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siRNA ccr7抑制乳腺癌细胞转移的体外实验研究

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中国现代医学杂志 2011年第23期21卷 2834-2836,2841页

作者：余术宜吴文芳李建哲吉午阳陈玉祥中南大学现代分析测试中心湖南长沙410078 石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司河北石家庄050051 中南大学药学院湖南长沙410078

目的探讨ccr7对肿瘤转移的影响。方法构建siRNA-ccr7载体,稳定转染表达ccr7的肿瘤细胞株MDA-MB-231,在mRNA和蛋白水平检测其对肿瘤细胞ccr7的抑制作用,再用趋化及侵袭实验检测其对肿瘤细胞趋化、侵袭能力的影响。结果稳定转染siRNA1、si... 详细信息

目的探讨ccr7对肿瘤转移的影响。方法构建siRNA-ccr7载体,稳定转染表达ccr7的肿瘤细胞株MDA-MB-231,在mRNA和蛋白水平检测其对肿瘤细胞ccr7的抑制作用,再用趋化及侵袭实验检测其对肿瘤细胞趋化、侵袭能力的影响。结果稳定转染siRNA1、siRNA2的MDA-MB-231细胞,在mRNA、蛋白水平均能有效抑制肿瘤细胞ccr7表达,并能抑制CCL21刺激的趋化和侵袭能力。结论 siRNA-ccr7能有效抑制乳腺癌细胞MDA-MB-231的趋化和侵袭,该实验结果对进一步探讨ccr7在肿瘤转移中的作用、探讨ccr7化学抑制剂或中药成分具有重要启示作用。

关键词： siRNA ccr7 肿瘤转移

趋化因子受体ccr7在人胃癌组织中的表达及其与胃癌转移的关系

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安徽医科大学学报 2017年第10期52卷 1472-1475页

作者：涂力蒋燚张驰王卉华中科技大学同济医学院附属武汉中心医院检验科武汉430014

目的观察趋化因子受体ccr7在胃癌中的表达情况,探讨ccr7表达水平与临床病理特征的关系。方法采用Real-time PCR、Western blot及免疫组化技术检测ccr7在60例胃癌组织及相应的癌旁组织中的表达分布情况,并分析其表达差异与胃癌临床病理... 详细信息

目的观察趋化因子受体ccr7在胃癌中的表达情况,探讨ccr7表达水平与临床病理特征的关系。方法采用Real-time PCR、Western blot及免疫组化技术检测ccr7在60例胃癌组织及相应的癌旁组织中的表达分布情况,并分析其表达差异与胃癌临床病理特征的相关性。结果在60例胃癌组织中,ccr7在胃癌组织中mRNA表达水平均显著高于癌旁组织(Pccr7在胃癌组织中的蛋白表达定位于细胞质,且ccr7蛋白在癌旁组织与胃癌组织中的阳性表达率分别为25%(15/60)和73%(44/60)。经χ~2检验,两者差异有统计学意义(χ~2=24.000,Pccr7蛋白在胃癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织。胃癌组织中ccr7表达水平在胃癌浸润深度、淋巴结转移、远处转移及TNM分期差异有统计学意义(Pccr7在胃癌组织中高表达,其表达水平与胃癌侵袭转移密切相关,有望成为胃癌治疗新靶点。

关键词：趋化因子受体 ccr7 胃癌侵袭转移临床意义

X线照射、化学药物及同步X线照射+化学药物对趋化因子受体ccr7表达的影响

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X线照射、化学药物及同步X线照射+化学药物对趋化因子受体CCR7表...

