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慢病毒载体介导CD25siRNA在大鼠高危角膜移植免疫排斥反应中的研究

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慢病毒载体介导CD25siRNA在大鼠高危角膜移植免疫排斥反应中的研究

作者：刘立重庆医科大学

学位级别：硕士

目的通过慢病毒介导CD25siRNA（LV-CD25siRNA）来转染高危角膜移植术后的大鼠角膜，探讨CD25siRNA在角膜移植排斥中的作用。本实验分为两部分：实验一：慢病毒介导增强型绿色荧光蛋白（LV-EGFP）在不同浓度和不同转染途径下对大鼠角... 详细信息

目的通过慢病毒介导CD25siRNA（LV-CD25siRNA）来转染高危角膜移植术后的大鼠角膜，探讨CD25siRNA在角膜移植排斥中的作用。本实验分为两部分：实验一：慢病毒介导增强型绿色荧光蛋白（LV-EGFP）在不同浓度和不同转染途径下对大鼠角膜进行转染的有效性和毒性的研究实验二：通过慢病毒介导CD25siRNA来干预高危角膜移植术后的大鼠角膜，探讨CD25siRNA在角膜移植排斥中的作用方法实验一：SD大鼠25只，随机分为5组。分别是感染复数(multiplicity of infection，MOI)=5滴眼组（A）、 MOI=5结膜下注射组（B）、MOI=10点眼组（C）、MOI=10结膜下注射组（D）和MOI=10离体转染组（E）。各组角膜按各自条件转染后进行包埋、切片后置于荧光显微镜下观察，并分析荧光强度，然后通过HE染色观察角膜各层组织的变化。实验二：用NaOH法制备SD大鼠中到重度角膜碱烧伤动物模型，以Lewis大鼠为供体在碱烧伤模型上行穿透性角膜移植来构建高危角膜移植模型，角膜移植术后通过4种不同的方式干预：LV-CD25siRNA滴眼（A）、环孢素A滴眼液（B）、阴性对照病毒（含阴性对照siRNA的慢病毒）（C）、生理盐水（D）。转染后，我们主要通过以下四个方面进行观测。除裂隙灯每天检查外，其余三项检查检查在3、7、14天三个时间点进行检测： 1.裂隙灯下观察各个实验组的角膜术后情况，包括：角膜水肿、浑浊情况，角膜新生血管及前房炎症。 2.HE染色病理切片下角膜组织的变化。 3.运用RT-qPCR检测术后3个时间点角膜中CD25和VEGF-A的mRNA表达情况。 4.运用Western blot检测术后3个时间点角膜中CD25和VEGF-A的蛋白质表达情况。结果实验一：荧光显微镜观察结果显示，同MOI组比较，点眼方式较结膜下注射角膜的荧光分布更加均匀。各组相对荧光强度值分别为：A组0.1803±0.0440，B组0.1061±0.0434，C组0.2369±0.0157，D组0.2002±0.0307，E组0.2434±0.0173，表明点眼方式较结膜下注射角膜的荧光表达更加强烈(P0.05)。各组角膜细胞形态正常，未见明显凋亡细胞。离体转染角膜经过7d培养液转染后，角膜内皮细胞仍然生长良好，未见内皮细胞出现皱缩、变形及缺失等病理改变。实验二：裂隙灯检查结果：术后10天观察到A组角膜植片中央轻度水肿、混浊，未见明确新生血管长入植片，C组和D组可见角膜完全混浊，明显水肿，大量新生血管成簇弯曲长入角膜植片，B组角膜轻度水肿、混浊，6点到9点位可见大量新生血管长入植片。 HE染色检查结果：手术后14天各组角膜HE染色可见，角膜植片均有水肿，植片增厚明显，以角膜基质层增厚为主，A组（CD25组）可见角膜上皮层细胞排列规则、紧密，无明显水肿，角膜基质基质中炎性细胞浸润和新生血管较少，角膜内皮层细胞整齐，形态无明显改变，无明显缺失。B、C、D组发现角膜上皮层部分细胞脱失、排列相对疏松，基质中观察到大量炎症细胞浸润和新生血管管腔形成，内皮细胞结构基本完整。 RT-qPCR结果：A组CD25的mRNA表达在各个时间点均比其余三组有统计学差异，VEGF的mRNA表达与CsA组比较发现差异无统计学意义（P>0.05）。 Western blot结果：A组（0.362±0.09）与C组（0.994±0.19）及D组（1.07±0.15）两对照组相比VEGF-A蛋白表达减少。B组(0.384±0.13)与A组对比，VEGF-A蛋白表达不具有统计学上的差异。结论 1. LV-EGFP能在较低MOI下有效转染大鼠角膜，点眼转染比结膜下注射转染效率更高，提高MOI能提高角膜转染效率，大鼠角膜在较低MOI的持续转染下有良好的安全性。 2. CD25siRNA能有效干扰角膜移植术后角膜植片中CD25的合成，延迟了角膜移植免疫排斥反应的发生，并且还一定程度上抑制了角膜新生血管的发生、发展，我们发现这种抑制可能不是通过VEGF-A的控制来实现，而可能是多种细胞因子间的相互联系来完成的。

