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TMEM16A的表达下调对骨骼肌细胞分化的影响

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南京师大学报（自然科学版） 2020年第3期43卷 106-111,135页

作者：袁文范春娥陈宇琛许艳华张茜茜孙志远陈华群南京师范大学生命科学学院江苏省分子医学生物技术重点实验室江苏南京210023

TMEM16A(Transmembrane Protein 16A)是一种钙离子(ca^2+)激活的氯离子通道(calcium-activated chloride channels,caccs),在机体内广泛表达,具有重要的生理功能.迄今为止,TMEM16A在骨骼肌发育中的作用及机制尚无报道.本研究利用TMEM16A特异性抑制剂T16A inh-A01首次探讨了其表达下调对骨骼肌细胞分化的影响.研究发现,T16A inh-A01处理显著抑制c2c12和原代成肌细胞的肌分化.进一步研究发现,T16A inh-A01明显抑制肌分化过程中生肌素Myogenin的表达.研究结果提示,TMEM16A的钙激活氯通道活性可能参与了骨骼肌细胞的分化过程,具体的作用机制有待进一步研究.

关键词： TMEM16A T16A inh -A01 c2c12 成肌细胞生肌素

3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶的抑制缓解肌肉萎缩及促进长寿的作用和机制

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3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶的抑制缓解肌肉萎缩及促进长寿的作用和...

作者：周晶南昌大学

学位级别：硕士

衰老是重大科学前沿问题,人口老龄化是重大社会问题。骨骼肌衰老及肌少症是导致老年衰弱的重要原因,研究包括肌少症在内的骨骼肌萎缩的作用、机制及干预措施有重要意义。支链氨基酸特别是亮氨酸在维持骨骼肌蛋白质合成降解平衡至关重要... 详细信息

衰老是重大科学前沿问题,人口老龄化是重大社会问题。骨骼肌衰老及肌少症是导致老年衰弱的重要原因,研究包括肌少症在内的骨骼肌萎缩的作用、机制及干预措施有重要意义。支链氨基酸特别是亮氨酸在维持骨骼肌蛋白质合成降解平衡至关重要,除了氨基酸本身其中间代谢产物(支链α酮酸)及侧支代谢产物3-羟基异戊酸(β-hydroxyβ-methylbutyrate,HMB)可以抑制包括肌少症在内的肌肉萎缩。3-甲基巴豆酰辅酶A羧化酶(3-methylcrotonyl-coA carboxylase,Mccc)是支链氨基酸降解的关键酶,但是和骨骼肌萎缩的关系不清楚。因此从细胞、人群、整体动物水平研究Mccc对肌肉萎缩和健康长寿的关系,结果如下:1.为研究人在饥饿和营养不良的环境下BcAAs代谢途径的过程变化,我们构建了三种肌萎缩模型,经过肌管直径测量和相关蛋白表达水平的检测,成功构建饥饿诱导肌萎缩模型、地塞米松诱导肌萎缩模型、炎症因子诱导肌萎缩模型,并通过敲低Mccc的羧基转移催化亚基编码基因Mccc2后,通过免疫荧光实验得到肌萎缩模型的肌管直径显著增加的关键结果,发现其可以缓解三种肌萎缩模型。2.通过蛋白免疫印迹发现其通过促进饥饿诱导肌萎缩的肌球蛋白合成和降低降解来调节。经过HPLc检测BcAAs的水平,发现敲低后Val的含量水平升高显著,Ile和Leu的含量由于降解过程有很多相同途径,检测后发现也有协同升高。表明Mccc2的敲低可以升高BcAAs的水平。3.经过线粒体能量代谢检测发现敲低Mccc2降低了c2c12细胞的线粒体的基础呼吸和最大呼吸,显著影响了c2c12细胞的能量代谢途径。4.从我国健康长寿人群全外显子组测序结果中发现一个在百岁老人特有的Mccc2编码区携带的突变rs1160173664,导致p.K382X突变。通过构建载体体外进行酶活测定,发现其酶活丧失,并且Mccc2编码区的百岁老人特异遗传变异也在美国犹太百岁老人人群和意大利长寿人群发现,提示Mccc2突变对长寿的影响可能具有普适性。5.酶活测定不能确定百岁老人的基因突变的具体影响,且肌少症预防中Mccc2对其有一定的抑制作用,并且其在长寿人群中有相对应的遗传突变,那么这其中是否有因果关系呢?我们在模式动物线虫上寻找到同源基因F02A9.10进行验证,发现敲低F02A9.10后可以显著延长线虫寿命。同样的肌少症引发的一个重要因素是营养不良,因此我们建立了线虫饥饿寿命试验,发现线虫在极度营养不良的饲养条件下可以耐受饥饿,生存时间延长。并且在热应激实验中,敲低F02A9.10实验组也可对高温刺激具有保护作用。综合上述,本研究首先在细胞水平通过c2c12细胞构建了三种肌萎缩模型,以饥饿模型为主,发现Mccc2活性或者表达降低导致BcAA上升,降低蛋白质分解代谢,抵抗肌肉萎缩,在人群中可能有类似机制促进健康长寿,并用线虫为模型验证成功,寿命明显增加。未来在小鼠及非人灵长类动物模型验证Mccc2抑制在抵抗肌肉萎缩及虚弱以及延长寿命的功能,并研究其机制,对于开发新型的促进老年健康的干预方法具有重要意义。