作者：郭爱华福建医科大学

学位级别：硕士

目的: 1.通过免疫组化观察趋化因子受体ccr7在结直肠癌SW480细胞上表达的位置。 2.采用western blot,首先检测结直肠癌SW480细胞、非小细胞肺癌SPC-A1细胞及鼻咽癌CNE-2细胞在单次照射不同剂量X线,24h、48h后ccr7表达变化;然后比较单次... 详细信息

目的: 1.通过免疫组化观察趋化因子受体ccr7在结直肠癌SW480细胞上表达的位置。 2.采用western blot,首先检测结直肠癌SW480细胞、非小细胞肺癌SPC-A1细胞及鼻咽癌CNE-2细胞在单次照射不同剂量X线,24h、48h后ccr7表达变化;然后比较单次照射8Gy与2Gy/d,连续6d组(生物学效应等效于单次8Gy组)对非小细胞肺癌SPC-A1细胞ccr7表达的影响;最后比较X线照射、化学药物及同步X线照射+化学药物对鼻咽癌CNE-2细胞ccr7表达的影响。通过以上研究了解X线照射、化学药物及同步X线照射+化学药物对ccr7表达的影响。方法: 1.采用免疫组化观察SW480细胞上ccr7表达的位置。 2.分别单次X线照射SW480细胞、SPC-A1细胞及CNE-2细胞0Gy、2Gy、10Gy、20Gy,24h、48h后用western blot检测其上ccr7的表达。 3.比较SPC-A1细胞单次照射8Gy组与2Gy/d,连续6d组(生物学效应等效于单次8Gy组)ccr7表达情况。 4.观察不同浓度化学药物顺铂(0μg/ml、0.032μg/ml、0.8μg/ml、20μg/ml)作用CNE-2细胞24h、48h后对其ccr7表达的影响;比较2Gy X线照射、不同浓度化学药物顺铂(0.032μg/ml、0.8μg/ml、20μg/ml)及同步X线照射+顺铂(2Gy+0.032μg/ml、2Gy+0.8μg/ml、2Gy+20μg/ml)对CNE-2细胞ccr7表达的影响。结果: 1.对于SW480细胞,ccr7主要表达在细胞膜。 2.在SW480细胞,2Gy、10Gy照射24h后ccr7的表达相对于对照组随照射剂量的增加而增加;相对于2Gy及10Gy组,20Gy组ccr7表达量无进一步增加;照射48h后ccr7各剂量组表达较对照组增加,但2Gy、10Gy及20Gy三者无差别。对于CNE-2细胞,24h、48h后各剂量组较同时间对照组表达均增加,但同一时间各照射组之间ccr7表达无差别;SPC-A1细胞ccr7表达不随照射剂量、时间及照射方式而变化。 3. X线照射、化学药物及同步X线照射+化学药物组处理后CNE-2细胞ccr7表达增加;同步X线照射+药物处理组ccr7表达较单纯化学药物组表达减少。结论: 1. ccr7主要表达于细胞膜上。 2. X线照射促进SW480细胞、CNE-2细胞ccr7的表达,而对SPC-A1细胞ccr7表达无影响。 3.顺铂化学药物促进CNE-2细胞ccr7表达,同步X线照射+化学药物较单纯化学药物可减少ccr7的表达。

关键词： ccr7 X线照射化学药物同步X线照射+化学药物

VEGF-C和ccr7的表达与卵巢癌淋巴结转移之间的关系

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中国组织化学与细胞化学杂志 2011年第5期20卷 472-475页

作者：夏欣李鑫磊杨树才孔建马晶哈尔滨医科大学解剖教研室黑龙江150081 黑龙江省医院哈尔滨150036

目的观察血管内皮生长因子(VEGF)-C和趋化因子受体ccr7在卵巢癌组织内的表达情况,分析VEGF-C和ccr7的表达与癌淋巴结转移之间的关系。方法取卵巢癌病例72例,其中,淋巴结转移组46例,无淋巴结转移组26例。应用免疫组化技术观察VEGF-C和ccr... 详细信息

目的观察血管内皮生长因子(VEGF)-C和趋化因子受体ccr7在卵巢癌组织内的表达情况,分析VEGF-C和ccr7的表达与癌淋巴结转移之间的关系。方法取卵巢癌病例72例,其中,淋巴结转移组46例,无淋巴结转移组26例。应用免疫组化技术观察VEGF-C和ccr7在卵巢癌组织内的表达。结果 VEGF-C和ccr7主要表达于卵巢癌细胞胞浆或/和胞膜内,VEGF-C和ccr7在淋巴结转移组的阳性表达率分别是71.7%和78.2%,在无淋巴结转移组的表达率分别是30.8%和26.9%,二者在淋巴结转移组的表达率均明显高于无淋巴结转移组(Pccr7蛋白同时阳性表达在淋巴结转移组和非淋巴结转移组中的表达率分别为65.2%和15.4%,VEGF-C和ccr7的表达具有显著的相关性(Pccr7诊断卵巢癌淋巴结转移具有较高的准确度,ROC曲线下面积达0.791。结论 VEGF-C和ccr7表达在卵巢癌淋巴结转移过程中发挥重要作用,VEGF-C和ccr7在促进卵巢癌淋巴结转移中可能具有一定的协同作用,二者联合检测有助于预示卵巢癌淋巴结转移的判断。

