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cards tx与HMGB1-TLRs-MyD88信号通路关系在MPP中的研究

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CARDS TX与HMGB1-TLRs-MyD88信号通路关系在MPP中的研究

作者：范玉洁苏州大学

学位级别：硕士

目的:研究肺炎支原体肺炎(Mycoplasma pneumoniae pneumonia,MPP)患儿肺泡灌洗液(Broncho alveolar lavage fluid,BALF)中 cards tx 的临床意义,以及cards tx与HMGB1-TLRs-MyD88的相关性,探索MP感染的免疫发病机制。方法:1.选取2018年1月至2019年06月期间在苏州大学附属儿童医院住院治疗,确诊为MPP并行支气管镜检查的患儿66例为MPP组,按BALF中MP的载量不同分为高MP组33例和低MP组33例;同期因支气管异物行支气管镜的儿童20例作为对照组。用RT-qPCR法检测cards tx、HMGB1的表达量,分析比较组间患儿的临床特征、实验室检查及cards tx、HMGB1的相关性。2.选取4～7岁MPP患儿20例、支气管异物儿童10例,用ELISA法检测TNF-α、IL-1β,RT-qPCR法检测RAGE、TLR2、TLR4、MyD88、TLR6、CD14等表达量,分析 cards tx 与 HMGB1 及其受体、TNF-α、IL-1β、MyD88、CD14 等的相关性。3.采用RT-qPCR法检测不同浓度cards tx刺激下不同时间THP-1细胞中HMGB1、TLR2、TLR4的表达量,并分析其相关性。结果:1.高MP组患儿热程、热峰比低MP组更长、更高,且高MP组发生胸腔积液、肺实变、肺不张的比例更高。低MP组WBC计数的平均值高于高MP组及对照组;高MP组和低MP组NE、CRP高于对照组,且高MP组CRP更高;高MP组LYM、EOS 低于低 MP 组、对照组。高 MP 组 CD19+CD23+、CD3+、CD3+CD4+、CD3-CD(16+56)+、CD3-CD19+均低于低 MP 组。MPP 组 cards tx 的表达量高于对照组,且高MP组更高。*** 组 HMGB1、TLR2、MyD88、CD14 的表达量高于对照组,且 cards tx与 HMGB1、TLR2、MyD88、CD14 呈正相关,HMGB1 亦与 TLR2、MyD88、CD14呈正相关。3.相同cards tx浓度刺激下,HMGB1、TLR2、TLR4在72小时的表达量均达高峰,后逐渐下降。同一时间下,HMGB1、TLR2、TLR4表达量与cardstx的刺激浓度呈正相关。结论:***的病情轻重与MP载量、cards tx表达量有关,高载量患儿炎症反应更重,细胞免疫功能紊乱更明显。*** tx可能通过HMGB1-TLRs/CD14-MyD88途径参与MPP的免疫发病机制。

关键词：肺炎支原体肺炎 cards tx HMGB1 TLR2 TLR4

cards tx与肺炎支原体肺炎相关性研究

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CARDS TX与肺炎支原体肺炎相关性研究

作者：陶会苏州大学

学位级别：硕士

目的:探讨肺炎支原体肺炎（MPP）患儿肺泡灌洗液（BALF）中社区获得性呼吸窘迫综合征毒素（cards tx）表达的临床意义。方法:1、选取2015年1月至2016年6月苏州大学附属儿童医院呼吸科确诊为肺炎支原体肺炎（MPP）且接受支气管镜检查及... 详细信息