关键词：衰老肌萎缩 c2c12 Mccc2 饥饿

牛miR-499对成肌细胞增殖分化的影响及其作用机制研究

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牛miR-499对成肌细胞增殖分化的影响及其作用机制研究

作者：兀继尧江苏师范大学

学位级别：硕士

microRNAs(miRNAs或miRs)是一类长约22nt～25nt且在物种间及进化中保守性较高的一类内源性的单链非编码RNA,根据前期研究者们的研究证实它是哺乳动物骨骼肌发育过程中的关键调控因子,同时microRNAs也是目前生命科学领域研究的最为普遍... 详细信息

microRNAs(miRNAs或miRs)是一类长约22nt～25nt且在物种间及进化中保守性较高的一类内源性的单链非编码RNA,根据前期研究者们的研究证实它是哺乳动物骨骼肌发育过程中的关键调控因子,同时microRNAs也是目前生命科学领域研究的最为普遍和深入的一类非编码RNA。本研究依据本实验室前期秦川牛骨骼肌microRNAs转录组测序的结果,对筛选出的microRNA依据时空差异表达显著的原则进行初步筛选,通过采用Quantitative Real-time PcR(q RT-PcR)技术获取秦川牛在不同发育时期(胎牛期、成年期),不同组织(心脏、肝脏、脾脏、肺、肾脏、瘤胃、小肠、腿肌)的microRNAs表达谱,通过对实验结果的处理分析以及查阅相关文献资料,最终选择在肌肉中特异性表达的miR-499为研究对象,探究其对成肌细胞增殖和分化的影响。此外,本文还对靶基因TGFβR1参与TGF-β信号传导通路在骨骼肌中发挥的调控作用机制进行了探讨。取得的主要结果如下:(1)相关序列保守性分析显示成熟miR-499以及其靶基因TGFβR1 3’UTR上的microRNA结合位点在人、小鼠、羊、牛、猪等不同物种间具有高度保守性,利用q RT-PcR技术揭示并分析了miR-499在秦川牛的两个发育时期以及每个发育时期的不同组织表达谱,经研究发现miR-499是肌肉特异性表达miRNAs之一,在秦川牛两个发育时期的腿肌组织和心脏组织中表达,而其余组织几乎不表达。miR-499在成年牛时期腿肌中的表达量显著低于胎牛时期腿肌组织中的表达量(P2)成功构建了miR-499的前体(miR-499高效过表达载体)。将构建成功的高效过表达载体转染至人肾上皮细胞系(HEK293T)中,实验结果发现经过转染高效过表达载体的细胞中miR-499表达量高于转染进空载体细胞中miR-499的表达量,并且呈极显著差异(Pcontrol(Nc),miR-499 mimics,anti-negative control(anti-Nc),miR-499 inhibitors或pcDNA3.1(+)-miR-499转染至c2c12细胞,使miR-499过表达或抑制表达。利用q RT-PcR、Western blot技术、cell counting Kit-8(ccK-8)试剂盒以及5-乙炔基-2′脱氧尿嘧啶核苷(Ed U)细胞增殖检测试剂共同验证过表达或抑制miR-499对c2c12细胞增殖和分化的影响。实验结果表明miR-499促进c2c12细胞的增殖并且抑制c2c12细胞的分化。(3)通过Target Scan、DAVID数据库预测了miR-499的靶基因:TGFβR1、FGF2、MAPK6、MYH10、FOXO4和SIX1。利用psi cHEcK-2载体成功构建了预测靶基因野生型和突变型双荧光素酶报告基因载体,将其同时与合成的miR-499mimics共转染HEK293T细胞,利用酶标仪检测并用生物统计学方法分析双荧光素酶活性的变化。同对照组相比,发现野生型TGFβR1基因重组载体的荧光素酶活性极显著降低(PcR和Western blot技术检测过表达或抑制miR-499对TGFβR1表达量的影响,3个实验结果共同验证了TGFβR1是miR-499的靶基因。(4)合成miR-499靶基因TGFβR1的siRNA,将si-Nc、siRNA转染至c2c12细胞中,对TGFβR1基因进行转录后水平的沉默。实验结果表明miR-499的靶基因TGFβR1能够抑制成肌细胞c2c12的增殖,促进c2c12细胞分化。

