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CAR-NK的构建策略及在血液系统肿瘤中的研究进展

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现代肿瘤医学 2022年第21期30卷 4004-4009页

作者：唐丹婷贾飞宇谢晓丽石远维王丽娟潍坊医学院山东潍坊261000 临沂市人民医院教育教学部山东临沂276000 临沂市人民医院中心实验室山东临沂276000 临沂市肿瘤生物学重点实验室山东临沂276000

自然杀伤(natural killer cells,nk)细胞是先天免疫系统不可或缺的一部分,为抵御异常细胞攻击人体提供了第一道屏障。嵌合抗原受体T细胞(car-T)工程是近年来癌症免疫治疗领域的研讨热点,它改变了血液肿瘤的传统治疗方法,这种新颖的治疗... 详细信息

自然杀伤(natural killer cells,nk)细胞是先天免疫系统不可或缺的一部分,为抵御异常细胞攻击人体提供了第一道屏障。嵌合抗原受体T细胞(car-T)工程是近年来癌症免疫治疗领域的研讨热点,它改变了血液肿瘤的传统治疗方法,这种新颖的治疗方式已经在血液肿瘤中显示出了令人振奋的结果。然而,car-T的临床应用受到了高昂的制造成本和各种副作用的限制。nk细胞由于具有更好的安全性、“现成”生产的可行性和强大的细胞毒性激发了人们开发用于癌症治疗的car工程nk细胞(CAR-NK)的兴趣,CAR-NK有望取代car-T成为更有前景的抗癌方法。本文中我们描述了当前CAR-NK的构建策略和在血液系统肿瘤中的研究进展。

关键词：自然杀伤细胞嵌合抗原受体 CAR-NK 免疫治疗血液系统肿瘤

脐血来源CD19-CAR-NK的构建及其功能研究

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脐血来源CD19-CAR-NK的构建及其功能研究

作者：张月琴成都医学院

学位级别：硕士

研究背景与目的:靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor-modified T cells,car-T)在针对复发和难治性B细胞急性淋巴细胞白血病的临床试验中表现出强烈的抗肿瘤功效。但是car-T疗法仍然有一定的局限性,包括:细胞因子释... 详细信息