关键词：慢病毒载体 CD25 siRNA 角膜移植免疫排斥

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强直性脊柱炎并发葡萄膜炎临床特点的研究

强直性脊柱炎并发葡萄膜炎临床特点的研究

作者：荆梅华扬州大学

学位级别：硕士

目的：研究并发葡萄膜炎的强直性脊柱炎（AS）患者临床特点,以及并发葡萄膜炎对AS患者的疾病严重程度、总体预后、治疗的影响。研究对象：并发及未并发葡萄膜炎的强直性脊柱炎（AS）患者方法：收集了2009年6月至2012年... 详细信息

目的：研究并发葡萄膜炎的强直性脊柱炎（AS）患者临床特点,以及并发葡萄膜炎对AS患者的疾病严重程度、总体预后、治疗的影响。研究对象：并发及未并发葡萄膜炎的强直性脊柱炎（AS）患者方法：收集了2009年6月至2012年6月期间扬州大学临床医学院风湿免疫科门诊及住院部AS患者的临床资料,共301例。将AS患者中并发葡萄膜炎的患者及未并发葡萄膜炎的患者分别定义为葡萄膜炎组及非葡萄膜炎组。所有AS患者均符合1984年的AS纽约修订标准。对所有患者的性别、年龄、病程、总体评分、晨僵程度、晨僵持续时间、外周关节受累情况、BASDAI、BASFI评分、治疗方案以及血沉、CRP、CD25、HLA-B27、髋关节MRI结果进行归纳、总结。所有统计学处理在SPSS17.0及Excel2007软件中完成。计量资料采用独立样本t检验,计数资料使用卡方检验进行统计分析。结果：301例AS患者,其中男性共218例,女性83例,男女比约2.6：1。曾经或就诊时有葡萄膜炎的患者为36例（11.96%）。 36例并发葡萄膜炎的患者中,有18例（50%）患者在AS发病后一年出现了葡萄膜炎;有14例（38.89%）患者在AS发病后一年内出现了葡萄膜炎;有3例（8.33%）患者在发病初出现了葡萄膜炎。其中28例（77.78%）患者葡萄膜炎反复发作。反复发作葡萄膜炎的患者中仅有2例为单眼发作,而其他均为双侧交替发作,其中6例视力明显减退。葡萄膜炎组及非葡萄膜炎组患者的性别比例、发病年龄、晨僵程度、晨僵持续时间、总体不适程度、CRP、ESR、BASDAI评分、HLA-B27阳性率、髋关节受累率均无统计学意义;而葡萄膜炎组平均病程较非葡萄膜炎组长（P=0.006）;葡萄膜炎组患者中CD25升高的患者有56.67%,多于非葡萄膜炎组;躯体功能指数（BASFI）评分在葡萄膜炎组显著大于非葡萄膜炎组,并且其差异有统计学意义。并发葡萄膜炎的患者中有28例（77.78%）有外周关节受累,较非葡萄膜炎组多。治疗方案方面发葡萄膜炎患者中的生物制剂使用率为41.67%,未并发葡萄膜炎患者中的生物制剂使用率为24.53%,两组间生物制剂使用率的差异有统计学意义（P=0.029）。结论： 1、多数AS并发的葡萄膜炎为反复发作,可为首发,也可发生在AS发病后,甚至可在AS发病前数年发生。 2、AS患者的葡萄膜炎发生率随着病程延长而升高。而与性别、AS发病年龄、HLA-B27无关。 3、并发葡萄膜炎对疾病活动度无显著影响,但可加重躯体功能受损。 4、AS并发葡萄膜炎可能与CD25升高有关。 5、并发葡萄膜炎患者更易有外周关节受累。 6、由于葡萄膜炎复发率高,可致视力下降,甚至失明,伴发葡萄膜炎的AS患者应首先考虑生物制剂治疗。

