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作者：洪闪东北农业大学

学位级别：硕士

中度嗜盐菌(Moderately halophile)指的是在含有3-15%NaCl的条件下表现出最适生长的一个微生物类群。以往报道表明,很多中度嗜盐菌在具有高效耐盐能力的同时也具有高效耐碱能力。与一般非嗜盐菌相比,中度嗜盐菌中耐盐碱基因种类更多,其... 详细信息

中度嗜盐菌(Moderately halophile)指的是在含有3-15%NaCl的条件下表现出最适生长的一个微生物类群。以往报道表明,很多中度嗜盐菌在具有高效耐盐能力的同时也具有高效耐碱能力。与一般非嗜盐菌相比,中度嗜盐菌中耐盐碱基因种类更多,其耐盐碱分子遗传机制也更加复杂。动性球菌(Planococcus sp.) NEAU-ST10-9是本实验分离自松嫩平原盐碱地中的一株中度适盐菌,该菌株能够耐受10%的NaCl并能在pH12的碱性条件下生长。本研究借助大肠杆菌(Escherichia coli)Na+/H+逆向转运蛋白缺陷株KNabc(ΔnhaA, ΔnhaB, ΔchaA),采用基因文库筛选法与基因功能互补法相结合的技术,从动性球菌(Planococcus sp.) NEAU-ST10-9中筛选到一个长2712bp的具有Na+/H+逆向转运蛋白功能的DNA片段。序列分析显示,该片段包含3个完整的开放读码框(ORF1-3)以及各自的SD序列和推测的启动子。其中,ORF1长600bp,含有200氨基酸残基,与东海动性球菌(Planococcus donghaensis) MPA1U2中的一个推测蛋白(hypothetical protein)同源性最高(49%),其基因被命名为hyp;ORF2长531bp,含有177氨基酸残基,与嗜碱芽胞杆菌(Bacillus pseudofirmus) OF4中一个推测的TetR家族转录调控蛋白(TetR family transcriptional regulator)同源性最高(49%),其基因被命名为tetR;ORF3长918bp,含有306个氨基酸残基,与还原硒酸盐芽胞杆菌(Bacillus selenitireducens) MLS10中一个推测的阳离子扩散促进子家族转运蛋白(cation diffusion facilitator family transporter)同源性最高(43%),其基因被命名为cdffT。由于后者是在基因组测序的基础上通过同源比对分析推测的,因此,我们将ORF3与所有已鉴定的cdf家族成员进行同源性比对,包括枯草芽胞杆菌(B. subtilis)中的BszcD (*** No. AAB53029.1)、抗重金属富养罗尔斯通菌(Ralastonia metallidurans)中的RmzcD (*** No. YP45596.1)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的ScOT1(*** No. AAA74884.1)和ScRC1(*** No. NP13970.1)、大肠杆菌(E. coli)中的EcitB(*** No. AAC73839.1))和EcieF(*** ***18350.1),发现ORF3与EcitB、RmzcD、ScRC1、BszcD、ScOT1以及EcieF的同源性分别为17.2%、15.2%、14.3%、13.0%、12.9%和11.9%(图3-11)。既然ORF3与已鉴定的cdf家族成员的同源性非常低,那么cdffT应该是cdf家族中的一个新型蛋白。耐盐碱实验表明,cdffT基因能够提供大肠杆菌(***)KNabc对0.4MNaCl、10mM LiCl以及碱性pH8.0的抗性,这暗示cdffT基因具有Na+/H+逆向转运蛋白功能。我们测试了cdffT基因对二价金属离子的抗性。结果显示,在0.2-1.0mM ZnCl2或0.2-0.3mM CdCl2存在的条件下,与负对照KNabc/pEASY T3相比,KNabc/pEASY T3-cdffT均表现出了显著或极显著的抗性;而在0.5-1.0mM CoCl2存在的条件下,与负对照KNabc/pEASY T3相比,KNabc/pEASY T3-cdffT表现出一定抗性,但不显著。此外,在1.0mM ZnCl2、0.75mM CoCl2或0.25mM CdCl2存在的条件下,我们进一步测定了KNabc/pEASY T3-cdffT和负对照KNabc/pEASY T3的二价金属离子耐受生长曲线。结果进一步证实cdffT具有显著的Zn2+和Cd2+抗性,但不具有显著的C02+抗性。为了鉴定cdffT基因的功能,我们测试了cdffT的阳离子/氢离子逆向转运蛋白活性。结果显示,KNabc/pEASY T3-cdffT具有Na+(Li+, K+)/H+逆向转运蛋白活性,而负对照KNabc/pEASY T3不具有Na+(Li+, K+)/H+逆向转运蛋白活性,这表明cdffT基因具有Ng/H+

