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Activation of TLR7 increases ccnd3 expression via the downregulation of miR-15b in B cells of systemic lupus erythematosus

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Cellular & Molecular Immunology 2016年第6期13卷 764-775页

作者： Deshan Ren Fei Liu Guanjun Dong Ming You Jianjian Ji Yahong Huang Yayi Hou Hongye Fan The State Key Laboratory of Pharmaceutical Biotechnology Division of Immunology Medical School Nanjing University Nanjing 210093 People's Republic of China School of Life Science and Technology China Pharmaceutical University Nanjing 210009 Jiangsu People's Republic of China Jiangsu Key Laboratory of Molecular Medicine Nanjing 210093 People's Republic of China

Systemic lupus erythematosus （SLE） is an autoimmune disease characterized by B-cell hyperreactivity. The Toll-like receptor 7 （TLR7） signaling pathway is abnormally activated in SLE B cells. CyclinD3 （ccnd3） plays an important role in B-cell proliferation, development, and differentiation. Although previous studies focused on the B cell-intrinsic role of TLR7 for the development of spontaneous germinal centers, the influence of TLR7 on ccnd3 in SLE B cells is still not clear. Here, we used a B-cell profiling chip and found that ccnd3 was related to SLE and significantly elevated in SLE B cells. Moreover, we determined that the expression level of ccnd3 was higher, while miR-15b was significantly lower in the B cells from SLE patients and ***-Faslpr/J lupus mice compared to normal subjects. Furthermore, we demonstrated that the activation of TLR7 dramatically increased ccnd3 expression but significantly decreased miR-15b in B cells in vitro and we identified that ccnd3 is a direct target of miR-15b. To further confirm our results, we established another lupus model by topically treating C57BL/6 （B6） mice with the TLR-7 agonist imiquimod （IMQ） for 8 weeks according to the previously described protocol. Expectedly, topical treatment with I MQ also significantly increased ccnd3 and decreased miR-15b in B cells of B6 mice. Taken together, our results identified that the activation of TLR7 increased ccnd3 expression via the downregulation of miR-15b in B cells; thus, these findings suggest that extrinsic factor-induced ccnd3 expression may contribute to the abnormality of B cell in SLE.

关键词： ccnd3 miR-15b TLR7

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TLR7/MiR-15b信号轴调节狼疮B细胞ccnd3表达的机制研究

TLR7/MiR-15b信号轴调节狼疮B细胞CCND3表达的机制研究

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作者：任德善南京大学

学位级别：硕士

系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一种常见的典型自身免疫性疾病,以B细胞的过度活化、T细胞的异常激活为主要特征。B细胞异常活化和功能异常对于SLE的发病极为关键,但关于SLE B细胞异常病变的分子机制仍不清楚。近... 详细信息