关键词：秦川牛 miR-499 c2c12 TGFβR1 成肌细胞增殖分化

关岭牛MyoDⅠ基因启动子报告质粒的构建及活性验证

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基因组学与应用生物学 2013年第4期32卷 459-466页

作者：李飞许厚强陈伟陈祥刘敏桓聪聪贵州大学生命科学学院贵阳550025 高原山地动物遗传育种与繁殖省部共建教育部重点实验室贵州大学动物科学学院贵阳550025

为了克隆关岭牛MyoDⅠ基因启动子并验证其启动活性,根据GenBank中牛的MyoDⅠ基因序列设计PcR引物,用PcR技术扩增牛MyoDⅠ基因的启动子,构建重组克隆载体pUcmT-MyoDⅠ;并通过PcR扩增、限制性酶切、测序及生物信息学分析对阳性克隆进行鉴... 详细信息

为了克隆关岭牛MyoDⅠ基因启动子并验证其启动活性,根据GenBank中牛的MyoDⅠ基因序列设计PcR引物,用PcR技术扩增牛MyoDⅠ基因的启动子,构建重组克隆载体pUcmT-MyoDⅠ;并通过PcR扩增、限制性酶切、测序及生物信息学分析对阳性克隆进行鉴定;构建报告质粒pGL3-MyoDⅠ,并将其转染小鼠c2c12、3T3-L1细胞系,检测其24h后的双荧光素酶活性。实验结果获得了关岭牛MyoDⅠ基因启动子,其序列长度为993bp,并成功构建了MyoDⅠ启动子报告质粒;双荧光素酶活性检测表明pGL3-MyoDⅠ在小鼠c2c12细胞中的表达是pGL3空载体40.65倍,在小鼠3T3-L1细胞中的表达是空载体的1.13倍,MyoDⅠ启动子在小鼠c2c12细胞中的表达高于3T3-L1细胞(**p<0.01)。结果表明关岭牛MyoDⅠ基因启动子具有启动活性,在小鼠骨骼肌细胞中特异性表达。

关键词： MyoDⅠ基因启动子荧光素酶 c2c12 3T3-L1

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siRNA介导的MKK4表达抑制研究

生物技术通报 2009年第4期25卷 86-90页

作者：黄志清陈小玲陈代文四川农业大学动物营养研究所雅安625014

采用脂质体转染方法,将3对(siRNA ID#64447、siRNA ID#64539和siRNA ID#186583)人工合成的MKK4基因特异的小分子干扰RNA(siRNA)分别导入小鼠成肌细胞c2c12中。实时荧光定量PcR结果表明,转染了siRNA ID#64447的细胞,其MKK4 mRNA的表达水... 详细信息

关键词： MKK4基因 siRNA c2c12 实际荧光定量PcR

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地塞米松体外诱导胰岛素抵抗细胞模型的建立

科技通报 2015年第10期31卷 31-33页

作者：谢洁杨瑞仪广州中医药大学热带医学研究所广州510405

目的:探讨在体外建立方便可靠的肝胰岛素抵抗细胞模型、脂肪细胞胰岛素抵抗模型和肌细胞胰岛素抵抗模型的方法。方法:3T3-L1小鼠前脂肪细胞、c2c12小鼠成肌细胞分别诱导分化为成熟的脂肪细胞和肌细胞。采用地塞米松(EDX)诱导人肝细胞Hep... 详细信息

