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基于蛋白核酸嵌合物构建靶向肿瘤细胞外基质的通用探针

基于蛋白核酸嵌合物构建靶向肿瘤细胞外基质的通用探针

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作者：李慧圆湖南大学

学位级别：硕士

细胞外基质(Extra cellular matrix,ECM)是由多种纤维蛋白(胶原蛋白、弹性蛋白等)和多糖(糖胺聚糖)等组成的精密有序网络结构,它不仅对细胞起到骨架支撑作用,还是细胞粘附、迁移和通讯的主要结合位点。在肿瘤形成过程中,肿瘤细胞外基质... 详细信息

细胞外基质(Extra cellular matrix,ECM)是由多种纤维蛋白(胶原蛋白、弹性蛋白等)和多糖(糖胺聚糖)等组成的精密有序网络结构,它不仅对细胞起到骨架支撑作用,还是细胞粘附、迁移和通讯的主要结合位点。在肿瘤形成过程中,肿瘤细胞外基质的结构动态变化极大地加强了肿瘤内部细胞和细胞外基质以及细胞之间的相互作用,从而促进肿瘤发展,并在肿瘤转移和耐药过程中发挥了重要作用。肿瘤细胞外基质已成为肿瘤治疗的重要靶点。当前已针对胶原蛋白、弹性蛋白等主要肿瘤细胞外基质成分发展了相应特异性染色技术,以及可以通过二次谐波成像对胶原蛋白进行成像分析。这些技术中,细胞外基质经过类似组织一样的处理,能够实现高分辨成像,但仅能展示细胞外基质的结构和自身组成信息,无法获取细胞外基质所处微环境中的关键化学信息。因此开发一种可视化解析肿瘤细胞外基质中化学信息的工具对肿瘤病理过程的研究和治疗具有重要意义。蛋白核酸嵌合物这种组合方式可实现蛋白质的丰富功能特性与核酸的高度可编程性质相结合,在学术界得到了广泛关注。利用蛋白核酸嵌合物的特性,可大大扩展生物传感器的检测目标物以及功能应用,对于生物传感以及模块化组装等领域具有重要意义。胶原蛋白作为细胞外基质的主要骨架成分,在正常组织中极少暴露、并不与血液接触。由于肿瘤组织血管的高渗透性,血液中的分子有机会与被暴露的肿瘤基质胶原蛋白接触并相互作用,这为靶向肿瘤细胞外基质的设计提供了靶点。基于此,我们利用分子生物学技术将胶原结合蛋白(Collagen binding domain a3,cbd a3)与鸭圆环病毒蛋白(duck circovirus,DCV)进行重组,并在此基础上融合了荧光蛋白模块。其中cbd a3具有靶向胶原蛋白的特性,荧光蛋白模块具有荧光指示作用,而DCV可与DNA进行特异性共价连接。以DCV为连接模块,可以将不同设计的DNA与cbd a3蛋白结合,从而构建具有靶向肿瘤细胞外基质的模块化探针,对肿瘤细胞外基质中的生物化学信号实现可视化解析,并为肿瘤病理过程的研究和治疗提供方法。具体研究如下:(1)cbd-EGFP-DCV的构建、表达以及性质探究。我们首先通过蛋白重组技术将cbd a3和增强型绿色荧光蛋白(Enhanced green fluorescent protein,EGFP)基因进行重组,构建了重组质粒p ET28a-cbd-egfp,经体外表达和纯化获得了重组蛋白cbd-EGFP。通过光谱分析以及荧光成像的方法验证了cbd-EGFP的荧光光谱性质以及胶原蛋白结合性质,说明了cbd-EGFP不仅可以发射绿色荧光,还具备与胶原蛋白特异性结合的能力。基于此,我们进一步通过构建、表达和纯化获得了重组蛋白cbd-EGFP-DCV,并证明该蛋白在保留了cbd-EGFP功能的基础上,获得了与DNA高效共价连接的性能。综上,cbd-EGFP-DCV同时具有胶原蛋白结合能力、识别并连接特定DNA的能力以及荧光示踪的能力,为后续应用奠定基础。(2)cbd-m Cherry-DCV和cbd-m IFP-DCV的构建、表达和性质探究。近红外成像窗口具备组织吸收荧光弱和背景散射低等特点,对活体传感和成像具有重要意义。基于此,我们利用所构建重组蛋白cbd-EGFP-DCV的模块化特点置换和优化了其中的荧光模块,成功构建和表达纯化了具有荧光成像波长红移的重组蛋白工具cbd-m Cherry-DCV和cbd-m IFP-DCV。通过荧光成像分析、凝胶电泳实验以及肿瘤球培养,我们证明了置换其中的荧光模块并不会影响重组蛋白与胶原蛋白和DNA的特异性结合能力,而且可以在3D肿瘤球实验中得到良好的成像效果,说明我们所构建的重组蛋白工具具有很好的模块化特征以及活体传感优势。(3)基于蛋白核酸嵌合物构建靶向肿瘤细胞外基质的模块化通用探针。为实现对肿瘤细胞外基质中化学信号的检测分析,我们选择血小板衍生生长因子(Platelet derived growth factor,PDGF)作为模型蛋白,将PDGF的适配体序列(aptamer)与带有DCV的识别序列的互补链进行杂交配对,利用DCV对其识别序列的切割连接获得蛋白核酸嵌合探针cbd-m IFP-DCV-DNA。带有荧光基团并适当延伸的PDGF aptamer和互补链进行配对杂交获得双链结构,因带有荧光基团修饰的aptamer与互补链上的猝灭基团距离较远,故不会产生荧光猝灭现象。当PDGF存在时,会因aptamer的构象变化导致荧光基团和互补链上的猝灭基团靠近,导致荧光信号的降低,从而实现对PDGF的检测。在优化实验条件下,该探针可以实现PDGF的特异性检测,线性范围为5-40 n M。此外,通过界面成像检测分析证明cbd-m IFP-DCV-DNA不仅具备胶原蛋白的靶向特性,还可以实现对PDGF的灵敏检测。我们的工作证明了所构建的重组蛋白工具具有靶向肿瘤细胞外基质实现选

关键词：肿瘤细胞外基质胶原蛋白蛋白核酸嵌合物核酸适配体 cbd a3 DCV PDGF检测

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