检索结果-南通市图书馆

作者：李丽山东师范大学

学位级别：硕士

酿酒酵母可作为一种重要的模式生物来研究真核生物。酵母的基因与很多疾病的基因有很高的同源性。研究这些蛋白质的结构，有助于对这些疾病加深了解，从而使这些疾病的诊断和治疗水平得以提高。 cdc48是Ⅱ型AAA ATPase蛋白家族的成员，C... 详细信息

酿酒酵母可作为一种重要的模式生物来研究真核生物。酵母的基因与很多疾病的基因有很高的同源性。研究这些蛋白质的结构，有助于对这些疾病加深了解，从而使这些疾病的诊断和治疗水平得以提高。 cdc48是Ⅱ型AAA ATPase蛋白家族的成员，cdc48在哺乳动物中的同族体称为p97或VCP。cdc48具有ATPase活性、泛素连接及与多种辅助因子结合等生化特性。cdc48在许多细胞事件中发挥功能并且与人类许多恶性疾病的发生有关。通过对cdc48蛋白的同源体p97的结构结构研究证明，其结构包含由氨基末端N端结构域、两个ATP酶结构域（D1和D2）和羧基末端非结构化的C端。cdc48由六个单体形成六聚体，围绕一个中央轴向孔，孔有一个Zn2+。 p97的结构研究要么是对其部分结构域的解析，要么得到的是缺少N端和C端部分氨基酸的结构。而对cdc48蛋白的研究主要集中在它的功能方面,对它的结构的研究并不多，这对研究cdc48功能的研究造成了一定的限制。通过实验，将得到的含有酿酒酵母cdc48全长基因的质粒导入到大肠杆菌中，成功表达cdc48蛋白。优化了诱导表达的条件,在16℃，添加0.05mM IPTG过夜诱导的条件下，成功高效表达了可溶性的cdc48蛋白。优化了镍离子金属螯合磁珠亲和纯化的条件。在镍离子金属螯合磁珠亲和纯化的Buffer中使用1M NaCl。在裂解Buffer，添加20mM咪唑及0.6%Triton X-100，孵育后进行纯化，以提高cdc48蛋白与磁珠的结合量，并减少杂蛋白与镍离子磁珠的非特异性结合。在清洗过程中，首先用含有50mM咪唑及0.6%的Triton X-100的cdc48清洗BufferA大量清洗，然后用含有100mM咪唑但不含有Triton X-100的cdc48清洗Buffer B少量清洗。在洗脱过程中，使用含有500mM咪唑的洗脱Buffer，小体积多次洗脱，让cdc48蛋白用较少的洗脱Buffer便可洗脱干净。通过镍离子螯合磁珠亲和纯化、DEAE阴离子交换层析、Superose6凝胶过滤层析三步纯化，得到了纯度较高的cdc48蛋白。通过电镜观察，用较少的样品和染液快速观察cdc48蛋白的结构图像特征，获得了低分辨的cdc48蛋白六聚体的环状模型，确定了cdc48蛋白的纯化质量还是不错的，蛋白状态也比较均一。本课题的研究为进行高分辨率的冷冻三维电镜分析的第一步，也是关键的一步。这对全面解析cdc48蛋白的精细三维结构，确立其处于不同状态下的结构变化，进而更好的阐释它发挥生物学功能的机制具有重要意义。

关键词： AAA ATPase cdc48 纯化电镜结构

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细胞周期调控的一个重要元素—cdc48

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生物技术通报 2006年第5期22卷 26-29页

作者：刘丽娜刘祥林陈志玲首都师范大学北京100037

细胞周期调控研究已成为当前生物学领域的一大热门课题,对哺乳动物和酵母细胞周期调控的研究已经非常深入且日臻成熟;植物细胞周期调控研究起步相对较晚但近些年来在该领域也取得了很大的进展。cdc48是真核生物中普遍存在的一个重要的... 详细信息

细胞周期调控研究已成为当前生物学领域的一大热门课题,对哺乳动物和酵母细胞周期调控的研究已经非常深入且日臻成熟;植物细胞周期调控研究起步相对较晚但近些年来在该领域也取得了很大的进展。cdc48是真核生物中普遍存在的一个重要的细胞周期调节基因,其蛋白产物cdc48也是研究较为成熟的一个周期蛋白,国外生物学者对该基因已经开展多年研究,而国内尚未见任何报道。主要论述近几年来有关真核生物酵母、哺乳动物和植物cdc48的研究现状及发展趋势。

关键词：细胞周期周期调控 cdc48 真核生物

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A converged ubiquitin-proteasome pathway for the degradation of TOC and TOM tail-anchored receptors