系统性红斑狼疮(Systemic lupus erythematosus, SLE)是一种常见的典型自身免疫性疾病,以B细胞的过度活化、T细胞的异常激活为主要特征。B细胞异常活化和功能异常对于SLE的发病极为关键,但关于SLE B细胞异常病变的分子机制仍不清楚。近年来研究表明,TLR7在SLE发病进程中具有重要作用。我们实验室在寻找其发病机制过程中发现：外部因素如TLR7配体、IFN-α和BCR配体刺激参与SLE中的B细胞的异常病变。Cyclin D3 (ccnd3)是细胞周期蛋白D家族的三个成员之一,最早发现它能够调控细胞G1到S期的转换,而最近研究表明,其在B细胞的增殖、发育以及分化过程中起到至关重要的作用。但是TLR7是否能够影响ccnd3的表达,进而影响B细胞的功能,还未见报道。基于以上研究,我们推测TLR7能够影响B细胞ccnd3的表达来调控B细胞的相关功能。本研究首先比较了活动期SLE与正常人B细胞中表达基因的差异;其次对基因芯片结果进行了生物信息学分析,发现ccnd3在活动期SLE的B细胞中异常表达;研究还发现激活TLR7通路能够上调B细胞的ccnd3表达,且下调miR-15b的表达;进一步发现ccnd3是miR-15b的直接靶标;为了确证TLR7通路的活化对B细胞表达ccnd3的作用机制,我们建立了TLR7配体咪喹莫特诱导的小鼠狼疮样模型,发现TLR7信号活化确实通过miR-15b上调ccnd3的表达影响B细胞的功能,提示B细胞中ccnd3的异常表达可能参与SLE疾病发展进程。***活动期患者B细胞芯片差异表达基因的分析首先,我们从5例活动期SLE患者和5例正常人外周血中分离B细胞,制作基因芯片。筛选出两组间差异表达基因1812条,其中上调基因958条,下调基因854条。紧接着我们分别抽取了4个上调基因和4个下调基因对芯片结果进行了验证,结果表明芯片结果真实可信。进一步对差异基因进行GO分析发现,上调差异基因主要富集在IFNa炎症通路和细胞周期相关功能。基于GO之间的层级从属关系构建GO-TREES,对功能进行总结发现上调基因显著性功能主要集中在有丝分裂方面。最后,显著性Pathway分析和蛋白相互作用表达网络分析发现ccnd3在上调基因中处于中心节点位置。以上结果提示：ccnd3可能在SLE的发病进程中起到重要作用。而后,我们验证了ccnd3在SLE患者和狼疮鼠B细胞中的表达是异常升高的。***7通路通过miR-15b调控B细胞ccnd3的分子机制我们上述实验结果证明ccnd3在SLE患者B细胞中异常升高。已有文献报道ccnd3对B细胞早期发育以及生发中心B细胞的形成具有不可或缺的作用。我们首先通过网站预测能够靶向ccnd3的miRNAs,发现miR-15家族能够靶向ccnd3。实验表明在SLE患者和狼疮鼠B细胞中ccnd3与miR-15b的表达负相关;进一步用TLR7配体R848刺激B细胞发现,ccnd3与miR-15b的表达也负相关,且miR-15b能够直接靶向ccnd3的3'-UTR。我们建立了TLR7配体咪喹莫特诱导的小鼠狼疮样模型,确证TLR7通路的活化在体内能够上调B细胞表达ccnd3,而下调miR-15b的表达。综上所述,我们首先通过基因芯片分析发现ccnd3在SLE的发病过程中异常表达。并且发现,在SLE患者和狼疮小鼠中ccnd3表达上调,其靶向miRNA miR-15b表达下调。这些结果显示,TLR7通路的活化可能够通过下调miR-15b的表达来上调B细胞ccnd3的表达,提示B细胞中ccnd3的异常表达可能参与SLE疾病发展进程。

关键词：系统性红斑狼疮 B细胞 Toll样受体7 ccnd3 miR-15b

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ccnd基因家族成员分子进化分析

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医学分子生物学杂志 2014年第3期11卷 144-149页

作者：赵文文朱婧颖韩颖颖上海理工大学医疗器械与食品学院系统生物医学研究中心上海市200093

目的对细胞周期素（cyclinD）家族成员进行分子生物学进化及功能预测，为临床上检测骨质疏松提供更多分子生物学信息。方法对ccnd基因家族成员包括ccnd1、ccnd2和ccnd3序列进行分子进化分析，并在所有科属范围和人型总科范围内，计算了... 详细信息

目的对细胞周期素（cyclinD）家族成员进行分子生物学进化及功能预测，为临床上检测骨质疏松提供更多分子生物学信息。方法对ccnd基因家族成员包括ccnd1、ccnd2和ccnd3序列进行分子进化分析，并在所有科属范围和人型总科范围内，计算了同源ccnds之间的同义和非同义突变频率。结果ccnd1和ccnd2具有较高的序列相同性，而ccnd3的非同义突变率较高，尤其在人型总科各属形成以后，平均每年的同义和非同义突变频率都高于ccnd1和ccnd2。结论ccnd2与ccnd1序列相同程度高．而ccnd3在序列和进化速率上都显著不同，所以ccnd2可以作为骨密度关联研究的候选基因。

关键词：人类细胞周期素D ccnd1 ccnd2 ccnd3 分子进化

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二酰基甘油激酶α（DGKA）在非小细胞肺癌发生中的作用及机制研究

二酰基甘油激酶α（DGKA）在非小细胞肺癌发生中的作用及机制研究

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作者：周冬华中科技大学

学位级别：硕士

目的:肺癌是全球高发的恶性肿瘤之一。寻找新的肺癌肿瘤标志物和治疗靶点对于改善病人的临床预后尤为重要。二酰基甘油激酶α(DGKA)是二酰基甘油激酶家族里第一个被鉴定的关键成员,可以促进多种肿瘤的进展。然而,非小细胞肺癌的发生与D... 详细信息