关键词：中度适盐菌 cdf家族 cdffT基因二价金属离子单价阳离子阳离子/氢离子逆向转运蛋白

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拟南芥cdf家族基因AtMTP6的功能研究

拟南芥CDF家族基因AtMTP6的功能研究

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作者：吴平治湖南师范大学

学位级别：硕士

cdf蛋白家族是最近发现的一个阳离子转运蛋白家族，在维持金属动态平衡和耐受方面起很重要的作用。拟南芥基因组测序完成后，序列分析表明拟南芥cdf家族至少由12个成员构成，命名为AtMTP1-12,本研究克隆AtMTP6并初步鉴定其功能。AtMTP6... 详细信息

cdf蛋白家族是最近发现的一个阳离子转运蛋白家族，在维持金属动态平衡和耐受方面起很重要的作用。拟南芥基因组测序完成后，序列分析表明拟南芥cdf家族至少由12个成员构成，命名为AtMTP1-12,本研究克隆AtMTP6并初步鉴定其功能。AtMTP6位于第二条染色体上，编码一个含有471aa的蛋白质，结构分析表明其具有cdf家族的一些共同特征，如C端有一个CE功能域、N端有一段信号序列，但与已鉴定的成员不同的是它只含有五个跨膜区。本研究包括克隆、鉴定生化及生理功能、描述亚细胞定位，并取得了以下结果： 1．通过RT-PCR克隆AtMTP6，测序结果显示其序列与AGI预测的序列完全一致。将AtMTP6基因的cDNA构建至原核表达载体pTrc99A，重组载体转化大肠杆菌突变株KAM3，平板上的结果表明，此基因的表达使细菌对Zn、EtBr更加敏感。 2．通过与绿色荧光蛋白(GFP)融合，在共聚焦显微镜下显示此蛋白定位于细胞器上，此结果与在线软件PSORT的预测结果比较一致，且预测AtMTP6很有可能定位于线粒体膜上。 3．为了研究AtMTP6的生理功能，过表达AtMTP6的转基因拟南芥、互补转基因拟南芥、纯合T-DNA敲除突变体和野生型四种材料同时在正常或胁迫的平板上进行表型观察，结果显示：过表达植株对EtBr更加敏感，可见AtMTP6可能从细胞质转运EtBr进入线粒体中，引起线粒体内EtBr的积累从而对细胞造成损害;四种材料生长于含不同浓度Zn的平板上时没发现什么表型;过表达植物的种子种皮颜色较浅且尺寸较小，可见AtMTP6可能与色素转运有关;在含有甘露醇的高渗平板上，过表达植物种子的萌发很明显被抑制，可见AtMTP6与渗透胁迫有关;在正常生长条件下，过表达植物开花要明显早于其它三个材料，表明AtMTP6可能参与调控或确定植物的开花时间。

关键词： AtMTP6 cdf家族拟南芥突变体

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多组学联合解析茶树响应锰、铝胁迫的机制及cdf家族的鉴定

多组学联合解析茶树响应锰、铝胁迫的机制及CDF家族的鉴定

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作者：张徐杨华中农业大学

学位级别：硕士

茶树[Camellia sinensis L.(O.)Ktze]是一种多年生常绿木本经济作物,具有喜铝、聚锰的特性;锰、铝元素对茶树生长发育的影响遵循“适量促进、过量抑制”的原则。近年来,茶园土壤酸化加剧,土壤中可溶性锰、铝渐增,然而茶树的生长发育并... 详细信息

