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苄达明抑制食管鳞癌增殖的机制研究

苄达明抑制食管鳞癌增殖的机制研究

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作者：周玉冰郑州大学

学位级别：硕士

背景和目的食管癌在组织病理学上分为食管鳞状细胞癌和食管腺癌。据估计,全世界共有45.6万食管鳞癌患者,其中约90%出现在东亚和中亚地区。由于发现较晚和低存活率,食管鳞状细胞癌是世界范围内癌症相关死亡的主要原因之一。目前,手术切... 详细信息

背景和目的食管癌在组织病理学上分为食管鳞状细胞癌和食管腺癌。据估计,全世界共有45.6万食管鳞癌患者,其中约90%出现在东亚和中亚地区。由于发现较晚和低存活率,食管鳞状细胞癌是世界范围内癌症相关死亡的主要原因之一。目前,手术切除、放疗和化疗的联合治疗是食管癌的主要治疗方法,然而,晚期食管鳞状细胞癌病人的5年生存率仍然低于15%,且治疗后的复发率很高。迄今为止,针对食管鳞状细胞癌的靶向治疗方法仍然缺乏。因此,寻找治疗食管鳞状细胞癌的有效药物十分迫切。化学预防是一种降低癌症发病和治疗后复发的新策略。在过去的几年中,临床用药由于其安全性和药效学特性被应用于化学预防。其中,一些非甾体抗炎药,如阿司匹林和布洛芬已被报道可应用于化学预防。通过筛选临床批准的药物,我们发现苄达明,可以抑制食管鳞癌细胞的增殖。苄达明作为一种非甾体抗炎药,具有局部麻醉和镇痛的特性。然而,其抗肿瘤活性及其潜在的分子机制尚未阐明。本研究中,通过蛋白质与磷酸化组学的分析,我们从体内外水平探究苄达明对食管鳞癌增殖的抑制作用并寻找苄达明作用的靶点和分子机制。方法1.苄达明对食管鳞癌细胞增殖的影响利用细胞毒性实验探究苄达明对正常食管上皮细胞,食管鳞癌细胞KYSE150和KYSE450的细胞毒性作用;通过生长实验探究苄达明对食管鳞癌细胞系KYSE150、KYSE450以及正常食管上皮细胞系增殖的抑制作用;使用软琼脂克隆形成实验评价苄达明对人食管鳞癌细胞系KYSE150和KYSE450的锚定非依赖生长的影响;利用平板克隆实验评价苄达明对人食管鳞癌细胞系KYSE150和KYSE450的克隆形成能力的抑制作用。2.磷酸化组学与蛋白质组学联合分析苄达明抗肿瘤的机制利用蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学分析苄达明处理后的食管鳞癌KYSE150细胞中磷酸化蛋白质组的变化,并结合生物信息学分析探索苄达明的作用靶点;用免疫印迹实验检测苄达明引起mcm2的磷酸化和mcm2及cdk2总蛋白水平的变化。3.苄达明诱导食管鳞癌细胞发生G1/S期阻滞且抑制DNA复制信号通路利用细胞周期实验检测不同浓度的苄达明(0、2.5、5、10、20μM)对食管鳞癌KYSE150和KYSE450细胞周期分布的影响;利用免疫荧光检测苄达明对食管鳞癌细胞KYSE150和KYSE450中mcm2与cdk2共定位的影响,以及对mcm2的荧光强度与cdk2和mcm2总荧光强度的影响;利用Western blotting实验检测苄达明对食管鳞癌细胞KYSE150和KYSE450中mcm2,c-Myc 和Rb 磷酸化水平和mcm2,c-Myc,Rb与cdk2蛋白水平的影响。4.苄达明与cdk2靶向结合并抑制其活性利用计算机分子对接模拟探究cdk2与苄达明的结合机制;通过分子下拉实验将与苄达明结合的Sepharose 4B珠子与食管鳞癌细胞KYSE150,KYSE450裂解液及cdk2纯蛋白共同孵育后,洗脱掉未结合的蛋白,利用免疫印迹法检测苄达明与cdk2激酶的结合效果;通过体外激酶实验检测不同浓度苄达明对cdk2激酶体外磷酸化mcm2过程的抑制作用。5.敲低cdk2可降低食管鳞癌细胞对苄达明的敏感性首先建立cdk2敲低的稳转细胞株,用慢病毒转染的食管鳞癌KYSE150和KYSE450细胞株后,借助蛋白质印迹实验检测转染效率;利用细胞生长实验,平板克隆实验及给予不同浓度苄达明处理的cdk2敲低后的细胞生长实验分别检测cdk2敲低后对食管鳞癌细胞KYSE150和KYSE450细胞增殖,克隆形成能力及药物作用效果的影响。6.苄达明可在体内抑制食管鳞癌的生长通过建立食管鳞癌人源性组织异种移植模型(patient-derived xenografts,pdx)在体内评价苄达明对食管鳞癌生长的抑制效果;利用免疫组织化学染色检测苄达明处理后移植瘤组织中蛋白磷酸化水平改变(Ki67,mcm2)。结果1.苄达明对食管鳞癌细胞增殖的影响不同浓度的苄达明(0、3.125、6.25、12.5、25、50、75、100μM)能够抑制食管鳞癌细胞KYSE150与KYSE450的存活,且呈剂量依赖性,而苄达明对永生化食管上皮细胞无明显毒性作用;不同浓度的苄达明(0、2.5、5、10、20μM)可以抑制食管鳞癌细胞KYSE150与KYSE450的生长,而对正常食管上皮细胞无显著的毒性作用,随着苄达明浓度的增加,其抑制食管鳞癌细胞生长的抑制作用更加明显;与对照组相比,不同浓度的苄达明(0、2.5、5、10、20μM)可降低食管鳞癌细胞KYSE150和KYSE450的克隆形成能力,且随着苄达明浓度的增加,其抑制食管鳞癌细胞的克隆形成能力的抑制作用更加明显。2.磷酸化蛋白质组学分析苄达明抗肿瘤的机制磷酸化蛋白质组学分析结果表明,苄达明能下调RNA转运、DNA复制、剪接体、铁死亡、内质网蛋白质加工5条信号通路,在DNA复制(DNA replication)通路中mcm

关键词：食管鳞癌苄达明磷酸化组学蛋白质组学 cdk2mcm2pdx

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