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草鱼c5a、c5ar和FⅡ多克隆抗体的制备与表达特性

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水产学报 2022年第5期46卷 785-796页

作者：苏杭肖调义许宝红刘巧林吕丽刚刘益湖南农业大学湖南省特色水产资源利用工程技术研究中心

为研究草鱼补体蛋白5a (complement component 5a,c5a)、补体蛋白5a受体(c5a receptor,c5ar)和凝血因子Ⅱ(blood coagulation factorⅡ，FⅡ)在感染草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GcRV)时的蛋白表达和相互作用，针对草鱼c5a和FⅡ蛋白构建了原核表达体系、针对草鱼c5ar蛋白构建c5ar-KLH偶联物，纯化蛋白，免疫日本大耳白兔制备3种蛋白的多克隆抗体。用蛋白质印迹(Western blot)、免疫共沉淀(co-IP)和拉下(pull down)实验检测3种蛋白表达与互作关系，Western blot结果显示，c5a和c5ar在健康草鱼的肝脏、脾脏、肾脏、头肾、肠、鳃和肌肉中均有蛋白表达，FⅡ在肝脏、脾脏和肠中表达，而在肾脏、头肾、鳃和肌肉中不表达；在感染GcRV的草鱼肝脏组织中c5a、c5ar和FⅡ蛋白均随病程进展呈现上升趋势。co-IP结果显示，在GcRV处理后，c5a、c5ar和FⅡ蛋白具有相互作用关系。pull down结果显示，c5a pull down共鉴定得到c3、RIG-I等28种候选蛋白，c5ar pull down共鉴定得到转醛醇酶、巨球蛋白等24种候选蛋白。该研究为深入探讨c5a、c5ar和FⅡ互作调控关系以及进一步探索补体和凝血级联系统中3个关联蛋白响应GcRV感染的作用机制奠定了基础。

关键词：草鱼 c5a c5ar FⅡ 多克隆抗体草鱼呼肠孤病毒(GcRV) 表达特性

c5a/c5ar信号在约氏疟原虫肝期发育及遗传减毒子孢子诱导小鼠保护性免疫中的作用

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免疫学杂志 2015年第3期31卷 221-223页

作者：刘博谭章平郑鸿周桃莉丁艳徐文岳第三军医大学基础部病原生物教研室重庆400038

目的探讨c5a/c5a R信号在约氏疟原虫肝期自然感染和遗传减毒子孢子诱导小鼠保护性免疫中的作用。方法遗传减毒子孢子免疫Balb/c小鼠2、4、6 d后,ELISA检测补体c5a的活化情况;然后利用c5a R-/-Balb/c小鼠,通过定量PcR检测和吉姆萨染色比... 详细信息

目的探讨c5a/c5a R信号在约氏疟原虫肝期自然感染和遗传减毒子孢子诱导小鼠保护性免疫中的作用。方法遗传减毒子孢子免疫Balb/c小鼠2、4、6 d后,ELISA检测补体c5a的活化情况;然后利用c5a R-/-Balb/c小鼠,通过定量PcR检测和吉姆萨染色比较子孢子攻击免疫或未免疫2种小鼠的肝脏虫荷和原虫血症。结果子孢子攻击免疫或未免疫的野生与c5a R-/-小鼠的肝脏虫荷和原虫血症之间无统计学差异(P>0.05)。结论遗传减毒子孢子免疫能够成功诱导小鼠产生完全保护性免疫,但补体c5a R缺失对减毒子孢子的免疫保护效果和肝期自然感染均无明显影响,说明c5a/c5a R信号通路并不参与调节约氏疟原虫肝期发育和遗传减毒子孢子诱导小鼠产生的保护性免疫。

关键词：遗传减毒子孢子免疫补体 c5a c5ar

金黄色葡萄球菌分泌趋化抑制蛋白与c5ar、c5L2的相互作用

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基础医学与临床 2010年第5期30卷 496-499页

作者：刘振嘉杜冠华宫丽丽高金明中国医学科学院北京协和医学院北京协和医院呼吸内科北京100730 中国医学科学院北京协和医学院药物研究所北京100050

目的探讨金黄色葡萄球菌分泌的趋化抑制蛋白(cHIPs)与G蛋白偶联受体(GPcR)c5a受体(c5ar)或促酰化蛋白受体(c5L2))的相互作用。方法将纯化的cHIPs蛋白分别与表达c5ar、c5L2、cXc趋化因子受体3(cXcR3)的人肾胚胎上皮细胞293T分别孵育,用We... 详细信息