关键词：强直性脊柱炎葡萄膜炎病程疾病活动度 CD25

紫杉醇对小鼠T细胞cd69、CD25表达及增殖作用的流式细胞术分析

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中国药理学通报 2005年第6期21卷 705-707页

作者：彭桉平曾耀英俞瑜肇静娴狄静芳暨南大学组织移植与免疫教育部重点实验室广东广州510632

目的研究紫杉醇对多克隆刺激剂作用下小鼠T细胞cd69、CD25表达及增殖的影响,并探讨其机制。方法利用荧光标记的单克隆抗体染色结合流式细胞术,检测多克隆刺激剂佛波醇酯(PDB)或刀豆蛋白(ConA)刺激下小鼠T细胞表达活化抗原cd69、CD25的... 详细信息

目的研究紫杉醇对多克隆刺激剂作用下小鼠T细胞cd69、CD25表达及增殖的影响,并探讨其机制。方法利用荧光标记的单克隆抗体染色结合流式细胞术,检测多克隆刺激剂佛波醇酯(PDB)或刀豆蛋白(ConA)刺激下小鼠T细胞表达活化抗原cd69、CD25的百分率;以羧基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯(CFDASE)标记技术结合流式细胞术分析PDB+Ion(Ionomycin)或ConA刺激下T细胞增殖指数。结果PTX无论对ConA或PDB刺激组T细胞cd69表达均无抑制作用(P>0.05),而对T细胞CD25表达有明显抑制作用(P0.05)。结论PTX可明显抑制多克隆刺激剂诱导的T细胞中后期活化及增殖,其作用机制可能与早期活化相关蛋白PTK及PKCθ无关,而与PKCθ下游活化信号相关。

关键词：紫杉醇 T淋巴细胞 cd69 CD25 增殖流式细胞术

自身免疫性肝病中cd4、CD25、Foxp3及ERα、TGF-β1的表达及意义

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自身免疫性肝病中CD4、CD25、Foxp3及ERα、TGF-β1的表达及意义

作者：李麟天津医科大学

学位级别：硕士

目的近年来不同类型肝炎的鉴别诊断是临床迫切需要解决的难题,尤其是各型AILD的诊断更是难中之难,虽然国际自身免疫性肝炎小组（IAIHG）制定了一套诊断标准,并经过多次修订使得诊断率有所提高,诊断也更加可靠,但还会遇到诊断与临床... 详细信息