茶树[Camellia sinensis L.(O.)Ktze]是一种多年生常绿木本经济作物,具有喜铝、聚锰的特性;锰、铝元素对茶树生长发育的影响遵循“适量促进、过量抑制”的原则。近年来,茶园土壤酸化加剧,土壤中可溶性锰、铝渐增,然而茶树的生长发育并未受到明显的影响,因此有必要深入研究茶树适应高浓度锰、铝环境的具体机制。本论文通过对水培茶树进行高浓度锰、铝组合处理,测定茶树叶片SPAD值、叶绿荧光参数、矿质元素及主要次生代谢成分含量变化,初步明确了锰、铝胁迫对茶树生理指标的影响;结合转录组与代谢谱,分析了高浓度锰、铝处理条件下茶树转录调控通路以及代谢产物变化,系统研究了茶树响应高浓度锰、铝的机理;全面鉴定了茶树cdf家族,并借助异源表达系统(酵母和拟南芥)对茶树CsMTP3/4/8.2这三个基因的功能进行解析。研究结果如下:1.在高浓度锰、铝条件下,茶树叶片SPAD值下降,叶绿荧光参数变化趋势不一致,茶多酚、游离氨基酸以及生物碱的含量均有不同程度的降低;儿茶素组分含量下降,其聚合物含量增多;黄酮(醇)糖苷类以及游离氨基酸组分含量变化趋势不一;有机酸、维生素类、糖类、核苷(酸)类以及其他的一些小分子化合物的含量也不同程度地受到影响。茶树鲜叶SPAD值、叶绿荧光参数以及次生代谢产物含量均受到了高浓度锰、铝的胁迫,且普遍存在着Mn+Al混合处理能够在一定程度上缓解锰或铝单一胁迫的现象。此外,茶树对于锰、铝元素的吸收与积累存在互作,高锰能够促进茶树对铝元素的吸收与累积,而高铝则会在一定程度上抑制茶树对锰的吸收与累积。在高浓度锰、铝胁迫下,茶树鲜叶中各类转运蛋白、转录因子以及热激蛋白等出现差异表达现象。2.共鉴定得到13个MTP家族基因:高浓度锰、锌、铁和铝处理条件下,CsMTPs在茶树新梢和根中的转录水平呈现出不同的变化趋势,其中,高浓度Al、Mn和Zn不同程度地诱导了 CsMTP3、CsMTP4和CsMTP8.2在茶树新梢和根中的转录。CsMTP3、CsMTP4和CsMTP8.2均定位于细胞质膜。过表达CsMTP3和CsMTP4均能够增强转基因拟南芥对于锌元素的吸收,且CsMTP3对于Zn的转运能力强于CsMTP4;过表达CsMTP3和CsMTP4能够在一定程度上增强转基因拟南芥对于高锰和高铝条件的耐受性;过表达CsMTP8.2能够增强植株对于高锰条件的耐受性。异源表达CsMTP3能够增强酵母对Zn和Mn的耐受性:异源表达CsMTP4能够增强酵母对Zn、Co、Ni的耐受性;异源表达CsMTP8.2能够增强酵母对Mn、Ni的耐受性,这表明CsMTP3、CsMTP4和CsMTP8.2的转运底物以及转运能力存在差异。

关键词：茶树土壤酸化锰铝 cdf家族功能解析

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拟南芥cdf家族基因AtMTP6编码一个锌离子转运蛋白

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生命科学研究 2006年第3期10卷 244-247页

作者：吴平治陈键栾升李东屏湖南师范大学生命科学学院中国湖南长沙410081

cdf家族蛋白在金属离子的动态平衡和耐受过程中起重要作用,拟南芥基因组序列分析表明,拟南芥中cdf家族至少由12个成员构成.本研究通过功能互补的方法研究其中的一个成员AtMTP6的功能.应用RT-PCR克隆得到其cDNA,克隆至pMD18-T载体并测序... 详细信息

cdf家族蛋白在金属离子的动态平衡和耐受过程中起重要作用,拟南芥基因组序列分析表明,拟南芥中cdf家族至少由12个成员构成.本研究通过功能互补的方法研究其中的一个成员AtMTP6的功能.应用RT-PCR克隆得到其cDNA,克隆至pMD18-T载体并测序,结果显示与AtMTP6的ORF序列一致.然后亚克隆至表达载体pTrc99A并转化至大肠杆菌突变株***诱导表达后进行功能互补分析,结果表明AtMTP6能转运锌离子进入KAM3,使细菌对高浓度的Zn2+更加敏感.

