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P^(38)MAPK通路在BMP9诱导c3h10t1/2干细胞向心肌样细胞分化中的作用

重庆医科大学学报 2012年第8期37卷 657-660页

作者：张芬陈沅孙文静陈露陈妙月朱高慧重庆医科大学附属儿童医院心血管内科重庆400014

目的:研究P38丝裂原活化蛋白激酶(P38mitogen-activated protein kinases,P38MAPK)通路在骨形态发生蛋白9(Bonemorphogenetic protein 9,BMP9)诱导c3h10t1/2干细胞向心肌样细胞分化中的作用。方法:免疫印迹检测经pAdEasyBMP9诱导24 h的c3h10t1/2干细胞磷酸化P38MAPK和P38MAPK表达水平,免疫荧光定位磷酸化P38MAPK;SB203580抑制c3h10t1/2干细胞磷酸化P38MAPK活性,pAdEasyBMP9诱导21 d时免疫印迹检测心肌特异性蛋白cX43、ctnt表达,免疫荧光检测心肌特异性蛋白ctnt、α-Mhc表达,Rt-qPcR检测心肌特异性基因GAtA4、MEF2c表达。结果:pAdEasyBMP9促进磷酸化P38MAPK表达增高,却不影响P38MAPK表达水平;磷酸化P38MAPK有表达于胞浆和胞核、仅表达于胞核的不同状态。SB203580可显著性地抑制由pAdEasyBMP9诱导的c3h10t1/2干细胞cX43、ctnt、α-Mhc、GAtA4、MEF2c表达。结论:pAdEasyBMP9诱导c3h10t1/2干细胞能激活P38MAPK通路,并促进其向心肌样细胞分化。

关键词：骨形态发生蛋白9 c3h10t1/2干细胞心肌样细胞 P38丝裂原活化蛋白激酶

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BMP5和BMP9对c3h10t1/2干细胞向心肌样细胞分化的影响

BMP5和BMP9对C3H10T1/2干细胞向心肌样细胞分化的影响

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作者：谭金童重庆医科大学

学位级别：硕士

第一部分ch10t干细胞的培养、诱导,293细胞的培养,AdBMP、AdBMP重组腺病毒的扩增目的:利用细胞诱导技术完成AdBMP、AdBMP重组腺病毒质粒对ch10t干细胞的诱导,并通过293细胞对AdBMP、AdBMP重组腺病毒质粒进行扩增,为进一步阐明在BMP、BM... 详细信息

第一部分ch10t干细胞的培养、诱导,293细胞的培养,AdBMP、AdBMP重组腺病毒的扩增目的:利用细胞诱导技术完成AdBMP、AdBMP重组腺病毒质粒对ch10t干细胞的诱导,并通过293细胞对AdBMP、AdBMP重组腺病毒质粒进行扩增,为进一步阐明在BMP、BMP在ch10t干细胞向心肌细胞分化过程中的影响奠定基础。方法:以293细胞为工具细胞,对AdBMP、AdBMP重组腺病毒质粒进行扩增;以浓度为2.67 ml/LAdBMP重组腺病毒感染ch10t干细胞,并浓度为3.75ml/LAdBMP重组腺病毒感染ch10t干细胞。结果:AdBMP、AdBMP重组腺病毒可被293细胞成功扩增;AdBMP、AdBMP重组腺病毒感染ch10t干细胞的感染效率分别为36%和34%。结论:通过293细胞对AdBMP、AdBMP重组腺病毒扩增,病毒滴度被提高;AdBMP、AdBMP重组腺病毒可成功感染ch10t干细胞。第二部分BMP和BMP对ch10t干细胞向心肌样细胞分化的影响目的:研究骨形态形成蛋白5(bone morphogenetic proteins 5,BMP)和BMP在ch10t干细胞向心肌细胞分化过程中的影响。方法:以浓度为3.75ml/L的AdBMP重组腺病毒质粒感染ch10t干细胞,并以浓度为2.67 ml/L的AdBMP重组腺病毒质粒感染ch10t干细胞,诱导后1周和2周应用Rt-PcR方法及激光共聚焦方法分别检测ch10t干细胞中心肌特异转录因子及特异性蛋白的表达变化。2周后应用电子显微镜观察细胞超微结构的改变。结果:ch10t干细胞经AdBMP、AdBMP重组腺病毒诱导1、2周后,细胞体积明显变大,排布走向趋于一致,细胞间连接紧密,折光性增强。细胞中开始出现心肌特异性转录因子NKx 2.5、GAtA-4、MEF2c及心肌特异性表达蛋白连接蛋白43(connexin43,cx43)和心肌特异性肌钙蛋白t(cardiac isoform of tropnin t, ctnt)的表达;2周后出现心肌特异性超微结构肌丝和闰盘。结论:BMP、BMP9很可能影响体外培养的ch10t干细胞定向分化为心肌样细胞。