目的:探讨在体外建立方便可靠的肝胰岛素抵抗细胞模型、脂肪细胞胰岛素抵抗模型和肌细胞胰岛素抵抗模型的方法。方法:3T3-L1小鼠前脂肪细胞、c2c12小鼠成肌细胞分别诱导分化为成熟的脂肪细胞和肌细胞。采用地塞米松(EDX)诱导人肝细胞Hep G2以及分化成熟的Hep G2、c2c12细胞,以葡萄糖氧化酶法检测细胞对葡萄糖的消耗情况。结果:1μmol/L DEX作用24 h和48 h均能抑制细胞葡萄糖消耗,撤掉DEX,胰岛素抵抗细胞模型在48 h内维持稳定。对于Hep G2和c2c12细胞,DEX造模48 h优于24 h;但对于3T3-L1细胞,DEX造模24 h和48 h对细胞葡萄糖消耗影响无显著性差异。结论:DEX可诱导3T3-L1、Hep G2、c2c12细胞产生胰岛素抵抗,这种细胞模型简便稳定。

关键词：地塞米松胰岛素抵抗 HepG2 3T3-L1 c2c12

猪F-box基因家族部分基因的分子特征、SNP检测与性状关联分析暨FBXO40基因的功能初探

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猪F-box基因家族部分基因的分子特征、SNP检测与性状关联分析暨FB...

作者：王志伟华中农业大学

学位级别：硕士

第一部分猪F-box基因家族部分基因的分子特征、SNP检测与性状关联分析从早期追求猪生产性能的提高到现在生产性能与免疫抗性并重,人们已经认识到单纯的提高猪的生产性能会导致抗性降低。一般来说,动物的免疫力决定了动物的健康状况,它... 详细信息