研究背景与目的:靶向CD19的嵌合抗原受体T细胞(chimeric antigen receptor-modified T cells,car-T)在针对复发和难治性B细胞急性淋巴细胞白血病的临床试验中表现出强烈的抗肿瘤功效。但是car-T疗法仍然有一定的局限性,包括:细胞因子释放综合征(cytokine release syndrome,CRS)、神经毒性以及异体car-T会引起移植物抗宿主病(graft-versus-host disease,GVHD)等。目前,car-T疗法以患者自体T细胞来源为主,其造价高、生产周期长,属于个性化治疗。所以有必要去研究其他免疫效应细胞,探究其在通过car修饰后,是否能减少上述毒副反应。与T细胞不同,自然杀伤细胞(natural killer cells,nk)以非抗原特异性方式杀死靶细胞,并且不具有诱导GVHD的风险,从而允许在同种异体环境中应用供体来源的细胞。因此,与自体car-T细胞不同,CD19-CAR-NK细胞可以作为“现成”产品直接使用。本文以冻存后的脐带血为来源,通过优化nk细胞的培养方法在体外大量扩增高纯度的nk细胞,然后用慢病毒转导nk细胞,制备靶向CD19的CAR-NK细胞,并在体外验证CAR-NK细胞的抗肿瘤功能。材料与方法:1.采用Ficoll密度梯度离心法将脐带血中单个核细胞(cord blood mononuclear cells,CBMC)分离出来,并采用CD56免疫磁珠纯化nk细胞。2.将纯化后的nk细胞在5种培养基中培养12天后,比较nk细胞的扩增倍数,用流式细胞仪检测nk细胞表面CD16表达情况。3.将纯化后的nk细胞在含不同细胞因子的ACTM培养基中培养5天,比较nk细胞的增殖倍数和活化指标。4.以含IL-2的ACTM为基础培养基,再添加一种细胞因子,体外培养CBMC细胞与纯化的nk细胞共15天,比较不同细胞因子组合下nk细胞的扩增倍数、纯度、凋亡及杀伤功能。5.将纯化后的nk细胞以不同的接种密度,用含IL-2+IL-15的ACTM培养21天。比较nk细胞的扩增倍数。6.将nk细胞经CD56磁珠纯化后,用含IL-2+IL-15的ACTM培养基培养3天,在不同的MOI下转导car19慢病毒,72h后检测nk细胞的病毒转导效率,同时观察病毒转导后6天内nk细胞的累计增殖倍数。7.固定MOI为50,加入不同浓度的BX795抑制nk细胞的抗病毒机制,30min后再加入慢病毒,72h后检测car阳性率,比较nk与CAR-NK细胞的凋亡情况。8.采用CRISPR/Cas9基因编辑技术敲除Nalm6、Nalmawa的CD19基因,并通过CD19磁珠纯化,制备Nalm6-CD19KO、Nalmawa-CD19KO细胞。9.分别以nk细胞与CAR-NK细胞为效应细胞,以CD19、CD19细胞为靶细胞,按照1:1、1:3、1:9的效靶比开展杀伤实验,比较2种效应细胞的杀伤功能。10.取杀伤后的细胞上清,用CBA检测细胞因子的含量。结果:1.磁珠纯化后将nk细胞在CBMC中的比例提高至97%。2.5种培养基中,ACTM培养基中nk细胞12天内扩增(27.1±0.66)倍,是增殖最好的培养基。3.IL-2与IL-15均能在体外活化与扩增nk细胞,但nk在IL-2中的增殖优于IL-15。4.IL-2+IL-15的组合下nk细胞增殖最多,且从CBMC培养的nk细胞存在T细胞污染,用磁珠纯化后再培养可获得高纯度的nk细胞。纯化的nk细胞在IL-2+IL-15中凋亡最少:(4.6±0.14)%,CD56dim nk亚群占比多:(74.33±5.03)%。5.随着MOI的增加,nk细胞的慢病毒转导效率增加,当MOI为50、100时,nk细胞的car19阳性率分别为(10.47±0.99)%、(11.37±0.57)%。6.固定MOI为50,慢病毒转导前30min加入不同浓度BX795抑制nk细胞的抗病毒机制,发现nk细胞的病毒转导效率与BX795浓度呈正相关,但当BX795浓度大于6μM后,nk细胞的car阳性率降低,因此BX795促进nk细胞的病毒转导作用与其浓度相关。7.各效靶比下,CAR-NK细胞对CD19肿瘤细胞的杀伤作用均强于nk细胞,但对CD19肿瘤细胞的杀伤作用与nk细胞无差异,说明CAR-NK没有增强nk细胞的非特异性杀伤作用。8.比较CAR-NK与nk细胞释放的细胞因子,发现CAR-NK细胞释放的IFN-γ、Granzyme B以及Perforin均优于nk细胞。结论:1.将冻存后的脐血经Ficoll后,再通过CD56免疫磁珠纯化nk细胞,用含IL-2+IL-15的ACTM培养,可在体外大量扩增nk细胞。2.将纯化的nk细胞用含IL-2+IL-15的ACTM培养3天,用6μM BX795预处理30min,MOI为50转导慢病毒,可制备CD19-CAR-NK细胞

关键词：脐带血 nk细胞培养 CAR-NK 特异性杀伤

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CAR-NK细胞在肿瘤免疫学治疗中的应用

免疫学杂志 2020年第4期36卷 358-363页

作者：刘欣赵娜天津医科大学总医院普通外科天津市普通外科研究所 300052

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,car)是为了使免疫效应细胞能够识别肿瘤表面抗原并以HLA不受限制的方式杀死靶细胞而开发的。自然杀伤(natural killer,nk)细胞是固有免疫系统的重要组成部分,在肿瘤免疫治疗中以非特异性的方式... 详细信息

嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,car)是为了使免疫效应细胞能够识别肿瘤表面抗原并以HLA不受限制的方式杀死靶细胞而开发的。自然杀伤(natural killer,nk)细胞是固有免疫系统的重要组成部分,在肿瘤免疫治疗中以非特异性的方式杀死肿瘤细胞。随着car-T细胞疗法和过继细胞疗法在肿瘤免疫治疗中取得成功,nk细胞因其无需预先致敏并且不会导致移植物抗宿主病,在car细胞疗法中受到越来越多的关注。近几年有很多对CAR-NK细胞疗法靶点的临床前研究,在肿瘤治疗中显示出很好的疗效。本文就近几年研究多的CAR-NK细胞疗法靶点的研究现状及其应用做一综述。

关键词： CAR-NK 肿瘤免疫治疗 CD19 HER2 EGFR

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CAR-NK细胞疗法的优化改造策略

药物生物技术 2023年第3期30卷 308-313页

作者：邵帅张娟中国药科大学生命科学与技术学院江苏南京211198

近年来,细胞免疫疗法为血液系统恶性肿瘤的治疗提供了新策略。nk细胞作为固有免疫系统中重要成员之一,具有较强的免疫监视与杀伤功能,在肿瘤免疫治疗中发挥重要的作用。随着嵌合抗原受体T细胞(car-T)疗法的兴起,CAR-NK疗法也脱颖而出。C... 详细信息

近年来,细胞免疫疗法为血液系统恶性肿瘤的治疗提供了新策略。nk细胞作为固有免疫系统中重要成员之一,具有较强的免疫监视与杀伤功能,在肿瘤免疫治疗中发挥重要的作用。随着嵌合抗原受体T细胞(car-T)疗法的兴起,CAR-NK疗法也脱颖而出。CAR-NK基于car-T的设计思路并结合nk细胞自身特性而构建,以其通用性、可“现货”性以及在实体瘤治疗中的潜力在过继细胞疗法领域崛起,有望成为car-T的替代方案。然而,CAR-NK疗法也存在一些缺点,如体内持续时间较短、杀伤效果和实体瘤归巢效果不佳以及潜在的脱靶毒性等,为CAR-NK投入临床运用带来挑战。在患者治疗需求驱动下,已有多种CAR-NK优化改造方案得以实施并进入临床试验阶段。文章总结了CAR-NK细胞的优化改造策略,并讨论其当前作为一种新的肿瘤免疫疗法所面临的挑战和未来发展前景。

关键词：细胞免疫疗法肿瘤免疫治疗实体瘤治疗过继细胞疗法嵌合抗原受体 CAR-NK

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CAR-NK抗肿瘤研究的现状与发展趋势

中国肿瘤生物治疗杂志 2016年第1期23卷 1-10页

作者：殷书磊于益芝曹雪涛第二军医大学免疫学研究所暨医学免疫学国家重点实验室上海200433

作为固有免疫中重要的效应细胞,nk细胞具有强大的抗肿瘤功能,在肿瘤免疫治疗方面具有良好的应用前景。随着嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,car)修饰的T细胞(car-T)技术的兴起,nk细胞的car修饰潜力也受到了关注。CAR-NK的研发... 详细信息

作为固有免疫中重要的效应细胞,nk细胞具有强大的抗肿瘤功能,在肿瘤免疫治疗方面具有良好的应用前景。随着嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,car)修饰的T细胞(car-T)技术的兴起,nk细胞的car修饰潜力也受到了关注。CAR-NK的研发既传承了经典car-T研发的思路,也实现了诸多基于nk细胞生物特点的创新和发展。外周血nk细胞、nk细胞系和干细胞来源的nk细胞各具生物学特色,在CAR-NK研发中被广泛使用。已有靶向多种血液肿瘤和实体瘤抗原的CAR-NK在体外实验和动物模型中取得显著效果。虽然在临床暂未有数据支持CAR-NK的疗效且仍存在一些瓶颈问题需要攻克,但是CAR-NK有望在治疗实体瘤、简化免疫治疗等方面实现新的突破。

