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沙棘籽黄酮提取物及其主要活性成分改善c2c12肌细胞胰岛素抵抗的作用及机制研究

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沙棘籽黄酮提取物及其主要活性成分改善C2C12肌细胞胰岛素抵抗的...

作者：谢晓敏华东师范大学

学位级别：硕士

沙棘作为一种药食同源植物,广泛应用于食品、医药等国民经济的诸多领域。其中沙棘籽油因具有抗炎、抗氧化、护肝、降血脂等生物活性被大量榨取开发。为了使沙棘资源得到更加充分的利用,本实验室将榨油后的沙棘籽渣废弃物进行黄酮富集提... 详细信息

沙棘作为一种药食同源植物,广泛应用于食品、医药等国民经济的诸多领域。其中沙棘籽油因具有抗炎、抗氧化、护肝、降血脂等生物活性被大量榨取开发。为了使沙棘资源得到更加充分的利用,本实验室将榨油后的沙棘籽渣废弃物进行黄酮富集提取,得到沙棘籽黄酮提取物（Flavonoids-enriched extract from seed of Hippophae rhamnoides L.,FSH）,并基于已有平台研究其对糖代谢的调节作用。前期研究发现:FSH能降低高脂饲喂小鼠、实验性2型糖尿病大鼠、db/db小鼠等多种模型动物的血糖水平,并能够明显改善机体胰岛素抵抗。然而其具体作用机制以及活性物质基础尚未被阐明。在此基础上,本文以c2c12骨骼肌细胞为研究平台,对FSH干预胰岛素抵抗的分子机制、调控靶点及其主要活性成分作进一步探究,为加工副产物的高值化利用提供理论依据。首先,本文以0.5 mM棕榈酸钠诱导c2c12肌细胞24 h建立体外胰岛素抵抗模型,通过Western blotting技术对各处理组胰岛素信号通路中的关键蛋白进行检测。发现棕榈酸钠刺激下,胰岛素介导的AKT丝氨酸473位点的磷酸化水平显著下降,同时IRS1丝氨酸307位点的磷酸化水平显著上升,导致胰岛素信号通路受损。而FSH干预可显著改善棕榈酸钠诱导的c2c12肌细胞胰岛素抵抗。主要表现为FSH显著促进胰岛素介导下细胞的葡萄糖摄取,并且能够降低IRS1丝氨酸307位点的磷酸化水平,提高AKT丝氨酸473位点的磷酸化水平,改善胰岛素信号通路障碍。此外FSH能够激活AMPK,降低棕榈酸钠诱导的c2c12肌细胞内质网应激相关蛋白Bip、IRE1和JNK的表达或活化,改善内质网应激。在此基础上,采用si-RNA基因干扰技术对AMPK进行沉默之后,FSH对内质网应激和胰岛素抵抗的改善作用均被削弱。由此证明,FSH可通过靶向于AMPK改善棕榈酸钠诱导的c2c12肌细胞内质网应激和胰岛素抵抗。随后,为了明确沙棘籽黄酮发挥胰岛素抵抗改善作用的活性物质基础,筛选质量标志物,本文通过UPLc-MS/MS技术对其进行植物多酚代谢组检测,结合相对含量、文献查询和网络药理学的分析预测其主要功效成分,并从活性评价和作用机制两方面进行实验验证。研究发现,没食子儿茶素、槲皮素和咖啡酸均能激活AMPK,逆转棕榈酸钠刺激下胰岛素介导的AKT磷酸化水平的降低,改善胰岛素信号通路障碍,增强胰岛素敏感性;综合对活性强弱、剂量依赖性和实验结果稳定性的考虑,本文以没食子儿茶素为例,对其改善胰岛素抵抗的机制进行研究。发现在采用si-RNA基因干扰技术对AMPK进行沉默后,没食子儿茶素对胰岛素抵抗的改善作用也被削弱。由此证明,没食子儿茶素能通过靶向于AMPK改善棕榈酸钠诱导的c2c12肌细胞胰岛素抵抗。综上所述,沙棘籽黄酮提取物可通过靶向于AMPK改善棕榈酸钠诱导的c2c12肌细胞内质网应激和胰岛素抵抗;没食子儿茶素、槲皮素以及咖啡酸是其主要的活性单体组分,可作为其潜在的质量标志物。本研究为FSH成为活性明确、作用靶点清晰以及活性物质基础清楚的活性提取物提供了实验依据,为沙棘活性提取物潜在药用价值的挖掘奠定了理论基础,也为沙棘资源的深度利用提供了应用依据。

