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西南农业大学学报（自然科学版） 2004年第5期26卷 603-605页

作者：邓小燕张兴国井鑫邵长文苏承刚西南农业大学园艺园林学院重庆市蔬菜学重点实验室重庆400716

从拟南芥Columbia生态型基因组DNA中扩增并克隆了冷诱导转录因子cbf3基因,将其与CaMV35S启动子和Nos终止子融合后构建成植物表达载体pBINP-35S-cbf3。通过农杆菌介导转化黄瓜子叶,获得了具有卡那霉素抗性的黄瓜再生植株。经PCR检测鉴定... 详细信息

从拟南芥Columbia生态型基因组DNA中扩增并克隆了冷诱导转录因子cbf3基因,将其与CaMV35S启动子和Nos终止子融合后构建成植物表达载体pBINP-35S-cbf3。通过农杆菌介导转化黄瓜子叶,获得了具有卡那霉素抗性的黄瓜再生植株。经PCR检测鉴定,表明cbf3基因已整合到黄瓜基因组中。

关键词： cbf3转录因子基因遗传转化黄瓜

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抗寒相关基因导入黄瓜的研究

抗寒相关基因导入黄瓜的研究

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作者：邵长文西南农业大学

学位级别：硕士

黄瓜(Cucumis sativus L．)原产于热带和亚热带区域，是一种重要喜温类蔬菜，生长适宜温度为25-32℃，低温界限为10-12℃，10℃以下生长停止，5℃有受害的危险，经过低温锻炼的幼苗能忍受短时间1-2℃的低温。由于种属内没有抗寒的资源... 详细信息

黄瓜(Cucumis sativus L．)原产于热带和亚热带区域，是一种重要喜温类蔬菜，生长适宜温度为25-32℃，低温界限为10-12℃，10℃以下生长停止，5℃有受害的危险，经过低温锻炼的幼苗能忍受短时间1-2℃的低温。由于种属内没有抗寒的资源材料，显著提高黄瓜的抗寒性就不能通过有性杂交转育，只能利用基因工程手段导入其他物种的抗寒相关基因，从而来打破植物遗传群体中抗寒种质资源缺乏的限制，为黄瓜抗寒育种提供新的种质资源。冷诱导启动子RD29A受干旱和低温诱导而产生表达活性;cor15a基因在拟南芥菜抗寒中起重要的作用，cbf3冷调控转录因子基因能促进大量冷诱导基因在在常温下的表达。本试验将冷诱导启动子RD29A分别控制下的拟南芥菜cbf3冷调控转录因子基因和cor15a抗寒基因构建植物表达载体，分别构建成携有RD29A-cor15a-Tnos表达盒的植物表达载体pVCT2016和携有RD29A-cor15a-Tnos和RD29A-cbf3-Tnos串联双表达盒的植物表达载体pRD29A-cbf3。通过农杆菌介导，导入黄瓜基因组，创制出耐寒黄瓜新材料。 1 植物表达载体的构建 1．