关键词：嵌合抗原受体 CAR-NK nk-92 血液肿瘤实体瘤肿瘤免疫治疗

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CAR-NK细胞治疗技术专利分析

中国医药导报 2023年第19期20卷 14-18页

作者：梁亚茹李丽媛国家知识产权局专利局医药生物发明审查部北京100088 清华大学药学院蛋白质科学教育部重点实验室北京100084

目的从专利视角揭示CAR-NK细胞治疗技术的研究进展,以期为我国创新主体的研发提供有益参考。方法通过中国专利检索与服务系统数据库检索CAR-NK相关专利,对其专利申请趋势、地区分布情况和主要申请人的研发路线进行分析。结果 CAR-NK... 详细信息

目的从专利视角揭示CAR-NK细胞治疗技术的研究进展,以期为我国创新主体的研发提供有益参考。方法通过中国专利检索与服务系统数据库检索CAR-NK相关专利,对其专利申请趋势、地区分布情况和主要申请人的研发路线进行分析。结果 CAR-NK专利申请呈稳步增长态势,国内外多家企业正在该领域加速布局,国内公司研究主要集中于对不同靶点的CAR-NK的设计,对联合用药及上下游技术涉及较少,专利申请分布的技术方向相对单一,处于较为初始的研发阶段,而国外大型医药公司的专利申请注重多角度布局,涉及产业链各个环节。结论我国CAR-NK领域高价值专利数量相对较少,今后还需在专利布局和成果转化上给予更高的重视。

关键词：嵌合抗原受体自然杀伤细胞肿瘤免疫治疗 CAR-NK 专利分析

新型HER2嵌合抗原受体的构建与CAR-NK细胞体外杀伤活性研究

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新型HER2嵌合抗原受体的构建与CAR-NK细胞体外杀伤活性研究

作者：刘沙北京工业大学

学位级别：硕士

HER2蛋白属于EGFR家族,可通过同源二聚体偶联,激活信号转导通路,导致基因转录的上调,这些基因会促进肿瘤的发生与发展。HER2在乳腺癌等多种恶性肿瘤细胞表面高表达,且HER2阳性乳腺癌恶性程度高,预后差,因此HER2被认为是抗肿瘤治疗的重... 详细信息

HER2蛋白属于EGFR家族,可通过同源二聚体偶联,激活信号转导通路,导致基因转录的上调,这些基因会促进肿瘤的发生与发展。HER2在乳腺癌等多种恶性肿瘤细胞表面高表达,且HER2阳性乳腺癌恶性程度高,预后差,因此HER2被认为是抗肿瘤治疗的重要靶点。亲和体(Affibody)是一种经人工筛选改造后的新型支架蛋白,由于其与抗原的结合类似抗原-抗体结合,因此有“人工抗体”之名。亲合体分子量小,特异性强,亲和力高,通常被用作生物成像的分子探针,或肿瘤治疗性药物的载体。近年来,肿瘤免疫治疗成为了抗肿瘤研究领域的热点之一。其中,嵌合抗原受体修饰nk细胞(CAR-NK)的免疫治疗技术,作为一种新型抗肿瘤免疫疗法被广泛关注。本文的创新点在于构建了以可特异性识别并结合HER2的亲合体Z作为嵌合抗原受体胞外结构域的质粒(Z-28ζ-pLVX-Puro),据我们所知,这是首次将亲合体作为car胞外区。除此以外,本研究还构建了1种以anti-HER2的人源化scFv为胞外区的第二代嵌合抗原受体修饰的nk-92MI细胞。我们首先在体外构建了3种重组anti-HER2的慢病毒表达质粒。其次,我们利用293TX细胞包装了慢病毒颗粒并测定了滴度,然后利用超滤离心管或超速离心法浓缩了慢病毒颗粒。在转染293TX细胞并进行嘌呤霉素筛选之后,在蛋白水平上,Western Blot实验证明3种car蛋白的表达;而在细胞水平,利用免疫荧光和荧光成像评估car结构的表达。此外,我们利用anti-HER2 scFv-28ζcar慢病毒颗粒转染nk-92MI细胞系,并利用嘌呤霉素对CAR-NK细胞进行筛选,随后用荧光成像验证car结构的表达,最后利用LDH释放实验评估其对HER2高表达乳腺癌细胞系的特异性细胞毒性,为anti-HER2 CAR-NK治疗乳腺癌提供实验基础。