目的:探讨肺炎支原体肺炎（MPP）患儿肺泡灌洗液（BALF）中社区获得性呼吸窘迫综合征毒素（cards tx）表达的临床意义。方法:1、选取2015年1月至2016年6月苏州大学附属儿童医院呼吸科确诊为肺炎支原体肺炎（MPP）且接受支气管镜检查及支气管肺泡灌洗的80例患儿为研究对象,选取同期在本院五官科住院的22例支气管异物患儿作为对照组;分析比较MPP组与对照组BALF中cards tx的相对表达量及TNF-α、s B7-H3、IFN-γ、IL-4、IL-6的表达水平。2、根据MPP组BALF中cards tx的相对表达量分为高cards tx组、低cards tx组,分析比较两组临床特征、实验室检查、BALF中MP-DNA的拷贝数、细胞分类的差异。3、分析比较高cards tx组、低cards tx组与对照组BALF中TNF-α、sB7-H3、IFN-γ、IL-4、IL-6的表达水平。4、分析cards tx与BALF中TNF-α、sB7-H3、IFN-γ、IL-4、IL-6表达水平的相关性。结果:1、MPP组患儿BALF中cards tx表达量明显高于对照组（P＜0.05）。2、高cards tx组比低cards tx组患儿热峰更高、热程更长、住院时间更长、更易形成粘液栓,肺内外并发症的发生率更高,难治性MPP（RMPP）发生率更大（P＜0.05）。3、高cards tx组BALF中MP-DNA拷贝数、中性粒细胞比例比低cards tx组高（P＜0.05）。4、高cards tx组BALF中TNF-α、sB7-H3、IL-4、IL-6表达水平高于低cards tx组和对照组（P＜0.05）。5、cards tx的表达量与BALF中TNF-α、sB7-H3、IFN-γ、IL-4、IL-6表达水平呈正相关（P＜0.05）。结论:1、cards tx参与MPP的发病,可引起中性粒细胞浸润型炎症。2、cards tx的表达量越高,临床症状越重。3、cards tx的表达量与MP载量呈正相关,同时cards tx表达也与TNF-α、sB7-H3、IL-4、IL-6的表达相关。

关键词： MPP cards tx BALF sB7-H3

清肺透邪汤对肺炎支原体感染小鼠cards tx/NLRP3炎性小体相关因子表达的影响

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中华中医药学刊 2020年第7期38卷 121-126,I0017页

作者：王子王雪峰张秀英吴振起张童辽宁中医药大学研究生学院辽宁沈阳110847 辽宁中医药大学附属医院辽宁沈阳110032

目的探讨清肺透邪汤对肺炎支原体(MP)感染后cards tx及NLRP3炎性小体相关因子的变化及相关性,试图进一步明确清肺透邪汤防治肺炎支原体肺炎(MPP)的效应靶点。方法随机将48只Balb/c幼鼠分成正常组、模型组、清肺透邪汤组、阿奇霉素组4组... 详细信息

目的探讨清肺透邪汤对肺炎支原体(MP)感染后cards tx及NLRP3炎性小体相关因子的变化及相关性,试图进一步明确清肺透邪汤防治肺炎支原体肺炎(MPP)的效应靶点。方法随机将48只Balb/c幼鼠分成正常组、模型组、清肺透邪汤组、阿奇霉素组4组,每组12只。除正常组外,对其余3组Balb/c幼鼠采用滴鼻法进行MP感染。造模后,清肺透邪汤组每只幼鼠给予15 g/kg的对应方剂进行灌胃,1次/d,连续14 d;阿奇霉素组,每只幼鼠给予阿奇霉素90 mg/kg灌胃,1次/d,连续3 d,停药4 d,2个周期,停药期间给予蒸馏水灌胃;正常组、模型组每只幼鼠均给予0.3 mL蒸馏水灌胃。在感染后的第3、7、10、14天进行取材,运用Real-time PCR法检测肺组织cards tx、NLRP3、ASC及Caspase-1的表达,采用ELISA法检测血清中IL-1β表达水平,采用免疫组化法检测肺组织中NF-κB表达。结果MP感染后,幼鼠肺组织出现炎症改变,镜下可见肺泡壁增厚、肺泡上皮细胞破坏、浸润。MP感染后,幼鼠肺组织中的cards tx、NLRP3、ASC及Caspase-1基因表达明显升高;与模型相比,清肺透邪方组幼鼠肺组织中的cards tx、NLRP3、ASC及Caspase-1基因表达明显下降,其上游调控因子NF-κB减少,下游促炎因子IL-1β降低(均Pcards tx基因表达,降低MP毒力作用的主要效应靶点;初步证实了清肺透邪汤可以通过NF-κB通路调控,影响NLRP3炎性小体合成,促使IL-1β所致炎性反应减弱,可能是保护肺损伤的相关机制。