目的探讨金黄色葡萄球菌分泌的趋化抑制蛋白(cHIPs)与G蛋白偶联受体(GPcR)c5a受体(c5ar)或促酰化蛋白受体(c5L2))的相互作用。方法将纯化的cHIPs蛋白分别与表达c5ar、c5L2、cXc趋化因子受体3(cXcR3)的人肾胚胎上皮细胞293T分别孵育,用Western blot检测结合情况。结果cHIPs蛋白与c5ar相结合,与c5L2和cXcR3无明显结合。结论c5ar是cHIPs蛋白的受体,提示c5L2与c5ar在和cHIPs的结合作用上存在明显差异。

关键词： cHIPs c5ar c5L2 相互作用

人c5ar(cD88)序列结构分析及其B细胞表位预测

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免疫学杂志 1998年第3期14卷 153-156页

作者：吕凤林朱锡华第三军医大学免疫学教研室

采用ＫｙｔｅＤｏｏｌｉｔｔｌｅ氨基酸亲水性标准及Ｂａｉｒｏｃｈ的ＧＧＢＳＭ方案对人Ｃ５ａＲ分子的亲水性基序、Ｂ细胞表位及二级结构进行了预测，并用吴氏建立的Ｂ细胞表位预测方法进行评述。结果显示，不同的预测方案所得结果一... 详细信息

采用ＫｙｔｅＤｏｏｌｉｔｔｌｅ氨基酸亲水性标准及Ｂａｉｒｏｃｈ的ＧＧＢＳＭ方案对人Ｃ５ａＲ分子的亲水性基序、Ｂ细胞表位及二级结构进行了预测，并用吴氏建立的Ｂ细胞表位预测方法进行评述。结果显示，不同的预测方案所得结果一致，人Ｃ５ａＲ分子中，构成螺旋结构，伸展构象及无规卷曲的氨基酸残基数比例分别为３３．７％，３４．６％，３１．７％。三个高亲水性区域为第１５～１８位的ＤＤＫＤ，第１９５～２００位的ＤＫＲＲＥＲ和第３３０～３３３位的ＲＥＳＫ，其Ａｈ值分别为３．０、３．０、２．３２。其平均抗原性指数ＡＩ值分别为０．０６４、０．０９１、０．０７０。Ｎ－端第９～３０氨基酸序列的ＡＩ＝０．０４２，是Ｂ细胞优势表位区，以此制作短肽单克隆抗体是可行的。

关键词：结构分析 B细胞表位 c5ar 补体受体

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c5ar与c5L2在脓毒症中的作用

中国急救医学 2010年第11期30卷 1033-1035页

作者：胡念丹李文强武汉大学人民医院急诊科武汉430060

脓毒症时补体系统过度激活产生大量过敏毒素c5a,c5a与其受体相互作用在脓毒症的发生过程中十分重要,成为研究脓毒症发生机制中的一个新热点.

关键词：脓毒症 c5a c5ar c5L2

短发夹状RNA基因沉默补体受体c5ar及抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡

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中国免疫学杂志 2010年第2期26卷 151-154页

作者：陈栋张艳李明尹注增陈刚张伟杰陈实华中科技大学同济医学院附属同济医院器官移植研究所教育部/卫生部器官移植重点实验室武汉430030 华中科技大学同济医学院附属同济医院综合医疗科武汉430030

目的:探讨短发夹状RNA基因沉默补体受体c5ar及抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡的作用效果。方法:构建针对大鼠补体受体c5ar基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒pRNAT-U6.1-c5ar shRNA,采用电穿孔的方法转染RK3E细胞,经G418... 详细信息

目的:探讨短发夹状RNA基因沉默补体受体c5ar及抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡的作用效果。方法:构建针对大鼠补体受体c5ar基因编码区的短发夹状RNA(shRNA)真核表达载体质粒pRNAT-U6.1-c5ar shRNA,采用电穿孔的方法转染RK3E细胞,经G418筛选后,形成稳定的表达c5ar shRNA的细胞系。实验分为3组,①正常对照组:未转染的RK3E细胞;②阴性对照组:转染空载体pRNAT-U6.1的RK3E细胞系;③实验组:转染c5ar shRNA的RK3E细胞系。经脂多糖(LPS)孵育12小时后,流式细胞仪检测各组细胞凋亡率,RT-PcR检测mRNA的表达,γ计数仪测定125I标记的c5a与RK3E的结合情况。结果:与正常对照组和阴性对照组相比,实验组的细胞凋亡率显著降低(Pc5ar mRNA水平显著降低(Pc5a与RK3E结合活性显著下降。结论:针对c5ar的特异性短发夹RNA可以明显引起靶基因的沉默,进而抑制LPS诱导的肾脏上皮细胞凋亡的发生。

