检查点丝/苏氨酸激酶B,BUB1 Mitotic Checkpoint Serine/Threonine Kinase B)。并且通过基因芯片技术、MM患者临床数据以及HOVON数据库等,证实BUB 1B基因与MM患者疾病的发生发展密切联系。因而课题的开展由此进行,首先通过构建BUB1BOE和BUB1BKD的稳转细胞株,通过MTT实验、流式细胞术研究BUB1B过表达和敲低对多发性骨髓瘤细胞活性、周期的影响。实验结果发现BUB1BOE/BUB1BKD+Dox(多西环素诱导后的BUB1BKD)会促进/抑制细胞增殖,BUB1BOE/BUB1BKD+Dox会延长/缩短有丝分裂G2/M期的占比。以上结果只能说明在表型研究中BUB1B作为促癌基因在MM细胞中发挥作用,其具体机制并不明了。在上述研究的基础上,基于BUB1B基因是参与细胞周期有丝分裂染色体分离相关,因而通过外显子测序、吉姆萨染色、免疫荧光等方法检测BUB1B的过表达对染色体不稳定性(Chromosomal instability,CIN)和耐药的影响。通过Co-IP实验探究BUB1B蛋白与上下游蛋白质之间的相关性。实验结果发现外显子测序、吉姆萨染色、免疫荧光实验显示BUB1BOE相对于BUB1BWT细胞株,其DNA拷贝数缺失、重复和错配增加,细胞核型改变,染色体不稳定性增加。同时证明在硼替佐米、阿霉素的干预下,BUB1BOE细胞株的耐受性增强。Western blot、Co-IP实验结果发现BUB1B蛋白表达与中心体相关蛋白cep250、cep 170表达呈正相关,BUB1B蛋白与中心体蛋白cep170和中心体蛋白cep250相互作用。CIN是肿瘤发生发展的主要诱因,但骨髓微环境(环状RNA、外泌体、miRNAs等)之间的相互调控在多发性骨髓瘤中扮演着重要的角色。基于上述对于BUB1B的相关研究,加上近年来对于环状RNA的研究尤为热门,因此本课题对于BUB1B环状RNA展开研究。课题组前期通过环状RNA芯片筛选发现,正常人浆细胞表达的BUB1B环状RNA低于多发性骨髓瘤患者,为了进一步探究BUB1B环状RNA在多发性骨髓瘤中所发挥的作用。本课题通过 RT-PCR、qRT-PCR 等实验探究 BUB1B 环状 RNA(Hasirc034565、Hasirc034566、Hasirc034567)在多发性骨髓瘤中RNA水平上的表达,发现只有BUB1B环状RNA(Hasirc034566)在RNA水平上有表达,因而选取BUB1B环状RNA(Hasirc034566)作为研究对象。电穿孔实验、Western blot、蛋白质谱、MTT实验、吉姆萨染色以及免疫荧光实验探究BUB1B环状RNA(Hasirc034566)是否在蛋白水平上有表达且在MM细胞中表型的研究。实验结果显示BUB1B环状RNA(Hasirc034566)细胞株具有蛋白翻译的能力,MTT实验、吉姆萨染色以及免疫荧光实验表明BUB1B环状RNA(Hasirc034566)过表达会促进MM细胞株的增殖,导致细胞核型的改变以及增强CIN。综上所述,本论文通过探究BUB1B在多发性骨髓瘤细胞中发挥的作用,揭示BUB1B基因作用于MM细胞的相关机制;同时对于多发性骨髓瘤的骨髓微环境(BUB1B环状RNA)的相互调控作用进行研究,探寻线性BUB1B和BUB1B环状RNA作用于MM机制的共通性,为后期进一步研究BUB1B如何具体调控MM细胞提供基础。

关键词：多发性骨髓瘤 BUB1B 染色体不稳定性环状RNA cep170

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