关键词： VEGF-C ccr7 淋巴结转移卵巢癌

基于乳腺癌微环境实质-基质间互作网络探索ccr7介导的生物学机制

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基于乳腺癌微环境实质-基质间互作网络探索CCR7介导的生物学机制

作者：宋云蕾南昌大学

学位级别：硕士

肿瘤微环境是由肿瘤细胞与肿瘤基质组成,肿瘤基质主要包括细胞外基质与多种基质细胞。肿瘤实质与基质细胞自分泌或旁分泌大量的细胞因子,与相应受体相互作用,构建了肿瘤-基质互作交流网络。肿瘤-基质互作交流网络通过影响肿瘤微环境中... 详细信息

肿瘤微环境是由肿瘤细胞与肿瘤基质组成,肿瘤基质主要包括细胞外基质与多种基质细胞。肿瘤实质与基质细胞自分泌或旁分泌大量的细胞因子,与相应受体相互作用,构建了肿瘤-基质互作交流网络。肿瘤-基质互作交流网络通过影响肿瘤微环境中各种细胞的生物学行为,调控肿瘤的发展过程。然而,由于现阶段大部分研究的临床标本来源于肿瘤实体组织,其异质性的细胞组成使得肿瘤-基质交流互作研究结果存在偏差;同时,由于微环境中肿瘤细胞与单一的基质细胞之间的交流分析掩盖了肿瘤细胞与整体基质之间的互作沟通,因此,通过分析定位更准确的肿瘤细胞与基质标本,以构建肿瘤细胞与整体基质之间的互作交流网络就显得非常必要。目的:通过对比显微切割方法获得的侵袭性乳腺癌与乳腺原位导管癌的高通量表达谱芯片数据,构建乳腺癌实质-基质互作网络;基于乳腺癌实质-基质互作网络,利用生物信息学方法筛选并验证乳腺癌侵袭转移相关的ccr7介导的生物学机制。方法:1、乳腺癌微环境实质-基质互作网络的构建:在GEO DataSets中筛选显微切割方法获得的侵袭性乳腺癌与原位癌标本来源的cDNA表达谱芯片数据集GSE35019,重构获得GSE35019’;利用R语言程序包Bioconductor分析芯片数据集GSE35019’,筛选差异表达基因;使用DAVID在线工具进行差异表达基因的GO分析与KEGG分析;利用cytoscape软件进行乳腺癌微环境实质-基质间互作网络的构建;利用高通量数据库TCGA和METABRIC筛选并鉴定乳腺癌侵袭转移有关的细胞因子及其受体。2、ccr7介导的生物学机制探索:利用数据集GSE35019及cBioPortal数据库进行CCL19、CCL21与ccr7的相关性分析;使用Oncomine数据库进行ccr7在正常乳腺与乳腺癌中芯片表达水平分析;利用数据集GSE35019进行ccr7高、低表达组的GSEA分析;免疫组化分析ccr7、E-cadherin和Vimentin在乳腺癌组织中的表达。