关键词： RNA干扰 c5ar 基因沉默凋亡

c5ar在非小细胞肺癌侵袭转移中的作用及其机制研究

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C5aR在非小细胞肺癌侵袭转移中的作用及其机制研究

作者：古杰复旦大学

学位级别：硕士

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,调查显示,全球每年约有150万人死于肺癌,其中约90%的病例是死于肺癌的转移。此外,尚有大量确诊的伴有远处转移的晚期病例,转移灶的临床治疗十分困难,使得肺癌死亡率居高不下。因此,进一步... 详细信息

肺癌是全球发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,调查显示,全球每年约有150万人死于肺癌,其中约90%的病例是死于肺癌的转移。此外,尚有大量确诊的伴有远处转移的晚期病例,转移灶的临床治疗十分困难,使得肺癌死亡率居高不下。因此,进一步阐明肺癌侵袭转移的精确分子机制,提供新的治疗靶点,从而提高肺癌治疗水平具有重要意义。c5ar为补体5片段受体(complement component5a receptor),属G蛋白偶联受体。最初发现c5ar主要表达在髓系来源细胞,后来发现支气管肺泡上皮、肝细胞等多种组织器官中也有一定的表达。c5ar作用广泛,与配体c5a结合参与了一系列炎症反应,如：诱导中性粒细胞趋化,促进中性粒细胞脱颗粒及髓过氧化物酶(MPO)释放,分泌IL-6、11--8及TNF-α等细胞因子。同时,c5ar参与了肝脏损伤肝实质细胞再生过程。近年来c5ar在肿瘤中的作用,受到人们关注。最早Buchner RR等在人的肝癌细胞表面发现功能性c5ar的高表达,相反正常肝细胞c5ar表达很低。Hidetoshi Nitta等发现c5ar在多种肿瘤细胞上均有一定的表达,cSar促进了胆管细胞癌的侵袭通过释放基质金属蛋白酶。但c5ar在非小细胞肺癌侵袭及转移中的作用尚未有明确报道,其在肿瘤侵袭转移中的机制仍需进一步研究,因此,本实验通过研究非小细胞肺癌内c5ar的表达,研究其与肺癌发生发展及预后的相关性,通过干扰c5ar表达,探讨c5ar促进非小细胞肺癌侵袭转移的具体机制。第一部分c5ar在非小细胞肺癌组织及细胞系中的表达研究首先,我们通过荧光定量PcR检测非小细胞肺癌细胞株(A549、H1355、H460、95-c、95-D)及正常支气管上皮细胞株16HBE中的c5ar的表达。其次,通过western blot我们检测6例非小细胞肺癌组织及相应癌旁组织内c5ar的表达情况。结果表明：无论在细胞株水平还是组织水平,c5ar在非小细胞肺癌内的表达均显著高于正常组织,提示c5ar有可能参与了非小细胞肺癌的发生发展。第二部分干扰c5ar对非小细胞肺癌细胞株生物学功能的影响为研究c5ar与非小细胞肺癌侵袭转移的关系,我们化学合成了3对不同的siRNA,通过脂质体转染技术,检测转染后c5ar的表达情况,结果显示3对引物均对c5ar有干扰效果,其中S3效率最高,差异均具有统计学意义(pccK-8、克隆形成实验、细胞周期、凋亡及Transwell和细胞划痕实验进一步检测干扰c5ar后对非小细胞肺癌细胞株生物学功能的影响,并进一步通过裸鼠皮下移植瘤模型验证。已知c5ar参与了晶状上皮的上皮间质转化,进一步通过干扰c5ar后检测细胞形态及上皮问质表型变化验证其在肿瘤上皮间质转化中的作用。结果表明：干扰c5ar后显著抑制非小细胞肺癌细胞株A549的增殖能力、克隆形成能力、成瘤大小及侵袭转移能力。干扰c5ar后细胞E-cadherin表达上调,Vimentin表达下调,c5ar参与了非小细胞肺癌上皮间质转化。第三部分c5ar表达与肺癌临床病理特征及预后的关系鉴于细胞水平的结果,我们通过免疫组化检测组织芯片内208例非小细胞肺癌内c5ar的表达情况,统计其与肺癌临床病理特征及预后的关系,研究c5ar表达与肺癌临床病理特征及预后的关系。结果表明：c5ar表达与非小细胞肺癌淋巴结转移显著相关(p5),组织内c5ar的表达与E-cadherin表达负相关(p3cm及c5ar高表达患者总体生存率(Overall survival)差,cox多因素提示c5ar表达、肿瘤分期、淋巴结转移及肿瘤直径是患者独立预后因素。第四部分c5ar促进非小细胞肺癌侵袭转移的机制研究c5ar是如何促进非小细胞肺癌侵袭及转移呢,已知c5ar下游主要通过AKT和MAPK通路,通过干扰c5ar后,western blot检测AKT、ERK、p38及MMPs等表达情况。结果表明：c5ar通过激活AKT抑制了细胞凋亡,c5ar促进了MMP-9及MMP-2的表达,c5ar可能通过磷酸化ERK促进了非小细胞肺癌上皮间质转化。