关键词：嵌合抗原受体 HER2 亲合体 CAR-NK 乳腺癌

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CAR-NK细胞治疗血液肿瘤的研究进展

临床血液学杂志 2023年第1期36卷 76-80页

作者：刘洪秀韩艳秋内蒙古医科大学附属医院血液科呼和浩特010050

nk细胞作为固有免疫细胞在肿瘤免疫监视中发挥重要作用。相比car-T其神经毒性、细胞因子释放综合征等不良反应和移植物抗宿主病鲜有发生,因此有希望成为嵌合抗原受体细胞免疫治疗更好的细胞来源。目前CAR-NK细胞的研究仍多使用根据T细... 详细信息

nk细胞作为固有免疫细胞在肿瘤免疫监视中发挥重要作用。相比car-T其神经毒性、细胞因子释放综合征等不良反应和移植物抗宿主病鲜有发生,因此有希望成为嵌合抗原受体细胞免疫治疗更好的细胞来源。目前CAR-NK细胞的研究仍多使用根据T细胞激活原理设计的car。该文针对nk细胞激活原理设计的car结构、可用于免疫治疗的nk细胞来源和CAR-NK细胞在白血病、淋巴瘤、骨髓瘤的临床前景及临床研究进展进行综述。分析得出,“现货型”CAR-NK细胞将是血液肿瘤治疗的新方向,如何增加CAR-NK细胞在体内的存活时间仍是其应用于临床亟须解决的问题。

关键词： CAR-NK 过继性细胞免疫治疗血液肿瘤 nk细胞

改良型人nk细胞体外扩增技术建立及CAR-NK细胞治疗技术初步研究

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改良型人NK细胞体外扩增技术建立及CAR-NK细胞治疗技术初步研究

作者：李亚芬苏州大学

学位级别：硕士

nk细胞过继疗法是肿瘤免疫疗法的一种具有前景的治疗策略,然而,大量扩增具有功能的nk细胞方法的缺乏限制了它的发展。由于IL21分子是nk细胞功能的重要调节分子,因此本文的主要目的之一是建立一种改良型的基于IL21分子的nk细胞体外扩增... 详细信息

nk细胞过继疗法是肿瘤免疫疗法的一种具有前景的治疗策略,然而,大量扩增具有功能的nk细胞方法的缺乏限制了它的发展。由于IL21分子是nk细胞功能的重要调节分子,因此本文的主要目的之一是建立一种改良型的基于IL21分子的nk细胞体外扩增技术。在本文中,我们在稳定表达IL15和CD137L分子的p APC细胞上再进一步表达IL21分子,然后用构建的该工程细胞株(命名为p APCnk)来扩增nk细胞。具体方法为:分离4名健康人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC),采用工程细胞p APCnk并补充细胞因子IL2对nk细胞进行体外扩增,应用细胞计数法和流式细胞术分别比较nk细胞的扩增倍数和nk细胞纯度,并采用CFSE/7-AAD法对肿瘤细胞K562和RPMI-8226进行细胞毒性试验检测杀伤效率。经过三周的刺激培养,nk细胞平均扩增至409.4倍,细胞纯度由最初的低于20%提高到90%以上。杀伤实验结果显示,扩增的nk细胞对K562细胞杀伤率高达85.2%。但由于nk细胞非抗原特异性的杀伤特征,会限制其临床上的治疗效果。近年来过继性细胞治疗技术中,嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,car)修饰的T细胞技术异军突起,在体外和临床试验中表现出良好的靶向性、杀伤性和持久性,展示了巨大的应用潜力和发展前景。因此本研究在nk细胞扩增技术体系建立的基础上,尝试开发CAR-NK细胞治疗技术,从而提高nk细胞活性并且让nk细胞具备肿瘤抗原特异性杀伤能力。本研究选用HER2作为靶点来探索开发CAR-NK细胞治疗技术的可能性,并积累了初步的实验数据,为进一步建立完善的CAR-NK细胞治疗技术提供了依据。

关键词： nk细胞体外扩增 pAPCnk CAR-NK HER2-car-T 癌症免疫治疗