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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2010年第8期38卷 33-39页

作者：张亚杰宋豪李艳丽孙柏孙岩张德礼西北农林科技大学动物医学院病毒免疫与生物信息研究室陕西杨凌712100

【目的】克隆猪细胞周期蛋白激酶9(cdk9)基因,观察该基因过表达对猪脐静脉血管内皮细胞(SU-VEC)周期的影响。【方法】采用电子克隆方法筛选得到猪cdk9基因全长序列,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析。利用RT-PCR方法从猪脾脏中扩增... 详细信息

【目的】克隆猪细胞周期蛋白激酶9(cdk9)基因,观察该基因过表达对猪脐静脉血管内皮细胞(SU-VEC)周期的影响。【方法】采用电子克隆方法筛选得到猪cdk9基因全长序列,并对其编码的蛋白进行生物信息学分析。利用RT-PCR方法从猪脾脏中扩增出包含完整开放读码框架(ORF)的cdk9 cDNA片段,将其与真核表达载体pEGFP-C1连接,构建重组真核表达载体pEGFP-cdk9。将pEGFP-cdk9以脂质体介导法转染至SUVEC细胞,采用绿色荧光标记和Western blot检测SUVEC细胞中cdk9基因的表达,用流式细胞仪检测转染cdk9基因后SUVEC细胞周期的变化。【结果】得到猪cdk9基因全长1820bp的cDNA序列,其ORF为1119bp,编码372个氨基酸;cdk9分子质量为42.76ku,等电点为9.04;cdk9基因定位于猪的1号染色体上。酶切和测序结果证明,重组真核表达载体pEGFP-cdk9构建成功。pEGFP-cdk9转染SUVEC细胞48h后,荧光显微镜和Western blot检测到目的基因序列在SUVEC细胞中成功表达;试验组各期SUVEC细胞比例与空载体组相比,差异无统计学意义(P>0.05),细胞周期未发生显著变化。【结论】克隆了猪cdk9基因,并在SUVEC细胞中成功进行了表达。cdk9基因的过表达未引起细胞周期发生显著变化,其可能并不参与细胞周期的调控。

关键词： cdk9基因猪真核表达细胞周期

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H3N2和H1N1甲型流感病毒感染对猪cdk9基因表达的影响

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西北农林科技大学学报（自然科学版） 2013年第10期41卷 14-18页

作者：李登云孙岩蒋鹏飞亢展展王静娜华琳琳张洋张德礼西北农林科技大学动物医学院病毒免疫与生物信息研究室陕西杨凌712100

【目的】研究H3N2和H1N1甲型流感病毒感染对仔猪肺脏cdk9基因表达的影响,揭示流感发病机制与cdk9基因的相关性。【方法】以接种PBS的仔猪为空白对照,利用实时荧光定量PCR技术和半定量免疫组织化学法,检测H3N2和H1N1甲型流感病毒接种感... 详细信息

【目的】研究H3N2和H1N1甲型流感病毒感染对仔猪肺脏cdk9基因表达的影响,揭示流感发病机制与cdk9基因的相关性。【方法】以接种PBS的仔猪为空白对照,利用实时荧光定量PCR技术和半定量免疫组织化学法,检测H3N2和H1N1甲型流感病毒接种感染7d后,仔猪肺脏cdk9的mRNA和蛋白表达的变化,并在电子显微镜下观察cdk9阳性细胞的定位。【结果】实时荧光定量PCR检测表明,H3N2和H1N1甲型流感病毒感染仔猪7d后,肺脏组织内cdk9基因mRNA的相对表达量分别为0.42和0.36,与对照(1.0)相比显著降低(Pcdk9蛋白的相对表达水平分别为31.4和38.7,较正常组织(61.4)显著降低(Pcdk9阳性细胞散在分布于终末细支气管和肺泡内,且胞核着色较深,但是细胞整体着色变浅。【结论】受到流感病毒感染后,仔猪肺脏组织内cdk9表达量降低,可能是RNApolⅡ磷酸化水平降低的原因之一。

关键词：流感病毒 cdk9基因实时荧光定量PCR 免疫组织化学

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H3N2和H1N1甲型流感病毒感染对猪cdk9和PKR基因表达的影响

H3N2和H1N1甲型流感病毒感染对猪CDK9和PKR基因表达的影响

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作者：孙岩西北农林科技大学

学位级别：硕士

流行性感冒是由一种急性呼吸道传染病,由流感病毒引起。甲型流感病毒属为正粘病毒科,容易发生基因重组,根据血凝素和神经氨酸酶的不同,又分为16个H亚型和9个N亚型。甲型流感病毒属中有H1N1、H2N2、H3N2和H5N1病毒曾经广泛流行,导致不同... 详细信息

流行性感冒是由一种急性呼吸道传染病,由流感病毒引起。甲型流感病毒属为正粘病毒科,容易发生基因重组,根据血凝素和神经氨酸酶的不同,又分为16个H亚型和9个N亚型。甲型流感病毒属中有H1N1、H2N2、H3N2和H5N1病毒曾经广泛流行,导致不同程度的感染和死亡。细胞周期依赖的蛋白激酶9(cdk9)与细胞周期蛋白组成P-TEFb复合物,可以使RNApolⅡ磷酸化。而流感病毒感染后磷酸化RNApolⅡ水平降低。双链RNA激活的蛋白激酶(PKR)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,人的流感病毒感染后会抑制PKR,使真核翻译起始因子-2( eIF-2)不能发生磷酸化,有助于蛋白合成和病毒复制。为研究H3N2和H1N1甲型流感病毒感染对猪cdk9和PKR基因表达的影响,揭示流感发病机制与两基因的相关性。本研究利用实时荧光定量PCR技术和免疫组化半定量法检测H3N2和H1N1甲型流感病毒感染168 h后猪肺脏组织内cdk9和PKR的mRNA和蛋白表达变化。具体研究内容与结果如下: 1、成功构建H3N2和H1N1甲型流感病毒感染仔猪动物模型。肺脏组织病理变化:终末细支气管单层纤毛柱状上皮细胞严重脱落,且终末细支气管周围肺泡隔增厚,肺泡腔缩小,甚至消失。 2、经实时荧光定量PCR检测表明,H3N2和H1N1甲型流感病毒感染仔猪168 h后肺脏组织内cdk9基因mRNA表达量明显降低。经免疫组化半定量法鉴定流感病毒感染后cdk9蛋白较正常组织蛋白表达水平低。 3、经实时荧光定量PCR检测表明,H3N2和H1N1甲型流感病毒感染仔猪168 h后肺脏组织内PKR基因mRNA表达量明显降低。经免疫组化半定量法鉴定流感病毒感染后PKR蛋白较正常组织蛋白表达水平低。 4、为在体外水平揭示猪P58对PKR的抑制作用,根据NCBI上猪PKR基因序列,设计引物,从猪淋巴结克隆得到目的片段,构建原核表达载体pGEX-PKR,筛选获得蛋白表达的最佳条件:0.2 mmol/L IPTG诱导6 h。这为后期纯化蛋白,做GST pull-down做好了铺垫。同时,构建真核表达载体pDsRed1-PKR,并瞬时转染SUVECs,为研究甲型流感病毒感染时PKR与P58的相互作用打下了基础。

关键词：甲型流感病毒属 cdk9基因 PKR基因表达

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