结果:1、在GEO数据库中,搜索得到9个借助显微切割技术获得的人类乳腺癌基质与实质标本的芯片数据集,重构GSE35019获得数据集GSE35019’;2、利用数据集GSE35019’,通过对比侵袭性乳腺癌与原位乳腺癌样本,R语言分析筛选获得乳腺癌实质差异表达基因1459个,基质差异表达基因1427个;GO分析与KEGG分析显示,实质差异表达基因GO-MF主要集中于蛋白结合、转录激活、整合素及胶原蛋白结合等,富集于谷胱甘肽代谢、Wnt信号、细胞因子-受体联络等通路;基质差异表达基因富集于整合素及胶原蛋白结合、细胞因子及受体活性、ECM结构成分等分子功能,以及上细胞因子-受体联络、细胞粘附分子、ECM-受体联络等通路;3、基于细胞因子-细胞因子受体联络通路、细胞粘附分子通路及ECM-受体联络通路,构建乳腺癌微环境实质-基质间互作网络,并筛选得到CCL19-ccr7、CCL21-ccr7、GH1-GHR、PDGFD-PDGFRB及VEGFC-FLT4/FDR五组互作基因对;TCGA及METABRIC数据库资料显示,五组互作基因对相关的10个基因:CCL19、CCL21、ccr7、GH1、GHR、PDGFD、PDGFRB、VEGFC、FLT4及FDR在乳腺癌样本中的表达与临床病理资料存在密切的相关性;4、GSE35019数据分析显示,ccr7与其配体CCL19及CCL21的表达之间存在明显的正相关(R>0.50,Pccr7与其配体CCL19及CCL21的表达之间均具有正相关性(R>0.50);oncomine数据库信息显示,与正常乳腺相比,ccr7在乳腺癌中表达明显上调(Pccr7高表达组基因富集于IL6/JAK/STAT3、IL2/STAT5、TNFα、KRAS及mTORC1信号通路、E2F和MYC转录因子通路、炎症、干扰素及非折叠蛋白等应答通路,以及DNA修复、有丝分裂纺锤体、凋亡及EMT等相关细胞生物学行为;6、免疫组化结果显示,ccr7、E-Cadherin、Vimentin的表达与临床病理资料之间无相关性;ccr7的表达与E-Cadherin无相关性,与Vimentin的表达具有正相关性(P=0.029,R=0.392)。结论:1、基于显微切割的侵袭性乳腺癌和原位导管癌组织来源的表达谱芯片数据,成功构建乳腺癌实质-基质互作网络;2、与乳腺原位导管癌相比,侵袭性乳腺癌中肿瘤实质与基质间细胞因子互作交流方式变化明显;3、ccr7可能介导了乳腺癌中细胞凋亡、G2M检查点执行及IL6/JAK/STAT3通路联络等生物学行为;4、ccr7可能通过促进表皮-间质转化参与调控乳腺癌的侵袭转移过程。