1 表达载体pVCT2016的构建克隆载体pSAU1001经限制性内切酶XbaⅠ酶切后经DNA聚合酶Ⅰ Klenow片段补平粘末端，再用SacⅠ酶酶切，电泳，从1％的琼脂糖凝胶中回收纯化426bp小片段;表达载体pRD29A-GUS-T经SmaⅠ和SacⅠ双酶切后回收13550bp大片段;用T连接酶连接两个片断，转化大肠杆菌，在kan抗性的LB平板上筛选出阳性克隆，进行colony PCR鉴定和酶切鉴定。提取质粒pVCT2016，用冻融法导入农杆菌菌株LBA4404(pAL4404)中。 1．2 表达载体pRD29A-cbf3的构建：西南农业大学硕士学位论文为了构建表达载体pRD29A一BF3，我们又构建了两个中间载体***29A一cbf3和 pGEM一肋29A一cbf3.克隆载体pVCTZolZ经月认班11趁必oRI双酶切后切成2635bp和1949bp 两片断，回收小片段汪几”dlll尼co孙双酶切pBS n Ks+，乙醇沉淀去除12bP小片断，回收2949bP 大片段，T4连接酶连接，构建成pBs-RD29A一cbf3;pBs一劝29A一cbf3经刀“成月叮clal双酶切后，回收1974bp小片段，pGEM·7zf经刀“优月叮c如I双酶切后，回收2988bP大片段，T4连接酶连接，转化大肠杆菌，构建成***29A￡***29A-cbf3用五七。RI酶切成2983bP和1978bP两片断，电泳回收1978bP小片断，P vCT2016经五七口Iu酶切后成线状DNA 片段，T4连接酶连接，转化大肠杆菌和农杆菌，构建成植物表达载体pRD29A一BF3. 2植物表达载体对黄瓜子叶的遗传转化研究 2.1黄瓜子叶的遗传转化再生体系的优化在前人工作的基础之上‘I，’·“‘，’·‘·’·”，对黄瓜子叶的遗传转化的培养基进行了优化，获得了优化的培养基配方，提高了外植体的芽分化率，克服了培养过程中出现的玻璃化，褐化现象。以2天龄的黄瓜子叶为外植体，以MS(1960年)为基本培养基，通过加入不同浓度和不同组合的BA、ABA和ZT，筛选到了试管苗分化最适培养基(璐附加BA Zmg/L+ZT lmg/L+超A ***/L+3%蔗糖+0.7%琼脂的固体培养基)、不定芽生长培养基(MS附加3%蔗糖和0.7% 琼脂的固体培养基)和根分化生长最适培养基(l/ZMS附加3%蔗糖+0.，%琼脂的固体培养基). 在最适培养基上研究了黄瓜子叶外植体对卡那霉素的敏感性、预培养天数、共培养时间及感菌时间等因素的影响，建立了黄瓜高频转基因再生体系，即取1天龄的黄瓜无菌子叶在不定芽分化最适培养基OCM(MS加BAZmg/L+ZTlmg/L+ABAO，sm以L+3%蔗糖+0.7%琼脂的固体培养基)上预培养1天，投入到活化的农杆菌LBA4404(pRD29A一cbf3+P AL44O4)菌液中浸染15 分钟，在ocM上暗培养2天，在附加Carb 300mg/L的ocM培养基上延迟筛选培养一周后，转入筛选培养基(戊M+Kan80m岁L+c arb ZOOmg/L)中筛选抗性愈伤和抗性芽，每两周更换一次培养基，抗性芽转入不定芽生长培养基中培养1周，然后转入生根培养基中诱导生根，共获得具有Kan抗性的黄瓜再生芽14个，共获得9株抗性再生植株。 2.2转基因黄瓜的分子鉴定 .取Kan抗性的黄瓜植株叶片，用CTAB法提取的基因组DNA作为PcR扩增的模板，以Tnos 终止