关键词：拟南芥 AtMTP6 cdf家族功能互补分析

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茶树锌转运蛋白基因CsMTP1的克隆和功能鉴定

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植物生理学报 2019年第11期55卷 1655-1663页

作者：张徐杨徐文鸾马梦君倪德江王明乐华中农业大学园艺林学学院园艺植物生物学教育部重点实验室武汉430070 咸宁市农业科学院湖北咸宁437100

阳离子扩散促进蛋白(cation diffusion facilitator protein,cdf)是一类重要的金属转运蛋白,对维持细胞中Zn、Fe和Mn等元素的动态平衡起着重要作用。本研究利用RT-PCR技术,从茶树中克隆得到1个cdf家族基因,命名为CsMTP1(GenBank登录号:M... 详细信息

阳离子扩散促进蛋白(cation diffusion facilitator protein,cdf)是一类重要的金属转运蛋白,对维持细胞中Zn、Fe和Mn等元素的动态平衡起着重要作用。本研究利用RT-PCR技术,从茶树中克隆得到1个cdf家族基因,命名为CsMTP1(GenBank登录号:MN061493)。该基因开放阅读框长度为1353 bp,编码450个氨基酸,蛋白质相对分子质量为49.20 kDa,理论等电点5.99;不稳定指数为38.68,属于稳定蛋白;N端序列保守性较低,C端序列保守性相对较高;与猕猴桃(Actinidia chinensis)和木薯(Manihot esculenta)的序列相似性较高;位于细胞质膜,共含有6个跨膜结构域。系统发育树分析表明,CsMTP1与山萮菜(Eutrema salsugineum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、菥蓂(Thlaspi arvense)和欧洲油菜(Brassica napus)的进化关系较近,属于Zn-cdf亚族。启动子分析发现,CsMTP1启动子序列中含有多个脱落酸和茉莉酸甲酯响应元件、光响应元件及MYB结合位点。实时荧光定量PCR分析发现,高浓度Al处理条件下,CsMTP1在茶树根部和第1叶中的转录变化相反,在根中先升后降,而在第1叶中先降后升;高浓度Mn处理诱导了CsMTP1在根中和第1叶中的转录;高浓度Fe和高浓度Zn处理均抑制了CsMTP1在茶树根中的转录,并不同程度地诱导了该基因在茶树第1叶中的转录。这表明,CsMTP1对高浓度Al、Fe、Zn和Mn有不同的响应模式。酵母功能互补实验证实CsMTP1具有转运Zn的功能。

关键词：茶树 cdf家族 CsMTP1 基因表达锌转运蛋白

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空心莲子草MTP基因家族的鉴定、特征及表达分析

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草业科学 2020年第8期37卷 1516-1527页

作者：杨蕾蒋昕晨杨杰夏雨晨陈中义马东方朱永兴尹军良湿地生态与农业利用教育部工程研究中心/长江大学农学院湖北荆州434025 长江大学园艺学院湖北荆州434025

金属耐受蛋白(MTP)是阳离子转运蛋白家族(cation transporter family,cdf)的重要成员,在植物重金属转运及解毒中发挥关键作用。为系统鉴定和分析空心莲子草MTP基因家族(ApMTP),本研究以模式物种MTP序列作为种子序列,BLASTP比对空心莲子... 详细信息