关键词：肿瘤微环境乳腺癌实质-基质互作网络高通量芯片数据 ccr7

胰腺癌中SLC、ccr7的表达及与血管生成、淋巴管生成相关性的研究

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胰腺癌中SLC、CCR7的表达及与血管生成、淋巴管生成相关性的研究

作者：赵文华山东省医学科学院

学位级别：硕士

目的 (1)研究胰腺癌中次级淋巴组织趋化因子(SLC)及其受体ccr7的表达情况,探讨其表达与胰腺癌临床病理关系;(2)探讨SLC、ccr7的表达与胰腺癌中MVD、MLVD间的关系,阐明其在胰腺癌血管生成、淋巴管生成中的作用。方法收集包括胰腺癌病... 详细信息

目的 (1)研究胰腺癌中次级淋巴组织趋化因子(SLC)及其受体ccr7的表达情况,探讨其表达与胰腺癌临床病理关系;(2)探讨SLC、ccr7的表达与胰腺癌中MVD、MLVD间的关系,阐明其在胰腺癌血管生成、淋巴管生成中的作用。方法收集包括胰腺癌病灶、癌旁组织(距癌2mm以内)、正常胰腺组织和胰周淋巴结的胰腺癌病例30例,临床资料完整并获知情同意。 (1)免疫组织化学SP法检测胰腺癌病灶、癌旁组织、正常胰腺组织和胰周淋巴结中的中SLC、ccr7、VEGF-C和VEGF-D蛋白的表达情况,分析SLC、ccr7、VEGF-C和VEGF-D蛋白的表达与胰腺癌临床病理因素的关系,分析在胰腺癌进展和淋巴结转移中的作用;(2)提取标本总RNA进行RT-PCR扩增,检测SLC、ccr7、VEGF-C和VEGF-D mRNA在胰腺癌病灶、癌旁组织、正常胰腺组织以及胰周淋巴结中的表达情况。采用实时荧光定量PCR检测标本中SLC和ccr7 mRNA相对于内参照β-actin mRNA的表达量,并进行定量分析,分析与胰腺癌淋巴管生成和淋巴结转移的关系;(3)以CD34标记血管内皮细胞、VEGFR-3标记淋巴管内皮细胞,免疫组织化学SP法检测胰腺癌中CD34和VEGFR-3的表达情况,形态计量学图象分析法测定MVD、MLVD,并分析与胰腺癌临床病理因素的关系。分析SLC、ccr7的表达与胰腺癌MVD、MLVD之间的关系,阐明其在胰腺癌血管生成、淋巴管生成中的关系和作用。采用SPSS10.0统计软件进行统计学分析。结果 (1)免疫组织化学SP法检测发现SLC蛋白主要定位于正常胰腺细胞的细胞膜和/或细胞浆。在30例标本中SLC蛋白在胰腺癌组织中呈低表达状态,阳性率为16.7%(5/30);在癌旁组织和胰周淋巴结均呈中等表达状态,阳性率分别为43.3%(13/30)和46.6%(14/30);而SLC蛋白在正常胰腺组织中高表达,阳性率为76.7%(23/30)。RT-PCR和实时荧光定量PCR结果也证实SLC在胰腺癌中呈低表达状态,在癌旁组织和胰周淋巴结均呈中等表达状态,而在正常胰腺组织中呈高表达状态,与胰腺癌中的表达相比较差异均具有统计学意义(Pccr7蛋白主要表达于胰腺癌细胞的细胞膜和/或细胞浆内,在胰腺癌组织、癌旁组织和胰周淋巴结均呈高表达状态,阳性率分别为76.7%(23/30)、66.7%(23/30)和70.0%(21/30);在正常胰腺组织中呈低表达状态,阳性率为30.0%;同时还发现ccr7蛋白在胰腺静脉平滑肌和淋巴结外脂肪组织也有阳性表达情况。RT-PCR和实时荧光定量PCR结果也证实ccr7在胰腺癌组织、癌旁组织以及胰周淋巴结均呈高表达状态,三者相比较无显著统计学差异(P>0.05),而在正常胰腺组织呈低表达状态(P0.05),说明MVD与胰腺癌的淋巴结转移无关。 (4)胰腺癌组织中MLVD在TNM分期III～IV期组显著高于I～II期组(P0.05);提示MLVD与胰腺癌组织分化程度无关(P=0.194)。 (5)30例胰腺癌组织中, SLC蛋白阴性表达者的MVD显著高于阳性者(P=0.012),说明SLC蛋白的表达与MVD有显著的相关性,提示胰腺癌中SLC的低表达与肿瘤的微血管生成的增加具有密切的关系。SLC蛋白的阳性表达者与阴性表达者中MLVD无明显差异(P>0.05),提示SLC与胰腺癌的微淋巴管生成无明显相关性。 (6)30例胰腺癌组织中,ccr7蛋白阳性表达者的MLVD明显高于阴性者,两组比较其差异具有显著的统计学意义(P=0.004),说明ccr7可能参与胰腺癌的淋巴管生成过程,其高表达与胰腺癌中微淋巴管的生成有密切关系。 (7)30例标本中VEGF-C蛋白在胰腺癌组织、癌旁组织和胰周淋巴结中呈高表达状态,其阳性表达率分别为73.3%、66.7%和63.3%;而在正常胰腺组织呈低表达状态,阳性表达率为43.3%,与胰腺癌中的表达相比具有显著的统计学意义(P7%、50.0%和53.3%;而在正常胰腺组织呈低表达状态,阳性