关键词： BMP5 BMP 9 c3h10t1/2干细胞 293细胞 BMP9 分化心肌细胞

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BMP10和BMP13在c3h10t1/2干细胞向心肌样细胞分化过程中的作用

BMP10和BMP13在C3H10T1/2干细胞向心肌样细胞分化过程中的作用

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作者：韦皓重庆医科大学

学位级别：硕士

第一部分AdBMP10、AdBMP13及AdGFP的扩增以及ch10t干细胞的感染目的:利用hEK293细胞的扩增收集得到高滴度腺病毒,AdBMP10、AdBMP13以及AdGFP感染ch10t干细胞使之呈BMP10、BMP13高表达。方法:利用hEK293细胞反复扩增后收集得到高滴度... 详细信息

第一部分AdBMP10、AdBMP13及AdGFP的扩增以及ch10t干细胞的感染目的:利用hEK293细胞的扩增收集得到高滴度腺病毒,AdBMP10、AdBMP13以及AdGFP感染ch10t干细胞使之呈BMP10、BMP13高表达。方法:利用hEK293细胞反复扩增后收集得到高滴度腺病毒。显微镜下观察hEK293细胞融合密度至70%～80%时分别加入AdBMP10、AdBMP13以及AdGFP,24h后观察绿色荧光表达量。如此反复直至获得高滴度病毒。当ch10t干细胞生长融合密度至70%～80%时加入AdBMP10、AdBMP13以及AdGFP三种病毒感染干细胞并观察绿色荧光表达量。结果:AdBMP10、AdBMP13以及AdGFP经hEK293细胞反复扩增后得到了高滴度病毒。将三种病毒分别感染ch10t干细胞并得到了理想的感染率。结论:经过hEK293细胞的反复扩增可以得到高滴度AdBMP10、AdBMP13以及AdGFP,并且能够高效地感染ch10t干细胞,使干细胞内高表达BMP10、BMP13以及GFP。第二部分BMP10和BMP13在ch10t干细胞向心肌样细胞分化过程中的作用目的:研究骨形态形成蛋白10(Bone morphogenetic proteins 10,BMP)和骨形态形成蛋白13(Bone morphogenetic proteins 13)促进ch10t干细胞向心肌样细胞分化过程中的作用。方法:将ch10t干细胞简单随机分为4组:BMP10组、BMP13组、GFP对照组以及空白对照组。利用Western blot及免疫荧光技术于7、14、21、28天4个时间点分别检测4组细胞心肌特异性蛋白ctnt、cx43、β‐Mhc的表达变化;同时用qPcR技术检测心肌特异性基因GAtA4、MEF2c、β-Mhc的表达情况;28天时电镜及masson染色观察心肌特异性微结构。同时检测心肌特异性功能表达,利用全细胞膜片钳技术检测各组细胞细胞膜上外向性钾电流、内向性钾电流、以及t-型钙电流、少量的钠电流。结果: 1、在倒置显微镜下观察,复苏后细胞形态均一,呈类圆型。3～4小时后开始贴壁,随之细胞开始伸长,形态似三角型及梭形。诱导后细胞伸展,折光性增强,细胞向长梭形或三角型发展,细胞间连接较紧密且细胞排列趋向一致。 2、Western Blot及免疫荧光技术检测各组细胞心肌特异性蛋白ctnt、cx43、β‐ Mhc的表达。实验结果表明在21、28天时BMP10、BMP13组中已有ctnt、cx43、β‐ Mhc的表达,而在GFP对照组以及空白对照组细胞中7、14、21和28天均无心肌特异性蛋白ctnt、cx43、β‐ Mhc的表达。(pcR技术检测心肌特异性基因的表达。在7、14、21和28天4个时间点分别检测BMP10、BMP13、GFP及空白对照组细胞心肌特异性基因GAtA4、MEF2c以及β‐Mhc的表达情况。GAtA4、MEF2c和β‐Mhc在4组都有表达,但BMP10、BMP13组表达量皆高于空白对照组。(pch10t干细胞心肌特异性超微结构。28天时电镜检测BMP10、BMP13组出现了心肌肌丝样以及闰盘样结构,masson染色以上两组细胞出现了心肌肌丝样结构。而在GFP、空白对照组7、14、21和28天均不能发现有心肌肌丝样以及闰盘样结构。 5、全细胞膜片钳检测各实验组ch10t干细胞细胞膜电流表达情况。于7、14、21、28天4个时间点分别检测BMP10、BMP13、GFP、空白对照组细胞膜电流。发现BMP10、BMP13组中28天时可以检测到外向电流:超速激活延迟整流钾电流(I);内向电流:内向整流钾电流(I)、t型钙电流(I),并且在少量细胞中可以检测到少量钠电流的表达(I),而在GFP、空白对照组4个时间点都未能有任何电流表达。结论:BMP10和BMP13能促进ch10t干细胞向心肌细胞样分化。