目的:肺癌是全球高发的恶性肿瘤之一。寻找新的肺癌肿瘤标志物和治疗靶点对于改善病人的临床预后尤为重要。二酰基甘油激酶α(DGKA)是二酰基甘油激酶家族里第一个被鉴定的关键成员,可以促进多种肿瘤的进展。然而,非小细胞肺癌的发生与DGKA的关系尚未完全阐明。因此,本研究旨在探究DGKA在肺癌组织中的表达水平,揭示其在肺癌发生中的作用及下游机制,并评估DGKA新型抑制剂利坦色林抑制肺癌发生的作用及其临床转化价值。方法:(1)检索UALCAN数据库中的肺癌组织和正常肺组织DGKA的mRNA表达水平,比较两者是否存在差异。(2)通过免疫组化染色检测肺腺癌组织芯片中DGKA的蛋白表达量,通过Kaplan-Meier法分析肺癌病人的预后与DGKA之间的关联性。(3)肺癌细胞中的DGKA经SiRNA/ShRNA敲低后,通过生长计数、平板克隆形成以及EdU实验检测肺癌细胞的生长和增殖能力变化。(4)通过生长计数、平板克隆形成以及EdU实验评估肺癌细胞被利坦色林处理后的生长和增殖能力变化。(5)通过裸鼠皮下移植瘤模型探索利坦色林在体内的抗肿瘤效果。(6)在A549细胞中,通过RNA测序检测DGKA敲低后的基因mRNA水平变化。(7)利用RT-qPCR实验验证敲低DGKA后的差异基因的mRNA含量。(8)Western blot验证RT-qPCR实验筛选出的基因的蛋白含量。(9)沉默肺癌细胞DGKA的表达后,通过Flag-ccnd3质粒对肺癌细胞过表达外源的ccnd3蛋白,并利用平板克隆形成和EdU实验探索过表达ccnd3能否逆转DGKA对肺癌细胞增殖的影响。结果:(1)UALCAN数据库显示DGKA在肺腺癌和肺鳞癌组织中的mRNA水平高于邻近的正常组织。(2)肺腺癌组织芯片的免疫组化结果表明DGKA在肺腺癌组织中的蛋白表达高于癌旁组织,且病人的总体生存期与DGKA的表达量负相关。(3)肺癌细胞在被沉默DGKA后,生长和增殖能力均受损。(4)肺癌细胞在被利坦色林作用48 h后,其生长和增殖能力受到了削弱。(5)利坦色林在不影响裸鼠体重的情况下抑制了皮下瘤的生长,同时在裸鼠的重要脏器中没有观察到明显毒性作用。(6)ccnd3在mRNA和蛋白水平都随DGKA沉默而表达下调。(7)在肺癌细胞中过表达外源ccnd3后能够部分回复DGKA对肺癌细胞增殖的影响。结论:(1)肺癌中的DGKA明显上调,高水平的DGKA与肺癌患者较短的总体生存期有关。(2)DGKA通过诱导其下游的ccnd3的表达促进肺癌的发生。(3)利坦色林可以通过抑制DGKA功能发挥抗肿瘤效应。

关键词：非小细胞肺癌 DGKA 利坦色林 ccnd3

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LncRNA Pvt1在心肌梗死中的作用和机制研究

LncRNA Pvt1在心肌梗死中的作用和机制研究

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作者：胡宇重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:本研究旨在研究长链非编码RNA Pvt1在心肌细胞凋亡中的作用,以及涉及Pvt1-micro RNA-m RNA轴的机制,最终阐明Pvt1在心肌细胞凋亡中的作用。方法:1.细胞实验:通过转染小干扰RNA(si RNA)抑制细胞中Pvt1(si-Pvt1),小鼠HL-1细胞随机分... 详细信息