目的近年来不同类型肝炎的鉴别诊断是临床迫切需要解决的难题,尤其是各型AILD的诊断更是难中之难,虽然国际自身免疫性肝炎小组（IAIHG）制定了一套诊断标准,并经过多次修订使得诊断率有所提高,诊断也更加可靠,但还会遇到诊断与临床表现不符或是治疗效果不满意的情况。基于此许多临床医生向病理医生寻求帮助,希望通过分析肝穿标本的病理特征能够给于他们更明确的诊断及治疗方向。我们分析,虽然各种肝炎有许多相似的组织学表现,但各自有各自相对的组织学特征,为此我们通过分析几种常见的肝炎（自身免疫性肝炎（AIH）、原发性胆汁性肝硬化（PBC）及慢性乙型肝炎（CHB）） HE染色标本的组织学特征,以此来为临床诊断提供帮助,为临床治疗提供依据。此外cd4、CD25、叉头样转录因子Foxp3（foxhead box protein 3）、雌激素受体α（ERa）及转化生长因子β1 （TGF-β1）与自身免疫性疾病的关系倍受关注,尤其是cd4+、CD25+的Treg及Foxp3在自身免疫性疾病发病机制中的作用更是研究焦点中的热中之热。为此我们比较它们在各组肝活检中的表达情况来探讨其作用及意义。方法应用HE染色进行29例I型AIH、18例PBC、15例CHB肝穿标本的组织学特征分析,应用免疫组化方法检测各组cd4、CD25、Foxp3、ERa及TGF-β1的表达情况,设8例正常肝组织（非肝病患者尸检来源的肝组织）为对照。结果 1. AIH、PBC、CHB三组中羽毛状变性发生率分别为3.45%、33.33%、6.67%,PBC组明显高于AIH组（P＜0.05）;桥接坏死发生率分别为27.59%、50.00%、13.33%,PBC组明显高于乙肝组（P＜0.05）;胆栓发生率分别为6.92%、44.44%、6.67%,PBC组明显高于AIH和CHB组（P＜0.01、P＜0.05）;胆管增生发生率分别为34.48%、61.11%、13.33%,PBC组明显高于AIH和CHB组（P＜0.05）。 2.cd4在各组的表达PBC组高于乙肝组（P＜0.01）。 3.CD25在各组的表达差异没有统计学意义（P＞0.05）。 4. Foxp3组间阳性胆管数PBC组高于正常组（P＜0.01）,阳性细胞数各组间差异没有统计学意义（P＞0.05）。 5.ERα在各组的表达AIH和PBC组高于正常组（P＜0.01）。 6. TGF-B1表达：在PBC组汇管区阳性细胞数高于肝小叶（P＜0.05）,各组间汇管区阳性细胞数PBC组高于其它三组（P＜0.01）,在正常组肝小叶内阳性细胞数高于汇管区（P＜0.01）。结论 1.不同类型的自身免疫性肝病的组织学特征有所不同,AIH以肝小叶界板的损伤为主要改变,而PBC以胆管上皮损伤为主要特征,比如羽毛状变性,胆栓及胆管增生。 2. cd4+T细胞可能在PBC发生的免疫机制中起到重要作用。 3.ERa及TGF-β1可能介导和促进了自身免疫性肝病的发生发展。

关键词：自身免疫性肝病组织学特征免疫组织化学 cd4 CD25 叉头样转录因子Foxp3 雌激素受体a 转化生长因子β1

cd19、CD25在新生儿缺氧缺血性脑病的表达及临床意义

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临床儿科杂志 2010年第4期28卷 367-370页

作者：林丽星杨梅王洁张青玉席莉华兰州大学第一医院儿科甘肃兰州730000 兰州市妇幼保健院儿科甘肃兰州730000 兰州市城关区中医骨伤科医院儿科甘肃兰州730000

目的探讨新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)患儿外周血B淋巴细胞亚群cd19、CD25的表达及临床意义。方法收集62例HIE组新生儿和30例对照组新生儿股静脉血标本,采用流式细胞仪(FCM)检测外周血B淋巴细胞cd19+、CD25+、cd19+/CD25+百分率,同时应用... 详细信息