关键词：肺炎支原体清肺透邪汤 NLRP3 cards tx 小鼠

重组cards tx蛋白的克隆、表达与纯化及多克隆抗体制备

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重组CARDs TX蛋白的克隆、表达与纯化及多克隆抗体制备

作者：牛健天津医科大学

学位级别：硕士

目的：肺炎支原体作为非典型肺炎的病原体,不仅能够引起急、慢性呼吸道感染,还可以引起包括皮肤、关节、中枢神经系统等一系列肺外系统疾病。目前,肺炎支原体的致病机制仍未被阐明。近期,研究者们发现一种名为社区获得性呼吸窘迫综合征... 详细信息

目的：肺炎支原体作为非典型肺炎的病原体,不仅能够引起急、慢性呼吸道感染,还可以引起包括皮肤、关节、中枢神经系统等一系列肺外系统疾病。目前,肺炎支原体的致病机制仍未被阐明。近期,研究者们发现一种名为社区获得性呼吸窘迫综合征毒素(cards tx)蛋白,其被认为是目前为止,肺炎支原体体内单一的毒力因子,在肺炎支原体的致病过程中起到了至关重要的作用。本课题拟构建pET28a-cards tx重组质粒,观察其在BL21中表达,并对cardstx蛋白进行纯化,利用纯化cards tx蛋白免疫动物制备抗血清,并对抗血清的效价和特异性进行检测,探讨其应用价值。方法：一、重组质粒的构建及鉴定：以肺炎支原体基因组为模板,利用PCR技术扩增出带有BamHI和Xhol I酶切位点的cards tx基因CMPN372),将其克隆入pET28a,经8次点突变(UGA-UGG)获得pET28a-cards tx重组质粒。对重组质粒分别进行酶切与测序鉴定。二、重组质粒的表达及鉴定：将重组质粒转入BL21中,利用IPTG诱导带有pET28a-cards tx重组质粒的BL21细菌表达目的蛋白,分别通过SDS-PAGE和Wetern Blot检测cards tx蛋白的表达并对目的蛋白可溶性进行鉴定。三、cards tx蛋白的纯化及鉴定：利用亲和层析技术(Ni-NTA)对cardstx进行纯化,并通过SDS-PAGE和Wetern Blot方法鉴定目的蛋白纯化情况。四、多克隆抗体的制备和鉴定：适应性饲养2只雄性大白兔2周后进行初次免疫,将1ml1mg/ml cards tx蛋白与等体积的弗氏完全佐剂充分混合,于大白兔皮下多点免疫。2周后,每隔1周用1ml1mg/ml蛋白与等体积的弗氏不完全佐剂混合,进行多点加强免疫。初次免疫前采取大白兔耳缘静脉血为对照,末次免疫两周后颈动脉取血。利用Western blot方法检测其效价及特异性,ELISA法检测抗血清的应用价值。结果：一、经酶切鉴定发现外源基因、载体及重组质粒均位于正确的大小位置。经测序鉴定,结果发现外源基因碱基序列与Genbank公布的MPN372碱基序列一致,且成功将8个UGA位点突变成UGG。二、对SDS-PAGE和Wetern Blot结果进行分析,我们发现在IPTG的诱导后,在68kDa的位置有蛋白量明显增多。同时也发现该蛋白为不可溶性蛋白。三、利用亲和层析技术对目的蛋白进行纯化并对纯化蛋白进行SDS-PAGE和Wetern Blot分析,结果发现,在68kDa的位置上有特异的目的条带。四、成功制备特异、高效价的重组cards tx蛋白多克隆抗体,且在肺炎支原体的检测中有较好的应用价值,为对肺炎支原体的预防、诊断和治疗提供了依据。结论：成功构建出pET28α-cards tx重组质粒。经IPTG诱导后,在BL21中cards tx蛋白的表达明显增加,并成功将cards tx蛋白纯化出来,并成功制备出高效价、特异的多克隆抗体。

