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Journal of Animal Science and Biotechnology 2018年第4期9卷 794-802页

作者： Zhenhua Yi Xing Li Wen Luo Zhenqiang Xu Congliang Ji Yan Zhang Qinghua Nie Dexiang Zhang Xiquan Zhang Department of Animal Genetics Breeding and ReproductionCollege of Animal ScienceSouth China Agricultural UniversityGuangzhou 510642GuangdongChina Guangdong Provincial Key Lab of Agro-Animal Genomics and Molecular Breeding and Key Laboratory of Chicken Genetics Breeding and ReproductionMinistry of AgricultureGuangzhou 510642GuangdongChina Wen’s Nanfang Poultry Breeding Co.Ltd Yunfu 527400GuangdongChina

Background: The feed conversion ratio(FCR) and residual feed intake(RFI) are common indexes in measuring feed efficiency for livestock. RFI is a feed intake adjusted for requirements for maintenance and production so these two traits are related. Similarly, FCR is related to feed intake and weight gain because it is their ratio. Cholecystokinin type A receptor(cckar) plays an important role in animal digestive process. We examined the interplay of these three parameters in a local Chinese chicken population.Results: The feed intake(FI) and body weights(BW) of 1,841 individuals were monitored on a daily basis from 56 to 105 d of age. There was a strong correlation between RFI and average daily feed intake(ADFI) and a negative correlation between the FCR and daily gain(r_g=-0.710). Furthermore, we identified 51 single nucleotide polymorphisms(SNPs) in the cckar and 4 of these resulted in amino acid mutations. The C334A mutation was specifically associated with FI and the expected feed intake(EFI)(P cckar gene can be deemed as candidate markers for feed intake and weight gain.

关键词： cckar Chicken FCR RFI SNP

cckar下游效应器的融合蛋白的偏向性信号通路研究

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CCKAR下游效应器的融合蛋白的偏向性信号通路研究

作者：王艺璟山东大学

学位级别：硕士

胰岛β细胞作为唯一一类能够分泌胰岛素的分泌细胞,在机体的血糖调节中起着关键性的作用,而胰岛β细胞的生理活性会受到多种激素的共同调节。在已经发表的众多研究中,由小肠粘膜上皮Ⅰ细胞分泌的胆囊收缩素(Cholecystokinin,CCK)能够通... 详细信息