关键词：黄瓜 cor15a基因 cbf3转录因子基因遗传转化

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抗寒基因表达载体构建及遗传转化研究

抗寒基因表达载体构建及遗传转化研究

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作者：邓小燕西南农业大学

学位级别：硕士

抗寒是许多蔬菜和大田作物需要的一个重要农艺性状。利用导入冷应答转录因子基因(cbf)来从转录水平上促进植物自身的大量冷诱导基因表达，并结合导入1～2个高效抗寒基因的策略，是当前植物抗寒遗传改良的基本方向，可能成为有效改善植... 详细信息

抗寒是许多蔬菜和大田作物需要的一个重要农艺性状。利用导入冷应答转录因子基因(cbf)来从转录水平上促进植物自身的大量冷诱导基因表达，并结合导入1～2个高效抗寒基因的策略，是当前植物抗寒遗传改良的基本方向，可能成为有效改善植物抗寒性的重要途径。本实验从探讨冷旱应答启动子P-RD29A冷诱导活性及冷诱导转录因子cbf3在常温下和低温下超表达时对转基因植株表型及抗寒性的影响等三个方面考虑，构建了相关抗寒基因的三个植物表达载体。通过将携有RD29A-GUS-Tnos基因表达盒的载体pBIN-RD29A-GUS转化黄瓜和小番茄外植体材料，检测GUS基因的瞬间表达活性，初步探讨了冷诱导启动子P-RD29A在这两种作物中是否具有冷诱导活性的问题。将植物表达载体pBIN-35S-cbf3对黄瓜和小番茄进行遗传转化，建立了黄瓜高频再生和遗传转化体系，获得了一株转基因黄瓜植株，并通过了植物基因组PCR检测;获得了两个具有Kan抗性的小番茄再生绿芽。主要研究结果如下： 1 冷诱导基因RD29A启动子片段P-RD29A的克隆、序列测定及分析根据拟南芥菜RD29A基因启动子两端序列设计两个特异引物P(5’-ctgcaagaatctcaaacacg-3’)和P(5’-tccaatagaagtaatcaaacc-3’)，采用高保真的pfu-DNA聚合酶，从拟南芥(Arabidopsis thaliana)Columbia生态型基因组DNA中，通过PCR扩增出目的片段。纯化的目标产物经Taq DNA聚合酶加A碱基后，采用TA Clonging方法克隆到pUCm-T载体中，得到重组质粒pP-RD29A，转化大肠杆菌XL-Blue，挑选白色的重组子菌落进行Colony PCR筛选和质粒的酶切验证。挑选有插入P-RD29A启动子片段的重组子单菌落，委托上海博亚生物工程有限公司测序。结果表明，该目的片段为890bp，与发表的拟南芥菜P-RD29A(D13044)相应序列一致。 2 转录因子cbf3基因的克隆、序列测定和分析根据已发表的拟南芥转录因子cbf3基因序列设计两个特异性引物P(5’-agcaaaccataccaacaaaaa-3’)和P(5’-gtactaaaaatggaaataataatctgag-3’)，采用与P-RD29A相同的方法进行克隆、序列测定和分析。获得的重组质粒命名为pcbf3，委托上海生工生物工程有限公司测序。结果表明，所克隆的目的片段为760bp，编码216个氨基酸，与发表的拟南芥菜cbf3基因(AF076155)相应序列及编码的氨基酸一致。 3 植物表达载体的构建质粒pP-RD29A经PstI+BamHI双酶切后回收P-RD29A启动子，替换质粒pSAU2006中的CaMV 35S启动子，建成携带RD29A-GUS-Tnos基因表达盒的中间载体pRD29A-GUS。pRD29A-GUS经SmaI+Ecl136双酶切后，回收大片段，平端线型DNA自环化，构建成携带 RD29A一Tnos基因片段的中间载体 pVCT20ll。质粒 pcbf3经 Bgllll 单酶切后获得的目的基因片段 CBs正确的插入到 PVCT2011经 Bwhl单酶切后的线型载体中，构建成携带有 RD29A－cbf3－Tnos基因表达盒的中间载体pVCT2012。质粒pSAU2006经Bwhl＋Hjndlll双酶切后回收 C洲 355 启动子，pVCT2012经 BglIll＋HjI7dlll双酶切后回收大片段，两片段经连接构建成携有355－cbf3－Tnos基因表达盒的中间载体pVCT2014。质粒 nBINPLUS经 Ecdil＋Hindlll双酶切后回收大片段。质粒nRD29A－GUS、nVCT2012 和 pVCT2014分别经 Ecdil＋Hjndlll双酶切后回收目的基因表达盒片段 RD29A－GUS－Tnos、 RD29A－cbf3－Tnos和355－cbf3－Tnos，然后分别连接至线型pBINPLUS载体上，构建成植物表达载体出I卜RD29A－GUS、pBIN二RD29A－cbf3和咄I卜355－cbf3。 4 冷诱导启动子PRD29A在黄瓜和小番茄中的冷诱导表达特性” 以1天龄的黄瓜子叶和小番茄试管苗真叶为无菌外植体材料，分别经活化的农杆菌 LBA4404(PBIN乙RD29AAIUS＋PAL4404)菌液浸染后，暗培养32个小时，分另经5’C＊温诱导和 25oC常温处理后组织化学染色。结果表明，冷诱导启动子P－RD29A在黄瓜和小番茄中均具有冷诱导活性，受SC的低温诱导表达，而在25oC常温下不表达。 5 植物表达载体 PB N＋35S七BF

关键词： P-RD29A启动子 cbf3转录因子基因抗寒遗传转化黄瓜小番茄

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cbf3和COR15a基因对烟草抗寒性的影响

CBF3和COR15a基因对烟草抗寒性的影响

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作者：吴纯清西南大学

学位级别：硕士

烟草(Nicotiana tabacum L．)，茄科(Solanaceae)、烟属(Nicotiana)，主要起源于美洲、大洋洲及南太平洋的一些岛屿，大约在明朝万历年间(1573～1619年)传入我国。目前发现的烟属植物有66种。烟草是喜温作物，1～2℃低温时植株即死亡，1... 详细信息