第一部分猪F-box基因家族部分基因的分子特征、SNP检测与性状关联分析从早期追求猪生产性能的提高到现在生产性能与免疫抗性并重,人们已经认识到单纯的提高猪的生产性能会导致抗性降低。一般来说,动物的免疫力决定了动物的健康状况,它与动物的生产性能是密切相关的。这就使得研究者们相继提出了在分子水平揭示疾病发生的原因,并利用现代生物技术从遗传本质上提高动物对病原的抗性,增强动物自身的抵抗力。 E3泛素连接酶F-box基因家族参与众多的生物学过程,包括信号转导、细胞周期、细胞凋亡、转录激活和MHcⅠ类抗原提呈等(Bai et al,1996;craig and Tyers,1999),与肿瘤的发生和机体免疫密切相关,已逐渐成为一个新研究热点。本研究采用生物信息学、群体遗传学和分子生物学等相结合的方法,对E3泛素连接酶F-box基因家族中3个基因进行了深入的研究,取得了如下结果: 1)利用猪EST数据库的信息,分离了猪E3泛素连接酶F-box基因家族中FBXO5和FBXO7基因的完整的编码区(coding sequence,cDS)和部分基因组序列,并进行了蛋白质序列的推导和基因组结构的初步分析,所有的内含子和外显子的拼接位点都符合“GT-AG”规则;分离了猪FBXO40基因的大部分cDNA序列。 2)利用IMpRH(The INRA-University of Minnesota porcine radiation hybrid panel)克隆板,对猪FBXO40基因进行了染色体定位,将其定位于SSc13q4.1-4.6,与微卫星S0075和SW1876连锁,连锁的LOD值分别为12.99和7.12。 3)采用clustalW2程序分析了FBXO5、FBXO7两个基因编码氨基酸序列的保守性及FBXO40基因F-box结构域氨基酸序列的保守性,并根据氨基酸序列信息构建了不同物种间的进化树,进行了序列的分子进化分析。 4)采用半定量PcR的方法分析了猪FBXO5,FBXO7和FBXO40三个基因在成年五指山猪心脏、骨骼肌、淋巴、脾脏和胸腺等组织中的表达情况。FBXO5、FBXO7和FBXO40基因分别在胸腺、甲状腺和骨骼肌中高表达。 5)采用半定量PcR的方法分别检测了猪FBXO5,FBXO7和FBXO40三个基因在正常肾脏组织和癌化的PK15细胞中的表达变化。猪FBXO5基因仅在正常肾脏组织中可检测到表达,猪FBXO40基因仅在PK15细胞中检测到表达,猪FBXO7基因在二者之间基本无差异。 6)对上述3个基因进行了SNPs检测,发现如下5个可用PcR-RELP检测的多态位点:FBXO5基因第三内含子第160位碱基的PstⅠ-RFLP(T/c)和第四内含子第56位碱基的TaqⅠ-RFLP(A/G);FBXO7基因第三内含子第71位碱基的XbaⅠ-RFLP(T/c)和第七外显子第113位碱基的NruⅠ-RFLP(T/c);FBXO40基因第四外显子第299位碱基的HindⅡ(HincⅡ)-RFLP(A/c)。 7)对上述5个SNPs用PcR-RFLP方法在五指山、巴马、莱芜、贵州、通城、大白猪和长白猪中进行群体遗传学分析,结果表明,所有基因座的基因型频率在不同的品种中存在较大差异。 8)在我室与温氏集团合作的温氏群体中,对上述SNPs(除XbaⅠ-RFLP位点)与部分免疫相关性状(如:白细胞数、红细胞数和血红蛋白浓度、猪瘟抗体阻断率和血小板分布宽度等)进行了初步关联分析,结果发现,FBXO5基因pstⅠ-RFLP(T/c)和TaqⅠ-RFLP(A/G)两个位点FBXO5基因pstⅠ(T/c)和TaqⅠ(A/G)两个位点不同基因型的个体都与部分红细胞指标和血小板分布宽度显著相关;FBXO7基因NruⅠ-RFLP(T/c)多态与32日龄时白细胞数(P＜0.05)和猪瘟抗体阻断率(P＜0.05)在不同基因型的个体间差异显著;FBXO40基因HindⅡ-RFLP(A/c)不同基因型个体在17日龄时白细胞数(P＜0.01)和淋巴细胞绝对值(P＜0.01)差异极显著。 9)在我室与湖北省通城县畜牧局合作组建的通城群体中,对上述SNPs(除NruⅠ-RFLP位点)与部分生产性状(如:初生至上市平均日增重、达90kg(75kg)日龄、屠宰率、肌肉颜色和肌肉pH值等)和部分免疫相关性状(如:白细胞数、红细胞数和血红蛋白浓度等)进行了初步关联分析,结果显示,FBXO40基因HindⅡ(HincⅡ)-RFLP(A/c)位点,血红蛋白浓度(P＜0.01)、平均血细胞血红蛋白浓度(P＜0.01)、肌肉颜色评分(P＜0.05)和达90kg(75kg)日龄(P＜0.05)在三种基因型个体间存在极显著差异。第二部分FBXO40基因的功能初探肌萎缩是临床上较为常见的

关键词：猪泛素-蛋白酶体 E3泛素连接酶 F-box基因家族半定量PcR SNPs 关联分析肌萎缩 FBXO40 c2c12 亚细胞定位超表达反转录PcR

β-酷啡肽-5对糖尿病大鼠血糖和氧化应激的影响

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β-酷啡肽-5对糖尿病大鼠血糖和氧化应激的影响

作者：范英兰南京农业大学

学位级别：硕士

本文对β-酪啡肽-5(β-casomorphin-5,β-cM5)对糖尿病大鼠降糖作用及其氧化应激的影响进行了初步探讨。研究包括以下三个部分：试验一β-cM5对-大鼠肠道葡萄糖吸收的抑制及其机制为了探讨β-cM5对大鼠小肠葡萄糖吸收的影响。研究利用... 详细信息