关键词： c5ar 非小细胞肺癌侵袭转移

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c5ar在肾脏的表达及功能的研究进展

实用医学杂志 2009年第5期25卷 820-821页

作者：张慧明于永刚南方医科大学解放军181医院泌尿外科广西桂林市541002

过去认为c5ar仅在髓系细胞表达,现在发现在人和啮齿类动物的肝、肺、脑等实质器官也都有表达。

关键词：肾脏 c5ar 体外培养肝实质细胞髓系细胞系膜细胞近曲小管上皮细胞单核巨噬细胞炎症部位功能性粒细胞

不同遗传背景对c5ar在银屑病病理中作用的影响

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中国免疫学杂志 2020年第8期36卷 905-909页

作者：徐砜郑权友李桂清陈戬许桂莲(指导) 陆军军医大学基础医学院免疫学教研室重庆400038 陆军军医大学958医院泌尿外科重庆400038

目的:建立咪喹莫特诱导的银屑病样动物模型,通过比较BALB/c和c57BL/6两种遗传背景的c5ar^+/+和c5ar^-/-小鼠的病理表现及相关指标的变化,探讨不同遗传背景对c5ar在银屑病病理发生中的作用。方法:小鼠分为4组:c5ar^+/+BALB/c、c5ar^-/-BA... 详细信息

目的:建立咪喹莫特诱导的银屑病样动物模型,通过比较BALB/c和c57BL/6两种遗传背景的c5ar^+/+和c5ar^-/-小鼠的病理表现及相关指标的变化,探讨不同遗传背景对c5ar在银屑病病理发生中的作用。方法:小鼠分为4组:c5ar^+/+BALB/c、c5ar^-/-BALB/c、c5ar^+/+c57BL/6和c5ar^-/-c57BL/6小鼠组。咪喹莫特涂抹小鼠背部皮肤,诱导银屑病动物模型。依据PASI(psoriasis area severity index)评价各组小鼠的皮损程度;HE染色观察皮损组织的病理学变化;qRT-PcR检测皮损组织中IL-17A mRNA水平;流式细胞术分析引流淋巴结和皮损局部组织中分泌IL-17A的γδT细胞亚群的百分比。结果:与同背景c5ar^+/+小鼠相比,c5ar^-/-小鼠银屑病样表型显著减小;相比BALB/c背景的c5ar^+/+(或c5ar^-/-)小鼠,c57BL/6背景的c5ar^+/+(或c5ar^-/-)小鼠银屑病样皮损和相关指标明显减轻;皮损局部组织和引流淋巴结中分泌IL-17A的γδT细胞亚群百分比显著降低。结论:c5ar在咪喹莫特诱导的银屑病样炎症中发挥重要作用;但遗传背景不同,咪喹莫特诱导的银屑病样小鼠表现也不同:BALB/c遗传背景的c5ar^+/+和c5ar^-/-小鼠比c57BL/6遗传背景的相应c5ar^+/+和c5ar^-/-小鼠更为敏感。

关键词：遗传背景 c5ar 银屑病咪喹莫特小鼠模型