胰岛β细胞作为唯一一类能够分泌胰岛素的分泌细胞,在机体的血糖调节中起着关键性的作用,而胰岛β细胞的生理活性会受到多种激素的共同调节。在已经发表的众多研究中,由小肠粘膜上皮Ⅰ细胞分泌的胆囊收缩素(Cholecystokinin,CCK)能够通过与胰岛β细胞中表达的胆囊收缩素A受体(Cholecystokinin A receptor,cckar)结合来对胰岛功能进行调节。cckar作为G蛋白偶联受体家族中的一员,与内源性激动剂CCK的剪切变体CCK-8S结合后,会同时激活由Gs,Gq以及β-arrestin-1介导的多条下游信号通路,并调控不同的生理功能。在本实验室的前期研究中,已经证明了cckar受体与CCK-8S相互结合,能够通过激活下游的Gs和Gq信号通路。在胰岛β细胞中,细胞表面的cckar激活后,能够通过Gs信号通路调控胰岛β细胞的胰岛素分泌并改变机体的葡萄糖敏感性,也可以通过Gq信号通路直接影响并促进胰岛素的分泌。cckar与CCK-8s结合后,还能够激活β-arrestin-1信号通路,并促进Bad蛋白的磷酸化来弱化细胞凋亡的进程。这些研究结果表明cckar 下游不同信号通路可调控胰岛β细胞不同的功能.但cckar偏向性途径具体的作用机制和cckar偏向性信号的生理意义尚不明确。基于前期实验结果,我们通过设计并构建cckar与G蛋白或arrestin的人工融合蛋白(cckar-Gs,cckar-Gq 和 cckar-β-arrestin-1),运用 G 蛋白偶联受体经典的下游信号检测手段对于不同融合蛋白的药理学特性进行检测,并进一步检测不同信号偏向性的信号途径对于细胞凋亡的相关作用,研究cckar下游不同信号通路所调控的生理功能,以其为基于cckar配体的糖尿病治疗药物的开发提供理论基础,并为其他GPCR的偏向性信号通路的研究提供新的思路。研究目的运用融合蛋白的技术手段构建cckar-Gs,cckar-Gq和Ccckar-β-aresstin-1融合蛋白,并检测其相应的细胞生物学活性。研究方法1.融合蛋白的构建准备:(1)SLIC-PCR的手段进行融合蛋白的构建;(2)免疫印迹实验检测融合蛋白的表达情况;2.药理学性质检测:(1)使用cAMP-GloSensor的手段检测细胞中cAMP含量在CCK-8s刺激后的变化;(2)使用Fura-2钙成像的手段检测细胞中Ca离子在CCK-8s刺激后的变化;(3)使用免疫印迹的手段检测细胞中ppERK和pBad在CCK-8s刺激后的变化;3.HEK293细胞系上表达不同融合蛋白(cckar-Gs,cckar-Gq,Ccckar-β-aresstin-1)后细胞凋亡情况的检测研究结果人工构建的CKKAR融合蛋白比较野生型的cckar蛋白,能够在很大的程度上提高下游信号的偏向型,能够直接影响并作用于单一的信号通路上,并且cckar-β-arrestin-1融合蛋白的过表达能够显著改善细胞凋亡情况。结论人工构建的cckar融合蛋白能够有效地、偏向性地激活cckar的下游信号通路,可以选择性的行使不同信号通路调控的生理功能。

关键词： cckar biased signaling Gs Gq β-arrestin-1

胆囊收缩素A型受体基因序列变异和表达与略阳乌鸡饲料转化率的关联性研究

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中国农业科学 2022年第22期55卷 4539-4549页

作者：王哲鹏周雯馨贺俊锡虎巧燕赵家悦西北农林科技大学动物科技学院

【背景】食欲和饲料转化率的提高构成了现代肉鸡快速生长的生理基础。胆囊收缩素A型受体（cckar）是介导胆囊收缩素（CCK）饱食信号和消化调节作用的关键受体。鉴于CCK信号在能量平衡调节中的重要作用，cckar的表达水平与鸡的生长性能... 详细信息