关键词：次级淋巴组织趋化因子 ccr7 淋巴管生成血管生成胰腺肿瘤

CXCR4、ccr7在宫颈癌中的表达与淋巴结转移的关系

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CXCR4、CCR7在宫颈癌中的表达与淋巴结转移的关系

作者：戴宜霏大连医科大学

学位级别：硕士

目的：宫颈癌淋巴结转移是一个多基因参与的复杂过程。本研究通过检测趋化因子受体4(CXC chemokine receptor4,CXCR4)、趋化因子受体7(C-C chemokine receptor7，ccr7)、血管内皮生长因子C（vascular endothelial growth factor C，VEGF-C）、血管内皮生长因子D（vascular endothelial growth factor C，VEGF-D）在正常宫颈、宫颈上皮内瘤变（CINII-III）、宫颈癌组织中的表达，探讨上述肿瘤转移相关因子与宫颈癌的临床病理因素，尤其是淋巴转移的关系。材料与方法：宫颈癌病理组织芯片包含59例患者的宫颈组织蜡块，其中正常宫颈组织9例，宫颈上皮内瘤变组织（CINII-III）2例，宫颈癌48例。宫颈癌临床分期依照按国际妇产科联盟（FIGO，2009年）标准，I期宫颈癌37例， II-III期宫颈癌11例;病理类型：鳞癌33例，腺癌15例;病理分级：高分化8例，中分化38例，低分化8例，1例因取材局限无法分级;淋巴结转移：无转移者39例，有转移者9例。实验采用免疫组化SABC法，应用兔抗人CXCR4多克隆抗体、兔抗人ccr7多克隆抗体、兔抗人VEGF-C多克隆抗体、兔抗人VEGF-D多克隆抗体，检测它们在正常宫颈、CINII-III、宫颈癌组织中的表达情况，免疫组化结果由两名病理医生以同一评分标准，在双盲的情况下进行判读。实验结果采用SPSS16.0进行统计学分析，研究中率的比较采用卡方检验，多因素分析采用logistic回归，CXCR4、ccr7、VEGF-C、VEGF-D表达情况两两之间相关性分析采用spearman相关性分析。结果：1. CXCR4、ccr7、VEGF-C、VEGF-D在正常宫颈组织、CINII-III、宫颈癌中的表达：CXCR4、ccr7主要阳性定位于宫颈癌的细胞浆及细胞核中，VEGF-C、VEGF-D主要阳性定位于宫颈癌细胞的胞浆中，VEGF-D偶见细胞核表达，阳性染色为棕黄色颗粒。因CINII-III病例过少，故未对其进行统计学分析。在正常宫颈组织、宫颈癌组织中，CXCR4的阳性表达率分别为0.00%（0/9）、64.58%(31/48),两组之间差异有统计学意义（P=0.001），另外，在两例CINII-III的组织中，有1例阳性表达CXCR4;ccr7的阳性表达率分别为0.00%（0/9）、52.08%（25/48），两组之间差异有统计学意义（P=0.012），在两例CINII-III的组织中，有1例阳性表达ccr7;VEGF-C的过表达率分别为33.33%（3/9）、64.58%（31/48），两组之间表达率差异无统计学意义（P=0.167）,2例CINII-III均出现VEGF-C的过表达;VEGF-D的阳性表达率分别为11.11%（1/9）、47.92%（25/48），两组组织之间差异无统计学意义（P=0.057），两例CINII-III的组织中，有1例阳性表达VEGF-D。2.宫颈癌组织中CXCR4、ccr7、VEGF-C、VEGF-D的表达与临床病理因素的关系：CXCR4在宫颈鳞癌中的阳性表达率显著高于宫颈腺癌组织中的表达，差异有统计学意义（P=0.002）。CXCR4在宫颈癌淋巴结转移组中阳性表达率高于无淋巴结转移组，差异有统计学意义（P=0.038），但在不同年龄组、不同肿瘤分期、不同病理分化组织中的表达率无统计学差异（P均>0.05），提示CXCR4的表达与宫颈癌病理类型及淋巴结转移相关，但与患者的年龄、肿瘤分期、病理分化无关;ccr7在宫颈癌淋巴结转移组中阳性表达率高于无淋巴结转移组，差异有统计学意义（P=0.037），但ccr7的在不同年龄分组、不同肿瘤分期、不同病理分化及不同组织类型中的表达率无统计学差异（P均>0.05），提示ccr7的表达与宫颈癌淋巴结转移相关，与患者的年龄、疾病分期、病理分化、病理类型无关;VEGF-C在II-III期宫颈癌中过表达率显著高于I期宫颈癌组（P=0.015），在宫颈癌淋巴结转移组中的过表达率高于无淋巴结转移组（P=0.038），但在不同年龄分组、不同病理类型、不同病理分化的组织中表达率无统计学差异（P均>0.05），提示VEGF-C过表达与宫颈癌分期、淋巴结转移相关，与患者年龄、病理类型、病理分化无关;VEGF-D在II-III期宫颈癌中的阳性表达率高于I期宫颈癌组（P=0.025），在宫颈鳞癌中VEGF-D的阳性表达率高于腺癌组（P=0.017），VEGF-D在宫颈癌淋巴结转移组中的阳性表达率高于无淋巴结转移组（P=0.037），但在不同年龄分组、不同病