本文对β-酪啡肽-5(β-casomorphin-5,β-cM5)对糖尿病大鼠降糖作用及其氧化应激的影响进行了初步探讨。研究包括以下三个部分：试验一β-cM5对-大鼠肠道葡萄糖吸收的抑制及其机制为了探讨β-cM5对大鼠小肠葡萄糖吸收的影响。研究利用翻转的离体小肠模型,通过测定60min内不同浓度p-cM5各试验组肠囊内葡萄糖含量及葡萄糖的转运率;测定离体肠道黏膜α-葡萄糖苷酶、Na+-K+-ATP酶活力,以及对小肠葡萄糖转运载体SGLT-1及GLUT-2 mRNA表达水平的分析,揭示p-cM5对葡萄糖吸收影响及机制。结果显示：(1)不同浓度β-cM5肠囊内葡萄糖的转运量及转运率均显著低于对照组;(2)β-cM5组小肠黏膜中α-葡萄糖苷酶活力显著低于对照组;(3)β-cM5组小肠黏膜中SGLT-1、GLUT-2 mRNA表达量与对照组相比均显著性下调,且与对照组相比p-cM5明显抑制Na+-K+-ATP酶活力。结论：p-cM5可以通过抑制葡萄糖吸收的相关酶活及下调葡萄糖转运载体的mRNA表达,从而抑制肠道葡萄糖的吸收。提示：p-cM5可能具有降糖作用。试验二β-cM5对糖尿病大鼠血糖和抗氧化作用的影响为了探讨灌胃β-cM5对链脲佐菌素(STZ)诱导的糖尿病(DM)大鼠血糖和抗氧化能力的影响。研究选用SD雄性大鼠60只,随机取50只用来制造糖尿病大鼠模型,另10只作为正常对照组。糖尿病模型组大鼠按60mg/kg一次性腹腔注射链脲佐菌素(STZ)溶液(给药前大鼠禁食过夜),正常对照组大鼠按同样方法腹腔注射等体积生理盐水(NS)。分别于注射STZ后72h剪尾取血,血糖仪测定所有大鼠的空腹(禁食8h)血糖水平。以空腹条件下血糖值≥11.1 mmol/L为高血糖造模成功。取造模成功大鼠40只,随机分为高剂量(H)组(7.5×10-Smo1/Lβ-cM5)、中剂量(M)组(7.5×10-6mo1/Lβ-cM5)和低剂量(L)组(7.5×10-7mmo1/Lβ-cM5),每12h灌胃β-cM5溶液1mL,糖尿病模型对照(DM)组和正常对照(cON)组大鼠按等体积生理盐水灌胃。每天观察大鼠饮水、采食量等,每5天测空腹血糖1次。连续灌胃25d后,断颈处死,取血清、肝脏及肌肉等进行如下试验：1)血糖含量的测定;2)肝、肌糖原及血清中胰岛素及胰高血糖素含量的测定;3)血清中丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的测定。结果发现：1)β-cM5能显著改善糖尿病大鼠多饮、多食等状况;2)连续灌喂β-cM5大鼠血糖浓度均有降低,灌胃20d后大鼠血糖水平明显低于DM组大鼠;3)与DM组相比,β-cM5各剂量组大鼠的肝糖原和肌糖原含量均有升高;血清胰岛素、胰高血糖素水平无明显差异;4)连续灌喂p-cM5能显著提高大鼠SOD酶及GSH-Px酶活性,降低MDA含量。结论：p-cM5有一定的辅助降血糖功效,连续灌胃能降低糖尿病大鼠血糖水平,提高肝糖原、肌糖原含量,增强机体抗氧化应激能力。试验三β-cM5抗氧化损伤作用的细胞学研究c2c12细胞是体外研究氧化应激损伤的最常用细胞模型,我们上一章的结果显示,p-cM5可以提高糖尿病大鼠抗氧化损伤的能力,本试验我们通过建立过氧化氢(H202)对c2c12肌细胞的氧化损伤模型,探讨p-cM5对H202诱导的c2c12肌细胞氧化损伤的保护作用及其可能机制。方法：1)MTT法测定72h内p-cM5对c2c12细胞活力的影响,筛选作用于肌细胞的安全剂量;2)MTT法测定不同浓度H202对c2c12细胞活力的影响,筛选作用于肌细胞的H202的最佳剂量与作用时间;3)MTT法测定β-cM5对H202损伤细胞后的细胞活力的影响;4)检测培养液中超氧化物歧化酶SOD、乳酸脱氢酶LDH的活性。结果显示：1)p-cM5各浓度组MTT值与对照组相比并无差异;2)0.25 mmol/L的H202作用于c2c12肌细胞1 h后,MTT值便显著低于对照组(0.31±0.01,PcM5预保护组的MTT值显著高于损伤组(0.53±0.01,PcM5治疗组的MTT值与损伤组相比无显著差异(0.71±0.01,p>0.05);4)与损伤组相比,p-cM5保护组的SOD活性均显著提高(10.18±0.35,PcM5对H202损伤后的肌细胞有预保护作用,其机制可能与增强抗氧化酶活性,维持细胞完整性有关,但详细机理有待进一步研究。

关键词： β-cM5 血糖糖尿病葡萄糖转运氧化应激 c2c12

成肌细胞合成IL-6的抗炎/促炎效应切换中PGc-1α-NF-κB交互机制研究

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成肌细胞合成IL-6的抗炎/促炎效应切换中PGC-1α-NF-κB交互机制...

