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噬菌体蛋白应用于李斯特菌快速检测技术研究

噬菌体蛋白应用于李斯特菌快速检测技术研究

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作者：葛怀娜天津农学院

学位级别：硕士

李斯特菌是一种分布广泛,易于食物中滋生,致死率较高的食源性致病菌。噬菌体裂解酶是由噬菌体基因编码的可高效裂解细菌细胞壁的一类水解酶的总称,能够在增殖过程的后期裂解宿主菌的细胞壁,从而释放子代噬菌体。噬菌体裂解酶一般有2个... 详细信息

李斯特菌是一种分布广泛,易于食物中滋生,致死率较高的食源性致病菌。噬菌体裂解酶是由噬菌体基因编码的可高效裂解细菌细胞壁的一类水解酶的总称,能够在增殖过程的后期裂解宿主菌的细胞壁,从而释放子代噬菌体。噬菌体裂解酶一般有2个结构域组成,分别为氨基端的催化结构域（EAD）和位于羧基端的细胞壁结合结构域（cbd）。cbd区域对识别特异性起决定作用。李斯特菌噬菌体裂解酶的cbd对李斯特菌菌株乃至不同血清型菌株都有非常好的特异性识别作用。由此本文构建含cbd基因的表达载体提取目的蛋白,应用于胶体金免疫试纸条,以完成对李斯特菌的快速检测。首先将cbd基因导入pET高效表达载体中,完成重组载体构建;其次对导入重组载体的工程菌进行诱导表达,提取目的重组蛋白,通过亲和层析技术完成对蛋白的纯化,检测蛋白生物学活性;接下进行胶体金的制备与探针标记,通过对胶体金制备方法和探针标记条件进行优化;最后完成胶体金试纸条的组装,并对组装后的胶体金试纸条的稳定性、重复性以及特异性进行评价。主要研究结果如下:（1）成功得到了含有目的基因重组质粒的工程菌。利用温度梯度PCR技术扩增噬菌体裂解酶cbd基因,采用双酶切和连接,成功得到重组质粒,同时加入His标签,将其表达于大肠杆菌工程菌。通过生物公司测序,确定目的基因的同源性达到100%。（2）成功获得了与单增李斯特菌特异性结合的具有生物学活性的cbd重组蛋白。通过IPTG对重组菌进行诱导、超声波细胞破碎菌体细胞获取目的重组蛋白,进一步使用镍离子亲和层析柱对含有His标签的重组蛋白进行纯化,蛋白浓度可到达重组蛋白cbdP40浓度0.908 mg/mL、cbd500浓度0.624 mg/mL。ELISA、Western blotting检测结果均呈阳性。（3）成功完成李斯特菌菌体蛋白抗体的胶体金探针标记。通过加热搅拌方式优化选择磁力加热搅拌,采用柠檬酸三钠作为还原剂制备胶体金,制备出吸收波长为520 nm,粒径为16 nm左右,品质较好的胶体金探针。经过优化,选定pH为8.2,蛋白量为12μg/mL为最佳标记条件,标记的探针对李斯特菌特异性识别,具有生物学活性。（4）通过筛选,对试纸条的各部分种类进行优化组合试验,成功组装完成李斯特菌胶体金试纸条。对C、T线划线浓度进行优化,C线浓度0.8 mg/mL、T线浓度1 mg/mL,选择最佳样品稀释液,获得显色稳定、重复性好的胶体金试纸条。同时cbd重组蛋白用于T线上金试纸条上,实现了噬菌体蛋白应用于李斯特菌快速检测。

关键词：李斯特菌噬菌体裂解酶 cbd蛋白胶体金

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