【背景】食欲和饲料转化率的提高构成了现代肉鸡快速生长的生理基础。胆囊收缩素A型受体（cckar）是介导胆囊收缩素（CCK）饱食信号和消化调节作用的关键受体。鉴于CCK信号在能量平衡调节中的重要作用，cckar的表达水平与鸡的生长性能密切相关。然而，cckar水平调节鸡生长的确切机制尚不清楚。【目的】通过研究阐明cckar基因表达水平和序列变异与鸡饲料转化率的关系，为鸡生长性状遗传调控研究和饲料转化率选育奠定基础。【方法】测定略阳乌鸡12—16周龄料肉比（公鸡n=62，母鸡n=67）和26—30周龄料蛋比（n=150）。用PCR-RFLP法检测cckar基因内两个同义突变（g.73206714T>C和g.73209189C>T）的基因型。以性别为固定效应，用双因素方差分析检验g.73206714T>C和g.73209189C>T与料肉比的关联性，用单因素方差分析检验2个SNP与料蛋比的关联性。用JASPAR数据库预测g.73206714T>C对转录因子结合位点产生的影响。以g.73206714T>C为标记，选取10只杂合子（CT）公鸡，用PCR-RFLP法检测cckar基因在g.73206714T>C位点等位基因间的表达差异。选取30只带有采食量和料肉比记录的公鸡，用q PCR检测cckar基因在下丘脑、脑垂体、胰腺、胆囊和十二指肠中的表达水平，分析cckar表达水平与采食量和料肉比的相关性。【结果】性别效应对略阳乌鸡料肉比有显著影响（F=29.44,PC与料肉比显著关联（F=8.44,P=0.0004），其中，TT型的料肉比（5.18±0.63）显著低于CC(6.37±1.1)和CT型（6.17±0.95）。CC型和CT型的料肉比无显著差异。g.73206714T>C与性别的互作效应对料肉比的影响不显著。G.73206714T>C对28个转录因子结合位点有潜在影响。等位基因特异性表达试验显示，T等位基因的转录本丰度显著高于C等位基因，表明cckar在等位基因间的表达差异很可能是构成g.73206714T>C与料肉比关联性的遗传基础。略阳乌鸡26—30周龄的平均料蛋比为2.85±0.41。g.73206714T>C和g.73209189C>T的基因型效应对料蛋比的影响均不显著。在5个组织中，cckar基因在胰腺中的表达水平最高，且与采食量呈负相关（r=-0.45, P=0.017）。但是，在其他组织中，cckar的表达水平与采食量的关联性均不显著。对于料肉比性状，cckar基因在胰腺（r=-0.41,P=0.03）和脑垂体（r=-0.57, P=0.0018）中的表达水平越高，料肉比越低。在其他组织中，这种负相关性均不显著。【结论】研究发现cckar基因表达水平上调有利于提高鸡的饲料转化率。G.73206714T>C的T等位基因是一个与cckar基因高表达活性和高饲料转化率显著关联的分子标记。

关键词：鸡生长 cckar 饲料转化率食欲

在胆囊收缩素A型受体基因中筛选影响表达和鸡生长的功能突变

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在胆囊收缩素A型受体基因中筛选影响表达和鸡生长的功能突变

作者：贺俊锡西北农林科技大学

学位级别：硕士

胆囊收缩素A型受体(cckar)介导胆囊收缩素(CCK)饱食信号的受体。cckar表达下调可降低鸡饱食信号阈值,提高鸡的采食量和生长速度。然而,cckar表达下调分子基础目前并不清楚。本研究利用荧光素酶报告基因系统研究cckar基因序列变异的表达... 详细信息

胆囊收缩素A型受体(cckar)介导胆囊收缩素(CCK)饱食信号的受体。cckar表达下调可降低鸡饱食信号阈值,提高鸡的采食量和生长速度。然而,cckar表达下调分子基础目前并不清楚。本研究利用荧光素酶报告基因系统研究cckar基因序列变异的表达调节作用,分析候选突变与鸡生长性状的关联性,旨在筛选影响cckar基因表达和鸡生长的功能调节突变。将cckar基因上游两个片段(-1185/+183 bp和-799/+183 bp)和下游5.6 Mb处一个包含保守元件变异(CSNP5)的片段插入p NL质粒荧光素酶报告基因上游,用双荧光素酶报告基因型系统研究cckar序列的表达调节作用。测定略阳乌鸡蛋用育种核心群一世代(n=347)的6、10、18和22周体重,三世代(n=129)13-16周龄的体重、采食量和料肉比,四世代(n=150)27-30周龄的采食量、产蛋量和饲料转化率,用PCR-RFLP检查报告基因试验筛选出的候选突变(PSNP3和CSNP5)的基因型,用方差分析检验PSNP3和CSNP5与略阳乌鸡生长和饲料转化率性状的关联性。测定一世代(n=40)1-10周体重,用Logistic与Gompertz模型拟合略阳乌鸡早期生长曲线。质粒p NL-1185/+183的快长单倍型的荧光素酶活性显著高于慢长单倍型。但是,当删除片段-1185/+183 5’端的4个突变(PSNP3～PSNP6)后,这种表达活性差异将消失。上述荧光素酶活性差异在质粒p NL CSNP5上也被检查到。这些结果表明PSNP3～PSNP6及CSNP5是影响cckar基因表达的候选突变。为了进一步阐明这些候选突变与鸡生长性状的关联,本研究根据转录因子预测结果着重分析了PSNP3和CSNP5两个突变位点与体重、采食和饲料转化率的关联性。其中,PSNP3与略阳乌鸡27、28周龄的采食量与饲料转化率显著相关,GG基因型采食量显著低于AA型,并且GG基因型饲料转化率显著高于AA基因型。早期生长曲线拟合结果显示Gompertz模型的拟合效果优于Logistic模型,第一拐点在7周出现。通过报告基因实验和关联分析,本研究将cckar基因启动子区变异PSNP3和基因下游保守元件变异CSNP5鉴定为影响cckar基因表达的功能突变。其中PSNP3的G等位基因是关联到低采食量和高饲料转化率的优势等位基因。这些结果为cckar基因生长调节机制的研究奠定基础,为略阳乌鸡饲料利用率分子育种方法的建立提供依据。