目的:本研究旨在研究长链非编码RNA Pvt1在心肌细胞凋亡中的作用,以及涉及Pvt1-micro RNA-m RNA轴的机制,最终阐明Pvt1在心肌细胞凋亡中的作用。方法:1.细胞实验:通过转染小干扰RNA(si RNA)抑制细胞中Pvt1(si-Pvt1),小鼠HL-1细胞随机分为对照组(Control),缺氧处理组(Hypoxia),缺氧+阴性对照组(Hypoxia+si-NC),缺氧+si-Pvt1组(Hypoxia+si-Pvt1)。Western blot检测、RT-q PCR、流式细胞术检测细胞凋亡水平及蛋白表达。3.动物实验:心肌梗死模型前7天通过尾静脉注射腺相关病毒为载体的sh RNA-Pvt1建立体内Pvt1敲低模型(sh-Pvt1),采用左前降支结扎(LAD)诱导的心肌梗死模型7天后,采用超声心动图测量心功能,并用HE染色评估小鼠心脏组织病理损伤,Western blot检测凋亡蛋白表达变化。3.机制探究实验:lnc RNA相关micro RNA通过生物信息学工具预测得到,并通过双荧光素酶实验进一步验证。为了研究Pvt1和miR-216的协同调节作用,共转染si-Pvt1与miR-216 mimics后采用Western blot检测凋亡基因表达变化。将细胞分为缺氧+si-NC组与缺氧+si-Pvt1组,RNA测序筛选差异表达基因,与利用生物信息学工具预测miR-216的靶基因交叉,筛选出感兴趣基因ccnd3。同时转染miR-216 mimics与过表达ccnd3,Western blot检测凋亡蛋白表达情况。结果:1.细胞实验:Pvt1在缺氧诱导的小鼠心肌细胞HL-1中高表达,抑制Pvt1可减少心肌细胞凋亡。2.动物实验:心肌梗死导致小鼠心肌损伤,抑制Pvt1可改善心肌梗死小鼠心脏功能,阻止部分炎症细胞浸润,减少心肌细胞凋亡。3.机制实验:PVT1作为miR-216的海绵,促进ccnd3的表达,从而调控心肌细胞凋亡。结论:Pvt1可能通过miR-216/ccnd3轴来促进心肌梗死诱导的心肌细胞凋亡。

关键词： LncRNA Pvt1 细胞凋亡心肌梗死 miR216 ccnd3

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细胞周期素CCNB3去泛素化酶USP10的质谱学发现及其在多发性骨髓瘤中的意义研究

细胞周期素CCNB3去泛素化酶USP10的质谱学发现及其在多发性骨髓瘤...

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作者：曾坤苏州大学

学位级别：硕士

研究背景和目的:多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一类难治性浆细胞恶性肿瘤,特征性表现为多种染色体易位和癌基因的过度表达。其中t(6;14)染色体易位引起细胞周期素ccnd3的高表达。ccnd3作为细胞周期的重要调节因子,已有文章报道... 详细信息