烟草(Nicotiana tabacum L．)，茄科(Solanaceae)、烟属(Nicotiana)，主要起源于美洲、大洋洲及南太平洋的一些岛屿，大约在明朝万历年间(1573～1619年)传入我国。目前发现的烟属植物有66种。烟草是喜温作物，1～2℃低温时植株即死亡，10～13℃生长停止。在成熟期昼夜平均在16～17℃以下，叶片品质低劣。因此，低温寒害是影响烟草生产的重要限制因子，严重的影响其产量和品质。本实验将低温诱导启动子RD29a控制的GUS基因转入烟草，以探明拟南芥RD29a启动子在烟草植株中的表达特性;同时，将该启动子分别控制的拟南芥cbf低温应答转录激活因子基因和COR15a冷诱导基因一起转入烟草，以期利用cbf的快速和高效激活所有携带CRT／DRE元件的冷诱导基因表达，以及COR15a抗寒基因对光合膜等内膜系统的强力保护，达到提高烟草植株的整体抗寒性和低温下的光合作用能力的目的。我们期望这种抗寒改良策略在模式植物烟草上的成功，以便为其他经济作物的抗寒性改良提供理论和实践依据。主要研究结果如下： 1．分别将RD29a-GUS基因和RD29a-cbf与RD29a-COR15a双价基因导入烟草材料K326中，PCR扩增检测结果表明有阳性扩增条带，初步证明外源基因已经整合到烟草基因组中。 2．转RD29a-GUS基因植株作GUS组织化学染色实验，结果表明，RD29a启动子在烟草中同在拟南芥中一样，不具有组织表达特异性，而是低温诱导型启动子。它在25℃常温下不表达，10℃左右为诱导临界温度，4℃左右稳定和高效表达。 3．转RD29a-cbf和RD29a-COR15a双价基因植株的低温抗寒性实验结果显示，转基因植株在1℃ 48h未出现萎蔫，冰点温度-2℃，而非转基因植株1℃ 12h即出现萎蔫状态，冰点温度-1℃。电导率测定和用Logistic方程拟合，得到转基因植株LT为-1.01℃左右，非转基因植株LT为0.86℃。转基因植株的细胞膜伤害率比非转基因植株低20％，半致死温度低约1.87℃。转基因植株的POD活性、可溶性糖含量和脯氨酸含量分别是非转基因植株的3.42倍、2.57倍、1.23倍。 4．正常温度下，转RD29a-cbf和RD29a-COR15a双价基因植株生长状况与非转基因植株相似。但田间越冬栽植结果显示，转基因植株在抗寒性增强的同时，在植株形态上也发生了变化，主要特征有叶由长椭圆形变成柳叶状、茎秆变细，易折断、植株由高大直立变矮化、

关键词：烟草 RD29a启动子 COR15a基因 cbf3转录因子基因抗寒

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cbf3和Cor15A基因导入黄瓜

CBF3和Cor15A基因导入黄瓜

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中国园艺学会第六届青年学术讨论会

作者：张兴国邓小燕邵长文孙涌栋梅茜苏承刚西南农业大学园艺园林学院

本文从拟南芥中克隆了冷(旱)诱导基因RD29A启动子、冷(旱)应答转录活化因子基因cbf3和抗寒基因Cor15A。基因瞬间表达研究结果显示,克隆的RD29A启动子片段在黄瓜中具有低温诱导活性。通过农杆菌介导,将35S:cbf3基因和RD29A:cbf3与RD29A:C... 详细信息

本文从拟南芥中克隆了冷(旱)诱导基因RD29A启动子、冷(旱)应答转录活化因子基因cbf3和抗寒基因Cor15A。基因瞬间表达研究结果显示,克隆的RD29A启动子片段在黄瓜中具有低温诱导活性。通过农杆菌介导,将35S:cbf3基因和RD29A:cbf3与RD29A:Cor15A双基因导入到黄瓜基因组。

关键词：黄瓜 cbf3转录因子基因 Cor15A抗寒基因转基因

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基因Cor15A和cbf3导入黄瓜基因组

基因Cor15A和CBF3导入黄瓜基因组

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蔬菜分子育种研讨会

作者：张兴国邵长文孙涌栋苏承刚西南农业大学园艺园林学院重庆市蔬菜学重点实验室

本文从拟南芥中克隆了冷(早)诱导基因RD29A启动子、冷(早)应答转录活化因子基因cbf3和抗寒基因Cor15A。基因瞬间表达研究结果显示,克隆的RD29A启动子片段在黄瓜中具有低温诱导活性。通过农杆菌介导,将35S:cbf3基因和RD29A:cbf3与RD29A:C... 详细信息

本文从拟南芥中克隆了冷(早)诱导基因RD29A启动子、冷(早)应答转录活化因子基因cbf3和抗寒基因Cor15A。基因瞬间表达研究结果显示,克隆的RD29A启动子片段在黄瓜中具有低温诱导活性。通过农杆菌介导,将35S:cbf3基因和RD29A:cbf3与RD29A:Cor15A双基因导入到黄瓜基因组.

关键词：黄瓜 cbf3转录因子基因 Cor15A抗寒基因转基因

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