关键词： cckar 饱食信号略阳乌鸡采食量饲料转化率

利用CRISPR/Cas9技术构建大鼠cckar敲除载体

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黑龙江科学 2021年第6期12卷 16-18,22页

作者：刘惊涛李知宗林显光陈恒玲中南民族大学生物医学工程学院/脑认知国家民委重点实验室/医学信息分析及肿瘤诊疗湖北省重点实验室武汉430074

cckar在许多疾病的发病机理中具有重要作用。为研究其分子机制,选择利用CRISPR/Cas9基因编辑体系,构建KO载体。根据cckar基因序列设计敲除靶点,通过质粒单酶切、Oligo退火、连接,成功构建了cckar的敲除载体。该质粒的成功构建可为将来CC... 详细信息

cckar在许多疾病的发病机理中具有重要作用。为研究其分子机制,选择利用CRISPR/Cas9基因编辑体系,构建KO载体。根据cckar基因序列设计敲除靶点,通过质粒单酶切、Oligo退火、连接,成功构建了cckar的敲除载体。该质粒的成功构建可为将来cckar基因的功能研究提供重要的基础。

关键词： CRISPR/Cas9 cckar 敲除载体

β-arrestin1在缩胆囊素抗胰岛β细胞凋亡及胰岛素分泌中的作用及机制

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β-arrestin1在缩胆囊素抗胰岛β细胞凋亡及胰岛素分泌中的作用及...

作者：苏静山东大学

学位级别：硕士

缩胆囊素(cholecystokinin, CCK)属于胃肠激素,是进食引起的小肠黏膜Ⅰ细胞分泌的激素,在调节消化和代谢功能方面起着重要作用。已有研究证明,在胰岛上,CCK通过作用于缩胆囊素受体(cholecystokinin A receptor, cckar)调节胰岛素的分泌... 详细信息