目的探讨新生儿缺氧缺血性脑病(HIE)患儿外周血B淋巴细胞亚群cd19、CD25的表达及临床意义。方法收集62例HIE组新生儿和30例对照组新生儿股静脉血标本,采用流式细胞仪(FCM)检测外周血B淋巴细胞cd19+、CD25+、cd19+/CD25+百分率,同时应用流式直方图分析细胞表面cd19、CD25分子的表达密度。结果HIE组新生儿外周血B淋巴细胞cd19+、CD25+、cd19+/CD25+百分率分别为17.93±3.10、1.26±1.04、0.64±0.42,均较对照组低(Pcd19+、cd19+/CD25+百分率比较差异有统计学意义(Pcd19、CD25的平均荧光强度分别为13.53±5.48、1.37±0.33,与对照组比较差异均有统计学意义(Pcd19、CD25的表达异常,B淋巴细胞功能受抑制,检测cd19、CD25对了解HIE的免疫功能及病情具有重要临床意义。

关键词：缺氧缺血性脑病新生儿流式细胞仪 cd19 CD25

呕吐毒素对小鼠T淋巴细胞体外活化及相应活化标志分子的影响

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江苏农业科学 2020年第4期48卷 150-155页

作者：刘双双孙凯蔡国栋宋瑞龙邹辉顾建红袁燕刘学忠刘宗平卞建春扬州大学兽医学院江苏扬州225009 江苏省动物重要疫病与人兽共患病防控协同创新中心江苏扬州225009

为探究脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,简称DON)对离体T淋巴细胞活化的抑制作用,研究DON对刀豆蛋白A(concanavalin A,简称Con A)介导的小鼠离体T淋巴细胞活化及活化标志分子cd69、CD25、cd71的影响,以BALB/c小鼠T淋巴细胞为材料,分... 详细信息

为探究脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol,简称DON)对离体T淋巴细胞活化的抑制作用,研究DON对刀豆蛋白A(concanavalin A,简称Con A)介导的小鼠离体T淋巴细胞活化及活化标志分子cd69、CD25、cd71的影响,以BALB/c小鼠T淋巴细胞为材料,分设细胞空白组、刀豆蛋白A对照组、不同浓度DON染毒组(Con A+0.5/1/2μmol/L DON),用CCK-8法检测24h内细胞的相对活性,用流式细胞术分别检测6、30、72 h时cd69、CD25、cd71的表达量。结果显示,DON在终浓度为0.5、1、2μmol/L时均极显著地降低了Con A介导的T细胞的相对活性(Pcd69的表达率(PCD25、cd71的表达率(P<0.01),且呈剂量效应关系。由结果可知,脱氧雪腐镰刀菌烯醇对动物机体免疫抑制作用的产生与其直接抑制小鼠T淋巴细胞的活化有关。

关键词：呕吐毒素脱氧雪腐镰刀菌烯醇刀豆蛋白 T淋巴细胞 cd69 CD25 cd71

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白细胞介素2受体α与Graves病

免疫学杂志 2012年第1期28卷 83-85,92页

作者：徐雅萍孟凤苓河北医科大学第二医院内分泌科石家庄050000

白细胞介素2受体α(IL-2Rα)是白细胞介素2受体(IL-2R)的α链,属低亲和力IL-2R,它主要参与T淋巴细胞的活化与增殖,在多种自身免疫性疾病中发挥作用。通过对IL-2Rα与Graves病之间关系的研究,进一步探讨Graves病的发病机制,并为本病的诊... 详细信息

白细胞介素2受体α(IL-2Rα)是白细胞介素2受体(IL-2R)的α链,属低亲和力IL-2R,它主要参与T淋巴细胞的活化与增殖,在多种自身免疫性疾病中发挥作用。通过对IL-2Rα与Graves病之间关系的研究,进一步探讨Graves病的发病机制,并为本病的诊断与治疗提供新思路。

