检索结果-南通市图书馆

生物工程学报 2021年第1期37卷 178-186页

作者：卜研闫喜军赵建军李海涛赵传芳薛向红中国农业科学院特产研究所吉林长春130122

以国内商品化水貂犬瘟热病毒疫苗所用毒株cdv-3为模板,构建犬瘟热病毒感染性c DNA克隆,为犬瘟热病毒新型疫苗研制、致病机理研究提供理论基础。设计13对引物对其全基因组序列测定,分析单一酶切位点,将cdv-3的全长分5个片段进行RT-PCR扩... 详细信息

以国内商品化水貂犬瘟热病毒疫苗所用毒株cdv-3为模板,构建犬瘟热病毒感染性c DNA克隆,为犬瘟热病毒新型疫苗研制、致病机理研究提供理论基础。设计13对引物对其全基因组序列测定,分析单一酶切位点,将cdv-3的全长分5个片段进行RT-PCR扩增。经酶切拼接,将5个片段顺次插入到酶切位点改造后的真核载体pc DNA3.2的多克隆酶切位点处,同时在F1首端和F5末端分别加入锤头状核酶和丁型肝炎核酶序列,获得cdv-3株的全长c DNA质粒(pcDNA3.2-cdv-3)。构建表达cdv-3 N、P、L蛋白的3个辅助质粒。利用转染试剂LipofectamineTM 2000将全长质粒和3个辅助质粒共转染293T细胞,3 d后,将上清接种到Vero细胞。观察犬瘟热病毒典型合胞体病变,对重组病毒进行免疫荧光鉴定和标签鉴定。最后,比较wtcdv-3和rcdv-3的生长特性。全长质粒和辅助质粒的酶切鉴定和序列测序均正确。拯救的重组病毒能在Vero细胞上形成典型的合胞体病变,经RT-PCR、间接免疫荧光和电镜观察鉴定,证明成功拯救出重组病毒rcdv-3株。rcdv-3的病毒滴度最高达到107.667 TCID50/mL,比wtcdv-3的滴度106.667 TCID50/mL高出约10倍。rcdv-3感染Vero细胞后,迅速大量增殖,于感染后36 h达到最高病毒滴度。而wt cdv-3增殖平缓,感染后72 h时病毒含量达到最大。文中建立的高效cdv-3株反向遗传操作平台,为犬瘟热病毒新型疫苗研制和致病机理研究奠定基础。

关键词：犬瘟热病毒 cdv-3株感染性克隆反向遗传系统

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