关键词：宫颈癌淋巴结转移 CXCR4 ccr7 VEGF-C VEGF-D

小鼠ccr7重组腺病毒转染未成熟树突状细胞的实验研究

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小鼠CCR7重组腺病毒转染未成熟树突状细胞的实验研究

作者：郭浩第三军医大学

学位级别：硕士

研究背景和目的临床上同种异体皮肤移植是目前大面积深度烧伤患者早期创面覆盖最直接、有效的治疗方法,但是由于皮肤的强烈抗原特性,导致移植后3周左右外源皮肤就会发生不可逆的排斥反应,极大抑制了自体微粒皮混合大张异体皮移植效果... 详细信息

研究背景和目的临床上同种异体皮肤移植是目前大面积深度烧伤患者早期创面覆盖最直接、有效的治疗方法,但是由于皮肤的强烈抗原特性,导致移植后3周左右外源皮肤就会发生不可逆的排斥反应,极大抑制了自体微粒皮混合大张异体皮移植效果。如何成功诱导出皮肤移植后的免疫耐受,临床上至今未发现有效的措施。树突状细胞(dendritic cell ,DC)是目前已知的功能最强大的专职抗原提呈细胞,在免疫反应中发挥了极其重要的作用。DC的分化发育过程伴随着DC由未成熟的前体细胞分化发育为成熟细胞,细胞的形态、表面标志以及生物学功能等都发生了相应变化。作为DC未成熟的形式--- imDC(immature dendritic cell)因为其功能上最显著的特点就是可以诱导T淋巴细胞的特异性低应答而成为当前研究免疫耐受策略的热点,这在我们上一个国家自然科学基金项目(No.30271341)中也得到证实。利用imDC或者基因修饰DC进行的联合移植实验已经在肾、肝、心脏、胰腺和小肠等器官中取得了令人较为满意的效果,这为皮肤移植实验提供了非常有利的依据。 DC的发育成熟过程伴随着其表型的变化,包括摄取能力减弱和MHC类分子、共刺激分子的表达上调,最终变成强大的抗原提呈细胞。研究发现imDC在炎性介质作用下逐渐迁移成熟的过程中,其表面趋化因子受体7(Chemokine receptor-7, ccr7)表达上调。通过ccr7与其配体MIP3β(即CCL19)和SLC(即CCL21)的相互作用,引导DC趋化迁移至淋巴结,由此ccr7被认为是成熟DC(mature DC,mDC)迁移归巢完成抗原递呈从而激活初始T细胞的主要受体之一。目前ccr7趋化迁移的能力在部分恶性肿瘤的转移中得到证实,表明ccr7严格调控了肿瘤细胞的转移。肿瘤细胞这种非随机的、有组织器官选择性的转移过程类似于免疫刺激过程中树突状细胞的定向迁移。基于ccr7具有非常重要的趋化迁移功能,若DC成熟度越高,ccr7表达更强,则免疫系统呈现更为强劲的免疫应答,反之则诱导免疫耐受,然而,imDC由于缺乏ccr7的表达,向淋巴结的趋化迁移特性较弱,长时间处于非T细胞区易受各种炎症因子或者外来抗原的刺激而发育为mDC,严重影响其诱导免疫耐受的效果。基于以上分析,本研究拟在国家自然科学基金的资助下,通过构建含有小鼠ccr7的重组腺病毒,尝试在imDC上建立ccr7的表达,使imDC获得原本mDC才具有的高效迁移能力,避免imDC在外周组织向成熟状态的分化,有效地确保其诱导免疫耐受功能的发挥,为临床上大面积深度烧伤患者早期创面覆盖引起的免疫排斥提供新的解决方法和思路。方法 1、提取小鼠胸腺总RNA,应用逆转录PCR(RT-PCR)方法,以自行设计的带有酶切位点的引物,扩增获得ccr7基因全部序列,经过T-A克隆,酶切亚克隆到穿梭质粒pAdTrack-CMV上,在BJ5183菌内和pAdeasy-1同源重组,筛选阳性克隆,酶切鉴定,线性化后脂质体法转染HEK293细胞进行包装、PCR鉴定及扩增,得到含有ccr7基因的重组腺病毒,并根据报告基因GFP测定病毒滴度。 2、小剂量rmGM-CSF和rmIL-4联合诱导培养BALB/c小鼠骨髓来源的imDC,光镜下观察并于第6天收获;将上述构建的重组腺病毒转染imDC,根据报告基因绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP),检测重组腺病毒的感染效率;以空病毒为对照,应用逆转录PCR技术和免疫印迹(western blot)法,检测转染3天后imDC上ccr7基因在mRNA及蛋白水平表达的变化。结果 1、成功构建了小鼠ccr7重组腺病毒载体,重组腺病毒滴度可达1×109U /ml。 2、培养的imDC疏松贴壁生长,表面可见不规则的树枝状突起,体积较前增大;荧光显微镜下可见转染腺病毒的细胞膜表面染有绿色荧光,呈明显的不规则的毛刺样突起。 3、重组腺病毒转染imDC后,感染效率可达70%,ccr7在mRNA及蛋白表达上与空病毒组相比明显增高。结论 1、成功构建小鼠ccr7基因重组腺病毒载体。获得了高滴度的重组腺病毒。 2、小鼠骨髓来源的单核细胞在应用低剂量rmGM-CSF和rmIL-4联合刺激诱导后获得具有典型形态特征的imDC。 3、构建的重组腺病毒感染imDC后,ccr7的mRNA及蛋白表达明显增高,成功地在imDC上建立了ccr7的表达,并再次证明所构建的腺病毒载体方法正确,转染效率高,能够有效表达目的基因,具有较高的感染力。这为进一步研究转染ccr7的imDC的趋化迁移功能改变及其诱导皮肤移植免疫耐受提供了实验基础和依据。