金属耐受蛋白(MTP)是阳离子转运蛋白家族(cation transporter family,cdf)的重要成员,在植物重金属转运及解毒中发挥关键作用。为系统鉴定和分析空心莲子草MTP基因家族(ApMTP),本研究以模式物种MTP序列作为种子序列,BLASTP比对空心莲子草氨基酸序列数据库,成功鉴定到40个ApMTP候选,随后对它们进行了系统发育、保守结构域、基因结构等生物信息学分析。结果表明:鉴定到的40个ApMTP中,大部分成员含有2~6个跨膜结构域(transmembrane domain,TMD);系统发育分析将40个ApMTP分为Fe/Zn-cdf(7)、Mn-cdf(20)和Zn-cdf(13) 3个亚家族;在Zn-cdf和Zn/Fe-cdf亚家族ApMTP的TMD-Ⅱ和TMD-Ⅴ上或附近识别到保守基序HXXXD,在Mn-cdfs亚家族的TMD-Ⅱ和TMD-Ⅴ上识别到保守基序DXXXD。表达模式分析发现,ApMTP具有组织特异性表达和响应根部低钾等不同处理的特征。

关键词：生物信息学分析重金属 cdf家族锌转运蛋白

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丛枝菌根真菌Funneliformis mosseae锌转运体基因FmZnT1的克隆与表达分析

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基因组学与应用生物学 2016年第4期35卷 867-878页

作者：韩亚超谢贤安阜阳职业技术学院生化工程学院阜阳236031 华中农业大学生命科学技术学院武汉430070

丛枝菌根(AM)真菌中锌(Zn)平衡或抗性的机制仍未被完全理解,主要是由于响应Zn压力抗性基因的分子信息有限。为了揭示AM真菌中Zn抗性的分子基础,利用兼并PCR与RACE技术从摩西管柄囊霉(Funneliformis mosseae)中分离到一个全长cDNA,命名... 详细信息

丛枝菌根(AM)真菌中锌(Zn)平衡或抗性的机制仍未被完全理解,主要是由于响应Zn压力抗性基因的分子信息有限。为了揭示AM真菌中Zn抗性的分子基础,利用兼并PCR与RACE技术从摩西管柄囊霉(Funneliformis mosseae)中分离到一个全长cDNA,命名为Zn转运体FmZnT1,它与根内球囊霉(Rhizophagus intraradices)的GintZnT1基因密切相关。根据其序列与系统进化分析,FmZnT1属于阳离子扩散促进体(cdf)家族的Zn型亚家族。通过RT-PCR与定量RT-PCR的结果表明FmZnT1基因在AM真菌的各组织中组成型表达,与生长阶段和侵染率无关。在Zn^(2+)(300μmol/L)处理的紫云英菌根中FmZnT1基因的转录水平被迅速诱导,然而在长时间暴露于低Zn^(2+)(30μmol/L)浓度的菌根中FmZnT1的表达被显著上调。因此这些数据表明编码cdf家族Zn转运体的Fm Zn T1基因可能对摩西管柄囊霉(***)中的Zn^(2+)压力具有抗性。总而言之,从本研究获得的数据能够对AM真菌中Zn平衡与Zn抗性有初步的理解。

关键词：丛枝菌根真菌摩西管柄囊霉 FmZnT1 cdf家族 Zn抗性

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黄瓜MTP基因家族分析及重金属胁迫下表达特征

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西北植物学报 2021年第6期41卷 933-943页

作者：朱雄萌蒋昕晨席克勇杨静尹军良朱永兴长江大学园艺园林学院湖北荆州434000 长江大学农学院湖北荆州434000 重庆工程职业技术学院重庆402260

该研究以模式物种(拟南芥、水稻、玉米)的MTP序列作为种子序列,对黄瓜MTP基因家族(CsMTP)成员进行了系统鉴定和分析;并以Zn^(2+)、Cd^(2+)、Mn^(2+)、Cu^(2+)、Fe^(2+)和Mo^(2+)处理后的黄瓜叶片和根系为材料,对CsMTP响应金属离子的表... 详细信息