关键词： cards tx 质粒构建点突变蛋白纯化多克隆抗体制备

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金荞麦抗肺炎支原体的作用机理研究

金荞麦抗肺炎支原体的作用机理研究

作者：柳招红昆明理工大学

学位级别：硕士

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)是儿童和青少年社区获得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)的主要病原体之一,可导致急性上、下呼吸道炎症以及肺外并发症。大环内酯类抗生素是治疗儿童支原体感染的首选药物。但随着大环... 详细信息

肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,MP)是儿童和青少年社区获得性肺炎(community acquired pneumonia,CAP)的主要病原体之一,可导致急性上、下呼吸道炎症以及肺外并发症。大环内酯类抗生素是治疗儿童支原体感染的首选药物。但随着大环内酯类抗生素的滥用,导致MP对此类药物的耐药率在亚洲地区高达90%;随之大量出现的MP耐药菌株,给临床治疗带来挑战,但目前仍无针对治疗耐药MP的药物。中医药在防治MP感染有着独特的优势,除了可以直接抑制支原体外,还可以从整体调节机体状态达到标本兼治的目的。因此筛选具有抗耐药MP的中药并探究其潜在的抗MP机制,可为临床利用中药治疗提供理论依据。金荞麦是一种治疗肺脓肿的传统中药,具有显著的抗氧化,抗肿瘤,抗菌等作用。对细菌性痢疾、麻风肺炎、慢性支气管炎、盆骨炎等疾病亦具有一定疗效。但其抗MP的作用,至今尚未有人报道。前期我们建立了MP分离培养体系并建立了菌株系,进行抗MP药物筛选,发现金荞麦乙醇提取部分(多酚含量高)有显著的抗MP作用,特别是对耐药MP更敏感。鉴于此,我们进一步探究了金荞麦抗MP的作用机理。本课题主要从肺炎支原体、细胞实验和动物实验三个层面,探究了金荞麦多酚提取物及其单体抗MP的作用:(1)肺炎支原体研究,通过生长代谢抑制实验,发现金荞麦多酚提取物中多酚含量越高抗MP效果越好。通过CFU计数,发现金荞麦多酚75%具有浓度和时间依赖抑制耐药菌株M19及标准菌株15531、29342,其MIC及MIC值分别为0.625mg/m L及1.25mg/m L,但对M19的杀菌作用更明显。由于MP对宿主细胞的黏附是其致病的关键,在此过程中MP黏附蛋白P1、P30,以及黏附辅助蛋白P65、HMW3发挥至关重要的作用。通过q RT-PCR实验检测,发现单独金荞麦多酚75%处理MP,可显著降低II型菌株M19和29342黏附蛋白P1、P30,但黏附辅助蛋白P65、HMW3 m RNA的表达略有上升。已知红霉素等大环内脂类抗生素可通过结合细菌核蛋白50s亚基,抑制m RNA移位阻止肽链延长等,终止蛋白质合成。Trm B t RNA(guanosine(46)-N7)-methyltransfera(Trm B)是一种t RNA甲基转移酶,参与N(7)-甲基鸟嘌呤-t RNA的生物合成途径,对t RNA转运功能至关重要,其功能受损会影响蛋白质翻译过程。在用金荞麦多酚75%处理MP后,发现可显著降低Trm B的表达,破坏t RNA的功能抑制翻译进程。经网络药理学筛选及生物实验验证,筛选出单体木犀草素抑制MP作用效果最佳。木犀草素处理MP后,发现其同样可显著降低P1、P30以及Trm B m RNA表达,但P65、HMW3 m RNA的表达略有上升。进一步通过蛋白组学测序探究其抗MP机理。发现经木犀草素处理后的MP共有32个蛋白差异表达,其中Trm B结果与实验结果一致,但还需进一步差异蛋白表达分析并进行生物学验证。(2)细胞实验研究,MP感染细胞后用金荞麦多酚75%及木犀草素进行处理,通过q RT-PCR实验检测,发现两种药物均可显著降低MP黏附蛋白P1、P30以及黏附辅助蛋白P65、HMW3的表达,从而降低MP的黏附能力。cards tx(Community Acquired Respiratory Distress Syndrome Toxin,cards tx)是MP中一种独特的细胞毒素,其在MP感染期间表达上调,引起细胞空泡化最终导致细胞死亡。鉴于此,在用金荞麦多酚75%及木犀草素处理MP后,发现均可显著降低M19 cards tx的表达,从而降低对细胞的毒力作用。同时MTT检测发现用药物处理受感染A549细胞,可明显恢复其增值活力。(3)动物实验研究,在用10CCU/ML MP对小鼠感染5天后,分别用169mg/kg金荞麦多酚75%、50mg/kg罗红霉素、50mg/kg木犀草素对小鼠进行7天灌胃给药。发现感染后小鼠体重一直下降,而给药后小鼠体重逐渐回升至正常小鼠体重。且各组小鼠的肺湿重无明显差异。在对各组肺组织进行MP涂布计数,发现金荞麦多酚75%对M19清除率可达到50.7%,木犀草素清除率为44.9%,罗红霉素清除率为25.2%。然后对各组小鼠肺组织进行了细胞免疫因子检测,发现相比M19模型组金荞麦多酚75%及木犀草素能明显降低IL-1β、IL-6、TNF-α、HMGB1、IL-17A的表达,说明金荞麦及木犀草素可改善MP感染小鼠体内的炎症情况。综上所述,研究发现金荞麦及其单体木犀草素可能通过降低MP的黏附能力以及毒力能力,从而降低对细胞的损伤作用;并可能通过抑制蛋白质翻译进程起抗MP作用;此外金荞麦多酚75%提取物及木犀草素可改善耐药及标准MP感染小