关键词： Graves病 Graves眼病白细胞介素2受体α 可溶性白细胞介素-2受体 CD25

CD25在老年急性髓系白血病患者中的表达及其与预后的相关性分析

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潍坊医学院学报 2018年第6期40卷 401-403,443页

作者：宋蕾夏炳森贾梅艳冯绪梅潍坊医学院内科学教研室山东潍坊261053 潍坊市人民医院血液科

目的观察CD25在老年急性髓系白血病(AML)患者中的表达,探讨其与临床特征和预后的关系。方法回顾性分析2015年1月～2017年1月就诊于潍坊市人民医院的80例初治老年AML患者,应用流式细胞技术检测患者CD25表达情况,统计分析不同临床特征患... 详细信息

目的观察CD25在老年急性髓系白血病(AML)患者中的表达,探讨其与临床特征和预后的关系。方法回顾性分析2015年1月～2017年1月就诊于潍坊市人民医院的80例初治老年AML患者,应用流式细胞技术检测患者CD25表达情况,统计分析不同临床特征患者的临床预后情况。结果 80例AML患者CD25阳性表达者13例,阴性表达者67例。不同性别、年龄、骨髓原始细胞比值患者的CD25表达无明显差异(P> 0. 05),不同PS评分、高白细胞计数及较差不良核型CD25表达差异有统计学意义(P CD25阳性表达者无事件生存期(EFS)和总生存期(OS)均显著低于阴性表达者,差异具有统计学意义(P CD25是老年AML患者预后危险因素,较阴性表达者预后不良。

关键词： CD25 髓系白血病急性临床预后

cd4^＋CD25^＋cd127^low识别人外周血cd4^＋CD25^＋调节性T细胞的优势

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中国免疫学杂志 2008年第12期24卷 1059-1062页

作者：王会平翟志敏张爱梅徐修才李庆张翠萍卢娟沈元元洪海鸥安徽医科大学附属省立医院中心实验室及血液科合肥230001 安徽省体检中心合肥230001

目的:探索可用于检测人外周血中cd4+CD25+Treg细胞的最佳标记物。方法:以52名健康人和47名非血液系统肿瘤患者为研究对象,采用多色免疫荧光素标记和多参数流式细胞术同时检测外周血中cd4+CD25high、cd4+CD25+FoxP3+和cd4+CD25+cd127low... 详细信息

目的:探索可用于检测人外周血中cd4+CD25+Treg细胞的最佳标记物。方法:以52名健康人和47名非血液系统肿瘤患者为研究对象,采用多色免疫荧光素标记和多参数流式细胞术同时检测外周血中cd4+CD25high、cd4+CD25+FoxP3+和cd4+CD25+cd127lowT细胞,并以经典指标cd4+CD25high和cd4+CD25+FoxP3+为标准,分析和比较cd4+CD25+cd127low作为识别cd4+CD25+Treg细胞的可行性及其优势。结果:健康人和肿瘤患者外周血cd4+CD25high、cd4+CD25+FoxP3+和cd4+CD25+cd127lowT细胞占cd4+T细胞百分比分别为(1.769±0.682)和(2.958±1.392);(2.905±1.772)和(5.128±2.227)以及(5.396±1.306)和(7.175±2.565)。三者呈相同的趋势,即肿瘤患者组>健康人组,且三者之间呈显著正相关(Pcd4+CD25high和cd4+CD25+cd127lowT细胞群后,FoxP3阳性率分别为90.9和92.7。结论:cd4+CD25+cd127low三标记法可以帮助识别cd4+CD25+Treg和部分激活的cd4+T细胞,提高cd4+CD25+Treg细胞的可检出数量,并且不影响细胞活性度,是反映cd4+CD25+Treg细胞更理想的指标。

关键词： cd4 CD25 cd127 FoxP3 调节性T细胞