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Journal of Integrative Plant Biology 2024年第5期66卷 1007-1023页

作者： Meijing Yang Shuai Chen Shey-Li Lim Lang Yang Jia Yi Zhong Koon Chuen Chan Zhizhu Zhao Kam-Bo Wong Junqi Wang Boon Leong Lim School of Biological Sciences University of Hong KongPokfulam 999077Hong KongChina Department of Biology Southern University of Science and TechnologyShenzhen 518055China School of Biomedical Engineering Shenzhen UniversityShenzhen 518060China School of Life Sciences The Chinese Universityof Hong KongShatin 999077HongKongChina State Key Laboratory of Agrobiotechnology The Chinese University of Hong KongShatin 999077Hong KongChina HKU Shenzhen Institute of Research and Innovation Shenzhen 518052China

In plants,thousands of nucleus-encoded proteins translated in the cytosol are sorted to chloroplasts and mitochondria by binding to specific receptors of the TOC(translocon on the outer chloroplast membrane)and the TOM(translocon on the outer mitochondrial membrane)complexes for import into those *** degradation pathways for these receptors are ***,we discovered a converged ubiquitin-proteasome pathway for the degradation of Arabidopsis thaliana TOC and TOM tail-anchored *** receptors are ubiquitinated by E3 ligase(s)and pulled from the outer membranes by the AAA+adenosine triphosphatase cdc48,after which a previously uncharacterized cytosolic protein,transmembrane domain(TMD)-binding protein for tail-anchored outer membrane proteins(TTOP),binds to the exposed TMDs at the C termini of the receptors and cdc48,and delivers these complexes to the 26S proteasome.

关键词： 26S proteasome cdc48 SP1 TOC TOM ubiquitination

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酵母蛋白Doa1（Ufd3）的原核表达、纯化、晶体生长及结构生物学研究

酵母蛋白Doa1（Ufd3）的原核表达、纯化、晶体生长及结构生物学研...

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作者：刘勇西北大学

学位级别：硕士

泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)参与调节细胞周期进程、基因转录调节、受体胞吞、抗原递呈、细胞增生与分化以及信号转导等各种细胞生理过程。酵母蛋白Doal(Ufd3)属于PLAA蛋白家族,与泛素蛋白酶体途径相关联,在... 详细信息

泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway,UPP)参与调节细胞周期进程、基因转录调节、受体胞吞、抗原递呈、细胞增生与分化以及信号转导等各种细胞生理过程。酵母蛋白Doal(Ufd3)属于PLAA蛋白家族,与泛素蛋白酶体途径相关联,在泛素依赖的蛋白降解途径中起重要作用,它能与泛素和酵母蛋白cdc48直接结合,从而帮助cdc48招募泛素来行使它的功能。cdc48(p97/VCP)是分子伴侣AAA-ATPase家族中的成员之一,在胞内行使与内质网膜相关联的降解、膜融合、转录引子激活等重要功能,而这些功能的行使都与泛素化有关。本论文拟采用结构生物学方法解析酵母蛋白Doal的蛋白质结构,以期能够从结构生物学角度阐释Doal在UPP途径以及DNA损伤反应当中所起作用的分子机制,为其其它生物学功能的研究奠定结构生物学基础。本研究的内容包括:运用基因工程技术克隆Doal(Ufd3)(320-C)蛋白基因至PET28a和pGEX-6p-1表达载体;运用原核表达系统表达大量可溶性的Doal(Ufd3)(320-C)片段;运用亲和层析、离子交换、分子排阻凝胶层析等手段纯化蛋白;通过悬滴气相扩散法筛选蛋白晶体;通过条件梯度方法优化晶体;数据收集,解析结构;通过体外GST pull-down实验验证相互结合位点氨基酸。本研究结论包括:1.将酵母蛋白Doal(ufd3)(320-C)的基因片段克隆至pGEX-6P-1和PET28a表达载体;2.获得大量高纯度的Doal(320-C)-6His重组蛋白;3.筛选得到可用于数据收集、结构解析的蛋白晶体:4.在国内外首次得到Doal(Ufd3)(320-C)的晶体结构,最终分辨率为2.0(?);5.通过体外GST pull-down实验对能够与cdc48相互结合的Doal氨基酸位点进行了初步寻找和探索。本研究在结构分析的基础上探究Doal(Ufd3)的生物学功能,对Doal(Ufd3)与泛素相互作用的作用机制有了更加深入的了解,对Doal(Ufd3)与cdc48相互作用的分子机制提供新的依据和研究思路。

关键词：泛素化 UPP Doal(Ufd3) cdc48 晶体结构

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