缩胆囊素(cholecystokinin, CCK)属于胃肠激素,是进食引起的小肠黏膜Ⅰ细胞分泌的激素,在调节消化和代谢功能方面起着重要作用。已有研究证明,在胰岛上,CCK通过作用于缩胆囊素受体(cholecystokinin A receptor, cckar)调节胰岛素的分泌和胰岛p细胞的数量,然而CCK作用于cckar后的下游信号通路并没有明确的报道。胰腺β细胞膜上的cckar属于G蛋白偶联受体。本文我们表明,八肽缩胆囊素(CCK-8s)激活cckar后诱导了三磷酸肌醇(inositol1,4,5-triphosphate, IP3)和腺苷-3’,5’-环化一磷酸(cAMP)的积累,从而高效地促进了胰岛素分泌。CCK-8s除了激活G蛋白信号传导,也促进了cckar和β-arrestin1的复合物的形成。同时,利用siRNA沉默β-arrestin1后进行实验研究,我们证实,β-arrestin1在CCK-8s促进胰岛素分泌和防止胰腺p细胞凋亡的方面都起着重要作用。 β-arrestin1通过介导的胞内长时相ERK的激活发挥抗凋亡作用,慢速时相激活的ERK激活p90RSK-phosphor-Bad抗凋亡途径并且抑制caspase-3激活。β-arrestin1在cckar在胰腺β细胞中的下游的重要性可以为新的抗糖尿病药物的开发提供方向。 [研究目的] 研究β-arrestin1在缩胆囊素抗胰岛p细胞凋亡及胰岛素分泌中的作用及机制。 [研究方法] 1.β-arrestin1在缩胆囊素抗促进胰岛素分泌中的作用及机制 (1)用Western blot印迹分析技术检查内源性cckar和β-arrestin1的表达. (2) ELISA检测胰岛素分泌的变化。 (3) ELISA检测三磷酸肌醇的变化。 (4) ELISA检测腺苷-3’,5’-环化一磷酸的变化。 2.p-arrestinl在缩胆囊素抗胰岛β细胞凋亡中的作用及机制 (1)使用Hoechst33342染色和Annexin Ⅴ-FITC/PI细胞凋亡检测试剂盒检测高糖诱导的胰腺β细胞的凋亡。 (2)用Western blot印迹分析技术检测p90RSK-phosphor-BAD抗凋亡途径的激活。 (3) SLIC方法构建cckar到pcDNA3.1上,并在N端加flag标签。 (4)免疫共沉淀法检测在HEK293细胞中的β-arrestinl和cckar之间的相互作用。 (5)通过siRNA转染MIN6细胞沉默β-arrestinl的表达,研究β-arrestinl缺失后细胞信号转导、功能的障碍。 [研究结果] 1. p-arrestinl在缩胆囊素抗促进胰岛素分泌中的作用及机制 (1)我们首先证实了小鼠胰岛β细胞中表达cckar。100pM CCK-8s处理小鼠离体胰岛后,胰岛素分泌增高4倍。而1μM选择性cckar拮抗剂氯戊米特(Lorglumide)可以阻断这种效应。同样,100pM CCK-8s处理分离的原代小鼠β胰岛细胞也可以导致胰岛素分泌增加约5倍,其效应也可以被Lorglumide阻断。 (2)100pM CCK-8s诱导MIN6细胞的IP3的升高占卡巴胆碱诱导IP3的升高程度的40%,100pM CCK-8s诱导MIN6细胞的cAMP的升高程度占10nM的GLP-1诱导的cAMP的升高程度的60%。Gq蛋白的下游抑制剂U73122或者Gs蛋白下游PKA抑制剂H89分别抑制CCK-8s促进的胰岛素分泌减少至60%及50%,而同时使用两种抑制剂,则完全抑制CCK-8s诱导MIN6细胞的胰岛素分泌。 2. β-arrestinl在缩胆囊素抗胰岛β细胞凋亡中的作用及机制 (1)高糖作用于MIN6细胞72小时后导致85%的细胞凋亡,当高糖与GLP-1共同作用于细胞时,细胞凋亡可降低到65%。同样的,100pM CCK-8s与高糖同时刺激细胞是MIN6细胞的凋亡比例从85%减少到63%。 (2) CCK-8s导致了浓度依赖性的ERK激活,100pM之后ERK的激活强度不再上升。1uM cckar拮抗剂Lorglumide预处理MIN6细胞后阻断了CCK-8s引起的ERK激活。CCK-8s刺激MIN6细胞促进了两个时期ERK1/2的激活,一个在刺激2分钟时迅速达到高峰,另一个是在刺激后20分钟时达到峰值,激活缓慢而持续。快速磷酸化的ERK1/2在细胞质和细胞核中都存在,然而,慢速磷酸化的ERK1/2存在于细胞质。 (3) CCK-8s刺激敲低P-arrestinl的MIN6细胞,我们发现,快速时相激活的ERK下降了约30%,而慢速时相激活的ERK下降了90%。 (4) CCK-8s促进cckar和β-arrestinl之间的相互作用,在15分钟达到最强,早于慢速时相ERK激活的时相。 (5) β-arrestinl敲低后显著抑制CCK-8s诱导的p90RSK(Thr5