关键词：未成熟树突状细胞免疫耐受重组腺病毒 ccr7

趋化因子受体ccr7在非小细胞肺癌组织中的表达及其临床意义

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苏州大学学报（医学版） 2009年第4期29卷 705-706,F0002页

作者：陈宇平穆传勇翁根龙宋丽丽黄建安吴江市第三人民医院呼吸科江苏吴江215228 苏州大学附属第一医院呼吸科江苏苏州215006

目的探讨非小细胞肺癌组织中趋化因子受体7(ccr7)的表达及其临床意义。方法采用免疫组织化学法检测经外科手术切除的60例非小细胞肺癌组织及15例癌旁组织标本中ccr7的表达情况。结果肺癌组织中ccr7阳性细胞表达率较癌旁组织明显增加;有... 详细信息

目的探讨非小细胞肺癌组织中趋化因子受体7(ccr7)的表达及其临床意义。方法采用免疫组织化学法检测经外科手术切除的60例非小细胞肺癌组织及15例癌旁组织标本中ccr7的表达情况。结果肺癌组织中ccr7阳性细胞表达率较癌旁组织明显增加;有淋巴结转移组的ccr7阳性细胞浸润程度明显高于无淋巴结转移组的;Ⅲ～Ⅳ期肺癌ccr7阳性表达率明显高于Ⅰ～Ⅱ期。上述差异均有统计学意义(均Pccr7表达与肺癌临床分期及淋巴结转移有关,可能参与肺癌的免疫逃逸和疾病进展。

关键词：肺癌趋化因子受体 ccr7