作者：王鑫天津体育学院

学位级别：硕士

研究目的:IL-6是第一个公认的肌肉因子,可由收缩的骨骼肌释放入血,介导有益效应。但大量文献报道IL-6发挥促炎作用往往与NF-κB有关。ROS是线粒体质量控制过程中不可避免的产物,高水平ROS造成氧化应激,而低水平ROS则发挥信号分子的作用... 详细信息

研究目的:IL-6是第一个公认的肌肉因子,可由收缩的骨骼肌释放入血,介导有益效应。但大量文献报道IL-6发挥促炎作用往往与NF-κB有关。ROS是线粒体质量控制过程中不可避免的产物,高水平ROS造成氧化应激,而低水平ROS则发挥信号分子的作用。由于PGc-1α和NF-κB是氧化还原敏感因子,除ROS外,两者之间也相互影响。推测不同水平ROS可能通过调控PGc-1α-NF-κB两者的交互拮抗作用影响IL-6的双重效应。本研究以c2c12细胞为研究对象,采用两种HO浓度干预c2c12细胞,模拟机体运动/氧化应激状态下ROS水平,进而观察PGc-1α-NF-κB两者的交互拮抗作用是否与IL-6的双重效应有关,探讨不同水平ROS、PGc-1α-NF-κB交互拮抗作用及IL-6双重效应间的关系。研究方法:本研究实验对象为c2c12细胞,研究共分3部分:第一部分摸索药物浓度,分组为:对照组(c)、低浓度过氧化氢孵育组(LcH);对照组(c)、高浓度过氧化氢孵育组(HcH)。LcH组和HcH组分别设不同药物浓度梯度干预c2c12成肌细胞,用DcFH-DA探针法检测ROS生成水平;用Jc-1探针法检测线粒体膜电位ΔΨ,以反映线粒体功能;采用ccK-8试剂盒检测c2c12细胞活性,反映细胞增殖与细胞毒性水平。第二部分验证ATF5-siRNA是否通过影响PGc-1α-NF-κB交互拮抗作用降低抗炎因子表达,分组为对照组(c)、低浓度过氧化氢孵育组(LcH)、低浓度过氧化氢孵育+ATF5-siRNA组(L+S)。第三部分验证过表达ATF5是否通过影响PGc-1α-NF-κB交互拮抗作用降低促炎因子的表达,分组为高浓度过氧化氢孵育组(HcH)、高浓度过氧化氢孵育+ATF5过表达组(H+OE)。经Western-blotting实验方法检测线粒体UPRmt通路ATF5、cLPP、HSP60;PGc-1α、Nrf-2、NF-κB;炎症因子IL-1β、IL-10、IL-6的蛋白表达水平。研究结果:(1)HO调节c2c12细胞ROS、膜电位水平低浓度组采用不同浓度的HO(0μmol/L、1μmol/L、5μmol/L、10μmol/L、20μmol/L、40μmol/L、50μmol/L)孵育c2c12细胞,干预时间为15min。与c组相比,LcH组ROS显著升高(pc2c12细胞,干预时间为1h。与c组相比,HcH组ROS水平显著升高(pc-1α-NF-κB交互拮抗作用降低抗炎因子表达与对照组(c)相比,低浓度HO组(LcH)中PGc-1α、Nrf-2蛋白表达显著升高(pc-1α、IL-10蛋白表达显著下降(pc-1α-NF-κB交互拮抗作用降低促炎因子的表达与对照组(c)相比,高浓度HO组(HcH)中PGc-1α、IL-10蛋白表达显著降低(pcH)相比,ATF5过表达+高浓度HO干预组中(H+OE)PGc-1α、Nrf-2、IL-10蛋白表达显著升高(pc-1α、抑制NF-κB来增加IL-6及其协同因子IL-10的表达,介导IL-6的抗炎效应。2.高水平ROS通过激活NF-κB、抑制PGc-1α来增加IL-6及其协同因子IL-1β的表达,介导IL-6的促炎效应。

关键词： ROS c2c12 IL-6 PGc-1α NF-κB