关键词：肺炎支原体耐药性金荞麦木犀草素黏附蛋白 cards tx

儿童肺炎支原体肺炎的临床特征及其发病机制探讨

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包头医学院学报 2022年第10期38卷 64-69页

作者：曲艳杰高淑青孙红匣王冬梅董春凤王佩霞包头市第四医院内蒙古包头014030

目的:观察儿童肺炎支原体肺炎的临床特征,探讨社区获得性呼吸窘迫综合征毒素(cards tx)及血清IL-1β的表达等因素在肺炎支原体肺炎发病中的作用。方法:选取本院2019年1月—2020年1月住院的社区获得性肺炎患儿120例为研究对象,分为重症... 详细信息

目的:观察儿童肺炎支原体肺炎的临床特征,探讨社区获得性呼吸窘迫综合征毒素(cards tx)及血清IL-1β的表达等因素在肺炎支原体肺炎发病中的作用。方法:选取本院2019年1月—2020年1月住院的社区获得性肺炎患儿120例为研究对象,分为重症支原体肺炎组(SMPP)(30例)、非重症支原体肺炎组(NSMPP)(50例)及非支原体肺炎组(NMPP)(40例);所有研究对象检测支气管灌洗液cards tx水平及外周静脉血IL-1β、血生化、炎症指标、凝血功能等。结果:(1)cards tx和IL-1β:SMPP组明显高于NSMPP组,NSMPP组均高于NMPP组,差异均有统计学意义(Pcards tx可导致呼吸道损伤,同时诱导炎症因子IL-1β的产生增加,临床上可以通过cards tx的检测对支原体肺炎进行诊断,为进一步有针对性的治疗提供理论依据;(2)支原体感染后存在较严重的机体炎症反应,为抗炎治疗提供有力证据;(3)支原体感染时存在高凝血功能异常,是导致支原体感染出现血栓的原因,是引起支原体感染难治和重症的影响因素。

关键词：肺炎支原体肺炎 cards tx IL-1β 炎性指标凝血指标生化指标