关键词： GPCR cckar arrestin 胰岛素分泌凋亡

胆囊收缩素A型受体基因表达和序列变异与略阳乌鸡生长性能的关系

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胆囊收缩素A型受体基因表达和序列变异与略阳乌鸡生长性能的关系

作者：周雯馨西北农林科技大学

学位级别：硕士

cckar是介导CCK饱腹感信号的受体。研究表明,cckar基因在快速生长型鸡的表达水平显著低于慢速生长型鸡,支持cckar基因是调节鸡生长的一个候选基因。本研究旨在阐明cckar基因表达水平和序列变异与略阳乌鸡生长性能的关系。在略阳乌鸡蛋... 详细信息

cckar是介导CCK饱腹感信号的受体。研究表明,cckar基因在快速生长型鸡的表达水平显著低于慢速生长型鸡,支持cckar基因是调节鸡生长的一个候选基因。本研究旨在阐明cckar基因表达水平和序列变异与略阳乌鸡生长性能的关系。在略阳乌鸡蛋用系育种核心群4个世代中每代随机选取129-675只乌鸡,测定6、12-16、18、22周龄体重和13-16（G3,n=129）、27-30（G4,n=150）周龄采食量,在cckar基因11.2 Mb区域内选取6个SNP,用单变量混合模型分析SNP与体重和日均采食量的关联性。检测cckar在十二指肠、胆囊、胰腺、肝脏、下丘脑等16个组织中的表达量,建立cckar基因在各组织中的表达谱。根据16周龄体重两尾分布选取快长型（n=15）和慢长型（n=15;体重差异29.2%）乌鸡,分析cckar的表达量与生长速度、采食量和料肉比的关系。结果表明,cckar基因第三外显子上的同义突变SNP 4与14、18和22周龄体重显著关联（P＜0.05）。其中,C等位基因在各时间点体重上的加性效应为0.019-0.038 kg,在日均采食量上的加性效应为-1.73 g。cckar基因在各组织中均表达,且在胰腺中的表达水平最高。cckar基因在下丘脑、垂体、胆囊、胰腺和十二指肠中的表达量在快速与慢速生长的乌鸡间无显著差异,但cckar基因在胰腺中的表达水平与日均采食量呈负相关（P＜0.05）,在胰腺和脑垂体中的表达量与料肉比呈负相关（P＜0.05）。以SNP 4为标记,检测等位基因特异性转录本表达丰度发现,C等位基因转录本丰度显著低于T等位基因,该结果进一步肯定cckar基因表达水平与略阳乌鸡生长的联系。本研究证实了cckar基因表达水平和序列变异与略阳乌鸡生长性状的联系,发现SNP 4的C等位基因是一个关联到略阳乌鸡快速生长的优势等位基因,为略阳乌鸡生长性状分子育种方法的建立奠定了理论基础。cckar基因表达水平与采食量、料肉比的负相关性表明,cckar基因的表达可能通过调节食欲和饲料利用率影响略阳乌鸡的生长。

关键词： cckar 略阳乌鸡生长性状体重采食量

一种新短肽COX52-69抑制糖诱导的胰岛素分泌的分子机制研究

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一种新短肽COX52-69抑制糖诱导的胰岛素分泌的分子机制研究

作者：刘惊涛中南民族大学

学位级别：硕士

高胰岛素血症可引起许多并发症,目前人们仍没有找到有效的治疗办法。实验室前期从猪小肠中分离提取了一种多肽,我们将其命名为COX,该肽在胰岛水平和动物水平皆具有抑制糖诱导的胰岛素分泌的作用。前期实验结果表明化学合成的COX也具有... 详细信息