关键词： hEK293细胞 c3h10t1/2干细胞 BMP10 BMP13 BMP10 BMP13 心肌样细胞

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BMP-13在c_3h10t_(1/2)干细胞向心肌样细胞分化过程中的作用

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第三军医大学学报 2011年第8期33卷 813-817页

作者：韦皓陈沅沈彪赵璐重庆医科大学附属儿童医院心血管内科儿童发育疾病研究省部共建教育部重点实验室重庆400014

目的研究骨形态形成蛋白-13(bone morphogenetic proteins-13,BMP-13)促骨髓间充质干细胞c3h10t1/2向心肌样细胞分化过程中的作用。方法骨髓间充质干细胞c3h10t1/2经pAdEasy-BMP-13重组腺病毒质粒感染后,利用Western blot以及免疫荧光... 详细信息

目的研究骨形态形成蛋白-13(bone morphogenetic proteins-13,BMP-13)促骨髓间充质干细胞c3h10t1/2向心肌样细胞分化过程中的作用。方法骨髓间充质干细胞c3h10t1/2经pAdEasy-BMP-13重组腺病毒质粒感染后,利用Western blot以及免疫荧光技术于1、2、3周时分别检测c3h10t1/2干细胞心肌特异性蛋白ctnt、cx43、α-Mhc、α-actin的表达变化;同时以实时荧光定量PcR技术进行心肌分化特异性基因GAtA4、MEF2c的检测,4周后应用电子显微镜观察干细胞超微结构变化。结果 c3h10t1/2干细胞经pAdEasy-BMP-13感染诱导后,细胞开始伸展,折光性增强,细胞间连接较紧密且细胞排列趋向一致;pAdEasy-BMP-13和pAdEasy-BMP-2感染后细胞于3周时,Western blot技术检测出心肌特异性肌钙蛋白(cardiac isoform of tropnin t,ctnt)、连接蛋白cx43(connexin 43,cx43)(Phc、α-actin表达,而于1周和2周时未检测出。同时pAdEasy-GFP感染后细胞和未感染组细胞1、2周和3周均未发现有心肌特异性蛋白ctnt、cx43、α-Mhc、α-actin的表达。3周对各组均出现心脏早期发育特异性基因GAtA4、MEF2c的表达,但pAdEasy-BMP-13和pAdEasy-BMP-2感染后细胞表达量明显高于pAdEasy-GFP感染后细胞和未感染组细胞(P细胞于4周时透射电镜下观察出现闰盘及肌丝样细胞超微结构,而pAdEasy-GFP感染后细胞和未感染组细胞没有出现类似结构。结论 pAdEasy-BMP-13可以诱导c3h10t1/2干细胞向心肌样细胞分化。

关键词： BMP-13 c3h10t1/2干细胞心肌细胞

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BMP_9对c_3h10t_(1/2)干细胞向心肌样细胞分化的影响

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重庆医科大学学报 2009年第6期34卷 672-676页

作者：谭金童陈沅向平重庆医科大学儿童医院心血管内科重庆400014

目的:研究骨形态形成蛋白9(Bone morphogenetic proteins9,BMP9)在c3h10t1/2干细胞向心肌细胞分化过程中的影响。方法:以高滴度(2.67ml/L)pAdEasy-BMP9重组腺病毒质粒转染c3h10t1/2干细胞,1周后应用Rt-PcR方法及激光共聚焦方法分别检测c3h10t1/2干细胞中心肌特异转录因子及特异性蛋白的表达变化。2周后应用电子显微镜观察细胞超微结构的改变。结果:c3h10t1/2干细胞经pAdEasy-BMP9重组腺病毒质粒诱导1周后,细胞体积明显变大,排布走向趋于一致,细胞间连接紧密,折光性增强;细胞中开始出现心肌特异性转录因子NKx2.5、GAtA-4、MEF2c及心肌特异性表达蛋白连接蛋白43(connex-in43,cx43)和心肌特异性肌钙蛋白t(cardiac isoform of tropnint,ctnt)的表达;出现心肌特异性超微结构肌丝和闰盘。结论:BMP9可影响体外培养的c3h10t1/2干细胞定向分化为心肌样细胞。

关键词： BMP9 c3h10t1/2干细胞分化心肌细胞

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