该研究以模式物种(拟南芥、水稻、玉米)的MTP序列作为种子序列,对黄瓜MTP基因家族(CsMTP)成员进行了系统鉴定和分析;并以Zn^(2+)、Cd^(2+)、Mn^(2+)、Cu^(2+)、Fe^(2+)和Mo^(2+)处理后的黄瓜叶片和根系为材料,对CsMTP响应金属离子的表达模式进行了研究,为探究该基因家族对黄瓜重金属胁迫调控机制提供理论依据。结果表明:(1)黄瓜含有10个CsMTP,可进一步分为Fe/Zn-cdf(2个)、Mn-cdf(3个)和Zn-cdf(5个)三个亚家族,Mn-cdf成员含有保守基序DxxxD,Zn-cdf和Fe/Zn-cdfs成员含有保守基序HxxxD,大部分CsMTP成员含有6个跨膜结构域。(2)RNA-seq数据分析表明,CsMTP具备组织特异性表达和响应不同处理的特征,CsMTP11、CsMTP3和CsMTP7在不同组织和处理下普遍高水平表达,且外源化学试剂处理可诱导同一基因的不同表达模式。(3)RT-PCR分析表明,CsMTPs可被不同重金属离子诱导差异表达,包括不是MTP家族潜在底物的重金属。

关键词：黄瓜重金属胁迫 cdf家族生物信息学表达模式分析

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印度芥菜CE家族成员BjCET1的功能解析与应用研究

印度芥菜CE家族成员BjCET1的功能解析与应用研究

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作者：曾柳河北农业大学

学位级别：硕士

近些年来,我国的城市化、工业化、农业化的规模不断扩大,工业“三废”的排放、化肥的过度使用等不断加剧土壤的重金属污染,对动植物都产生了严重的毒害。如何有效地治理和修复土壤重金属污染已成为当下和长期面临急需解决的重大课题。... 详细信息

近些年来,我国的城市化、工业化、农业化的规模不断扩大,工业“三废”的排放、化肥的过度使用等不断加剧土壤的重金属污染,对动植物都产生了严重的毒害。如何有效地治理和修复土壤重金属污染已成为当下和长期面临急需解决的重大课题。目前植物修复技术在操作上、经济和技术上都具有一定的优势,其中印度芥菜(Brassica juncea L.)作为植物修复技术的主要模式植物之一,对多种重金属离子如Cd、Zn、Pb、Se、Au等具有富集或超富集能力。探索和解析其富集/超富集重金属离子的分子机制,对于开发可用于重金属污染土壤植物修复的人工超富集植物,以及改善人类膳食中必需微量元素的含量均具有重要科学意义和应用价值。CE(cation-efflux)家族蛋白成员被认为与植物体微量金属元素Cd、Zn、Ni、Co或Fe的转运和富集有关,本实验室前期从镉胁迫下的印度芥菜cDNA pool中克隆了该家族的BjCET1基因,利用Genome Walking技术克隆了其启动子序列BjCET1P。本研究利用农杆菌侵染法获得了稳定遗传的的T3代BjCET1P与BjCET1拟南芥转化植株,通过重金属胁迫分析、酵母功能互补、GUS染色、非损伤微测技术(Non-invasive Micro-test Technique,NMT)等手段对BjCET1P启动子和BjCET1基因的功能机制及污染土壤修复潜力进行了研究。研究结果如下:***1P-GUS转基因拟南芥GUS染色验证了BjCET1P是组成型强启动子,表达定位在根尖和维管组织中。2.酵母功能互补实验表明,在酵母中表达BjCET1可显著提高酵母菌对Zn、Cd、Co、Ni,特别是Zn胁迫的耐受性;ICP-MS检测显示,表达BjCET1显著降低了酵母细胞的Zn含量,说明BjCET1表达提高了酵母细胞外排泵出Zn的能力。3.采用共聚焦激光扫描显微技术(Confocal),我们观察了 BjCET1-GFP蛋白融合表达的烟草植株的根部,通过质壁分离实验,验证了 BjCET1蛋白在根部主要表达在细胞质膜上。4.采用NMT技术分析了 Cd胁迫条件下BjCET1P2驱动的BjCET1基因表达对拟南芥根部Cd2+离子流速影响,结果表明BjCET1表达提高了拟南芥根部Cd2+净内流速率,部分揭示过表达BjCET1提高植物Cd富集量的生理机制。5.转基因拟南芥抗重金属分析表明,BjCET1P2启动子驱动的BjCET1蛋白的表达,显著提高了植株的抗Cd、Cu、Hg、Mn和Zn胁迫的能力,植株鲜重及生长状况明显好于对照。重金属富集量初步分析,转基因植株地上部Cd富集量显著高于对照,显示出该基因及启动子用于植物修复土壤的潜力。