高胰岛素血症可引起许多并发症,目前人们仍没有找到有效的治疗办法。实验室前期从猪小肠中分离提取了一种多肽,我们将其命名为COX,该肽在胰岛水平和动物水平皆具有抑制糖诱导的胰岛素分泌的作用。前期实验结果表明化学合成的COX也具有相同的作用,且其显著增加了β细胞的BK通道电流,即COX是通过激活BK通道来抑制糖诱导的胰岛素分泌的。实验室利用SPR等技术,捕获了90多个与COX直接结合或间接结合的蛋白,根据生物信息学等相关技术在90多个蛋白中筛选出cckar及PRKACA这两种蛋白在COX抑制糖诱导的胰岛素分泌中起重要作用。本论文主要针对cckar及PRKACA在COX抑制糖诱导的胰岛素分泌中的分子机制展开研究。将急性分离的大鼠胰岛均分为两组:实验组与对照组。实验组:先用100 n M COX 37℃孵育30 min再加16.7 m M葡萄糖37℃孵育30 min;对照组:先用KRBB缓冲液37℃孵育30 min再加16.7 m M葡萄糖37℃孵育30 min。提取两组组织的RNA,经逆转录后进行RT-PCR,结果表明实验组cckar及PRKACA的相对表达量明显上调,利用CRISPR/Cas9系统分别构建cckar及PRKACA的敲除载体,制备慢病毒,将浓缩好的慢病毒注射入大鼠胰腺组织,让其在大鼠体内表达10-14天。时间到后利用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定大鼠个体及胰岛胰岛素含量,用全细胞膜片钳记录β细胞的BK通道电流,最后利用实时荧光定量PCR测定两组中cckar及PRKACA两基因的相对表达量。本文证明了cckar及PRKACA在COX抑制糖诱导的胰岛素分泌的过程中起重要作用,通过干预cckar及PRKACA的表达,可以在一定水平上恢复糖诱导的胰岛素分泌。本课题针对COX抑制糖诱导的胰岛素分泌的分子机制进行研究,这有助于为COX的成药研究奠定药理学基础,有助于为以后研究抑制胰岛素分泌的机制和信号通路提供新的指导意见。

关键词： cckar PRKACA 胰岛素分泌 COX52-69 BK通道分子机制

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糖尿病合并梅毒兔肾组织钙化机的初步探讨

糖尿病合并梅毒兔肾组织钙化机的初步探讨

作者：易婷南华大学

学位级别：硕士

目的:通过构建糖尿病兔、梅毒兔、糖尿病合并梅毒兔模型后,对比各实验组兔肾组织钙化情况并通过基因芯片筛选肾组织中与之相关的差异表达基因,再检测肾组织中钙化相关差异基因的蛋白表达情况,初步探讨糖尿病合并梅毒兔肾组织钙化机制。... 详细信息