研究背景和目的:多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)是一类难治性浆细胞恶性肿瘤,特征性表现为多种染色体易位和癌基因的过度表达。其中t(6;14)染色体易位引起细胞周期素ccnd3的高表达。ccnd3作为细胞周期的重要调节因子,已有文章报道可通过泛素蛋白酶体途径(Ubiquitin-Proteasome Pathway,UPP)降解,但参与调控ccnd3泛素化的去泛素化酶(deubiquitinase,DUB)目前没有报导。本课题旨在寻找ccnd3的去泛素化酶,并探究其在MM中的作用和可能的调节机制,为理解MM发生和精准治疗提供新的思路。研究方法:我们首先利用小干扰RNA在MM细胞系中敲低ccnd3检测MM细胞周期和凋亡变化;通过将Flag-ccnd3质粒转染到HEK293T细胞中,利用标签抗体免疫共沉淀ccnd3相互作用蛋白,SDS-PAGE凝胶电泳法分离免疫共沉淀蛋白样品后,经银染、胶内酶解等步骤制得样品送经LC-MS/MS质谱学分析;质谱结果显示去泛素化酶USP10可能与ccnd3相互结合,于是我们利用免疫共沉淀方法在HEK293T细胞和MM细胞系OPM2和KMS11中分别验证寻找到的USP10与ccnd3是否存在相互结合,并构建不同的USP10截断体质粒与ccnd3质粒共转染到HEK293T细胞中,探究USP10与ccnd3相互作用的具体结构域;通过收集不同种血液肿瘤细胞系做蛋白表达谱分析USP10和ccnd3的表达相关性;利用Western blot方法检测过表达或者敲低USP10后ccnd3蛋白表达水平,同时采用放线菌酮试验探究过表达USP10对ccnd3蛋白稳定性影响;进一步在HEK293T细胞和MM细胞系OPM2和KMS11中过表达或者敲低USP10,通过免疫沉淀和Western blot分析USP10对ccnd3泛素化的影响;利用USP10的小分子抑制剂Spautin-1处理MM细胞系OPM2和KMS11检测ccnd3蛋白表达的情况;并在HEK293T细胞过表达USP10情况下给予不同浓度Spautin-1处理考察对ccnd3泛素化的影响;在OPM2细胞中过表达USP10检测细胞周期信号通路的变化,同时敲低USP10检测ccnd3与CDK4结合情况,最后利用小干扰RNA敲低USP10采用MTT法探究对MM细胞增殖的影响。研究结果:细胞周期和凋亡实验结果显示当ccnd3被特异性siRNA敲低后MM细胞出现G1/S期阻滞,G1期细胞由36.311%上升到59.512%,同时细胞凋亡也明显增加;利用LC-MS/MS质谱学分析对比蛋白质数据库在ccnd3的相互作用蛋白中发现6条USP10的特异性肽段,提示USP10可能存在与ccnd3相互作用;免疫共沉淀结果证实无论是在HEK293T细胞中还是在MM细胞系OPM2和KMS11中USP10均与ccnd3存在相互结合,并且通过构建USP10的截断体发现USP10的C端是与ccnd3结合的关键结构域;通过分析蛋白表达谱,结果显示USP10与ccnd3在多数血液肿瘤细胞系中存在过表达情况,并且USP10高表达的MM细胞中ccnd3的表达水平也高,通过作图分析发现两者具有良好的表达相关性(pccnd3的蛋白水平上升,半衰期明显延长;而敲低USP10后ccnd3的蛋白水平随之下降;进一步我们发现无论是在HEK293T细胞中还是在MM细胞系OPM2和KMS11中过表达USP10都能减少或去除ccnd3的多聚泛素化,相反敲低USP10后ccnd3的多聚泛素化水平明显增强;利用USP10的小分子抑制剂Spautin-1处理OPM2和KMS11后,ccnd3的蛋白水平呈时间和浓度依赖性方式下调,同时伴随有ccnd3泛素化水平上升;过表达USP10促进细胞周期的进行而敲低USP10则削弱了 ccnd3与CDK4的结合;最后MTT实验结果表明敲低USP10抑制MM细胞的增殖。研究结论:USP10通过与ccnd3的结合,使ccnd3的多聚泛素化水平降低,从而稳定ccnd3蛋白,表现为ccnd3的去泛素化酶,USP10通过ccnd3促进MM细胞周期的进行,从而促进MM细胞增殖。靶向USP10/ccnd3轴可能为MM治疗提供新的思路。

关键词：多发性骨髓瘤 USP10 ccnd3 泛素蛋白酶体途径 LC-MS/MS

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MicroRNA-939在甲状腺癌进展中的作用及机制

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潍坊医学院学报 2022年第2期44卷 85-88页

作者：刘雅歆隋亚那赵建鑫吴红玉王文文潍坊市中医院超声科山东潍坊261041 潍坊市中医院急诊科潍坊市中医院骨关节病科

目的探讨microRNA-939(miR-939)在甲状腺癌中的作用及机制。方法qPCR分析30对甲状腺癌患者组织中miR-939和ccnd3的表达水平。通过CCK-8实验、平板克隆形成实验和Transwell侵袭迁移实验研究miR-939在甲状腺癌中的生物学行为。通过TargetS... 详细信息

目的探讨microRNA-939(miR-939)在甲状腺癌中的作用及机制。方法qPCR分析30对甲状腺癌患者组织中miR-939和ccnd3的表达水平。通过CCK-8实验、平板克隆形成实验和Transwell侵袭迁移实验研究miR-939在甲状腺癌中的生物学行为。通过TargetScan预测miR939的靶基因,通过双荧光素酶活性测定、Western blotting和qPCR进行验证。结果miR-939模拟物过表达miR-939显著抑制TPC-1细胞的增殖、迁移和侵袭,而ccnd3沉默后可以逆转miR-939过表达引起的TPC-1细胞的生物学变化。结论miR-939/ccnd3信号通路是甲状腺癌治疗的新靶点。

关键词：甲状腺肿瘤 microRNA-939 ccnd3 侵袭和迁移增殖

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