关键词：印度芥菜 cdf家族组成型强启动子拟南芥植物修复重金属富集机制

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水稻金属离子转运体基因OsMTP1的克隆与功能分析

水稻金属离子转运体基因OsMTP1的克隆与功能分析

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作者：王齐红南京农业大学

学位级别：硕士

锌、铁和铜等金属元素是所有生物体的必需元素,在体内许多生物化学过程中发挥着重要作用,例如,构成酶的活性部位,参与体内电子传递,调控基因的表达等。但这些金属离子在体内蓄积过多,就会象镉、汞等有毒金属离子一样产生细胞毒害作用。... 详细信息

锌、铁和铜等金属元素是所有生物体的必需元素,在体内许多生物化学过程中发挥着重要作用,例如,构成酶的活性部位,参与体内电子传递,调控基因的表达等。但这些金属离子在体内蓄积过多,就会象镉、汞等有毒金属离子一样产生细胞毒害作用。因此,生物体在进化过程中形成了一套精细的调节系统控制着这些金属离子的吸收、分布、储存及解毒。随着遗传学和分子生物学实验方法的迅猛发展,一些参与金属离子转运的相关基因相继被克隆。如:cdf家族(cation diflusion facilitator family)、锌铁调控蛋白ZIP家族(ZRT,IRT—like protein)等。有关金属离子转运体的结构、功能、调节机理以及潜在的应用价值已成为微量元素研究领域里的一个新热点。采用电子克隆方法,以公布的小鼠锌离子转运体蛋白基因ZnT-2(GenBank登录号:NP 0370221)的氨基酸序列为信息探针,运行BLAST程序搜索GenBank的水稻基因组数据库,该探针与位于水稻第五条染色体上的重叠群Ctg010807(GenBank登录号:AACV01010807)高度同源,搜索EST库并经人工序列拼接、基因组结构预测软件FGENSH-M分析,拼接获得了1,685bp的水稻金属离子转运体基因的cDNA序列,进一步通过RT-PCR的方法克隆了该基因的全长cDNA,命名为OsMTP1(Oryza sativa Metal tolerance protein 1)。经NCBI序列搜索证实:OsMTP1是迄今为止唯一从单子叶植物克隆到的cdf成员。该基因只有一个外显子,完整的ORF编码418个氨基酸残基,其pI=5.87,分子量MW=45.5kDa,该cDNA全序列在GenBank中的登录号为:AY266290。OsMTP1与其他cdf家族成员如AtMTP1、AsMTP1、TaMTP1、TgMTP1t1、TgMTP1t2、TmMTP1和PtdMTP1氨基酸的一致性为62～67%,相似性为70～77%。所有这些蛋白都有6个跨膜区(TM),其中绝大多数都有富组氨酸的可变区。半定量RT-PCR分析的结果表明,OsMTP1在被检测的水稻组织中呈组成性表达,但在叶中的表达要高于其他组织。不同浓度锌处理时,OsMTP1的表达量随锌浓度的升高而增加。受过量锌和镉处理的水稻幼苗中,OsMTP1的表达显著增加。当植株受不同浓度Cu,Fe,Mg处理时,OsMTP1的表达量稍有提高。利用农杆菌介导法将OsMTP1::GUS融合基因转化到洋葱表皮细胞中后,显微观察证实OsMTP1位于细胞的质膜上。由此推测OsMTP1的作用可能是将重金属离子外排到细胞间隙中。通过构建酵母表达载体,进行OsMTP1的酵母表达分析。结果表明,在菌液浓度为OD=0.5和0.05时,含pFL61-OsMTP1的菌株对150mM ZnSO的耐受性要明显高于转空载体pFL61的菌株,证明OsMTP1的表达能够提高转基因酵母耐锌胁迫的能力。

关键词：水稻金属离子转运体 cdf家族基因克隆 RT-PCR 功能分析

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