目的:通过构建糖尿病兔、梅毒兔、糖尿病合并梅毒兔模型后,对比各实验组兔肾组织钙化情况并通过基因芯片筛选肾组织中与之相关的差异表达基因,再检测肾组织中钙化相关差异基因的蛋白表达情况,初步探讨糖尿病合并梅毒兔肾组织钙化机制。方法:1.实验动物分组及建模:将新西兰雄兔随机分成四组并构建正常组(C组)、糖尿病组(DM组)、梅毒组(TP组)和糖尿病合并梅毒组(H组)模型。2.HE染色:取各组兔肾组织石蜡切片脱蜡水化后用苏木精浸染,盐酸酒精分化,弱氨水返蓝和乙醇及二甲苯脱水最后中性树胶封片,观察各组实验兔肾组织的钙化情况。3.基因芯片检测:取各实验组兔肾组织进行基因芯片检测,筛选出差异表达的钙化相关基因。4.钙化相关差异基因的PCR检测:m RNA实时定量PCR检测各组实验兔肾组织中钙化相关基因表达的相对含量。5.钙化相关差异基因蛋白表达的免疫印迹(Western blot,WB)检测:提取肾脏组织蛋白测定浓度,配平后上样跑胶,0.05A恒流转膜45分钟,再用牛奶封闭1小时,孵一抗4度过夜,将膜放入TBST溶液洗膜后放入温箱孵二抗1小时,洗膜后显影,检测各组兔肾组织钙化相关差异基因蛋白的表达情况。6.免疫组化检测:取肾组织石蜡切片脱蜡水化,用3%过氧化氢(H2O2)去离子水孵育后用水冲洗PBS浸泡,通过5-10%正常山羊血清(PBS稀释)封闭后再滴加一抗放入4度过夜之后用PBS冲洗,滴加二抗孵育后PBS冲洗,再滴加聚合物增强剂孵育后继续用PBS冲洗,显色后水洗然后复染、脱水、透明,最后封片。结果:1、糖尿病组(DM组)兔、梅毒组(TP组)兔和糖尿病合并梅毒组(H组)兔建模成功。2、HE染色结果显示:正常组兔肾组织没有明显的异常改变,TP组、DM组和H组实验兔肾组织均可见肾小球毛细血管扩张和近曲小管肿胀。并且DM组实验兔肾组织中集合管内和肾髓质区还可见蛋白管型、间质粘液样变、水泡样变。H组实验兔中肾近曲小管肿胀和肾小球毛细血管扩张更为严重,肾组织内钙盐沉积明显。3、基因芯片结果显示:肾上腺素受体α1A(ADRA1A)、R型电压依赖性钙通道Ca V2.3(CACNA1E)、胆囊收缩素A受体(cckar)基因在各实验组兔肾组织中的差异显著,与正常组相比,ADRA1A、CACNA1E、cckar基因含量在TP、DM、H组肾脏中上调,在TP组少量上调,DM组上调明显,H组上调最高。4、ADRA1A、CACNA1E、cckar基因m RNA实时定量PCR结果显示:与C组相比,ADRA1A、CACNA1E基因在TP、DM、H组肾脏中的表达量均上调,DM、H组的表达量比TP组高,H组中的表达量最高(其PCR表达量趋势与基因芯片结果相符)。与C组相比,cckar基因在TP、DM、H组肾脏中的表达含量均上调,DM、H组中的表达量比TP组高,但H组与DM组相比表达无差异。Toll样受体4(TLR-4)和丝裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)基因m RNA实时定量PCR结果显示:与C组比较,其m RNA水平在TP、DM、H组肾脏中均有上调,而H组上调最为明显,与ADRA1A、CACNA1E的表达趋势一致。5、WB检测:ADRA1A、CACNA1E、cckar和TLR-4、MAPK1基因的蛋白表达水平与m RNA实时定量PCR结果相符,以H组的表达水平最高。6、免疫组化结果显示:与C组正常兔相比,ADRA1A、CACNA1E、cckar、TLR-4和MAPK1基因在TP组、DM组、H组中的阳性细胞增多;H组中阳性细胞最多,其次为DM组;TP组则只有少量的表达,C组阳性细胞表达量最少。结论:1.与糖尿病组和梅毒组相比,糖尿病合并梅毒组的炎症反应和肾脏钙化更严重。2.与糖尿病组和梅毒组相比,糖尿病合并梅毒组的肾脏钙化加重可能与ADRA1A和CACNA1E受体表达上调介导钙内流增加有关;可能与cckar基因的表达上调无关。3.与糖尿病组和梅毒组相比,糖尿病合并梅毒组的肾脏钙化加重可能与TLR-4受体和MAPK1基因表达上调介导的炎症反应增加有关。

关键词：糖尿病合并梅毒钙化 ADRA1A CACNA1E cckar TLR-4 MAPK1