关键词：沙棘籽黄酮提取物 c2c12肌细胞胰岛素抵抗内质网应激 AMPK

余甘子果实水提物促进c2c12肌细胞葡萄糖摄取以及改善棕榈酸引发的胰岛素抵抗的作用研究

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余甘子果实水提物促进C2C12肌细胞葡萄糖摄取以及改善棕榈酸引发...

作者：李海燕华东师范大学

学位级别：硕士

余甘子果实作为一种药食同源的天然传统中药材,具有丰富的营养价值和药理活性。活性研究显示,余甘子果实不同提取物能降低糖尿病鼠的血糖水平,但其物质基础和作用机制均不明确。本研究聚焦于促进葡萄糖利用、改善糖代谢紊乱的活性,从上... 详细信息

余甘子果实作为一种药食同源的天然传统中药材,具有丰富的营养价值和药理活性。活性研究显示,余甘子果实不同提取物能降低糖尿病鼠的血糖水平,但其物质基础和作用机制均不明确。本研究聚焦于促进葡萄糖利用、改善糖代谢紊乱的活性,从上述提取物中筛选出促进葡萄糖利用活性较强的提取物,分析其物质基础,并基于c2c12肌细胞模型系统研究其促进葡萄糖摄取和改善棕榈酸诱导的胰岛素抵抗的作用及机理,旨在挖掘余甘子的活性,为余甘子资源的充分利用提供理论依据。骨骼肌是机体利用葡萄糖最主要的组织,也是机体维持糖代谢稳态的重要胰岛素靶组织,因此本研究首先基于c2c12肌细胞模型筛选出促进葡萄糖利用活性较强的余甘子果实水提物（Water Extract of Phyllanthus Emblica ***,WEPE）,采用Lc-MS/MS技术分析其组成成分及含量,明确WEPE的物质基础。紧接着,为进一步探究WEPE促进葡萄糖利用活性的作用及机制,采用葡萄糖氧化酶法、2-NBDG法评价其对肌细胞葡萄糖消耗和摄取的作用,通过Western Blotting、蛋白靶点抑制剂、RNA干扰技术对其作用机制进行探究。实验结果显示,基础状态下,WEPE能够增加c2c12肌细胞对葡萄糖的消耗和摄取、促进GLUT4膜转位及AMPK-AS160/p38 MAPK通路蛋白磷酸化,但这些促进作用被AMPK抑制剂compound c所逆转,同时,用siRNA技术干扰AMPK基因的表达后,WEPE对细胞葡萄糖摄取的增加作用被逆转。使用caMKKβ抑制剂STO-609对细胞预处理后再加入WEPE处理,结果显示WEPE对AMPK通路蛋白磷酸化、葡萄糖摄取和GLUT4膜转位的促进作用被削弱。综合以上结果,基础状态下,WEPE通过caMKKβ激活AMPK信号通路,促进GLUT4转位,从而提高c2c12肌细胞对葡萄糖的摄取水平。棕榈酸可抑制c2c12肌细胞胰岛素信号通路的转导并削弱胰岛素介导的葡萄糖摄取,诱发胰岛素抵抗。WEPE可显著改善棕榈酸诱发的细胞胰岛素抵抗,主要表现为提高胰岛素介导的葡萄糖摄取及AKT磷酸化。通过检测AMPK信号通路和内质网应激中关键蛋白的表达水平,并采用相关蛋白靶点抑制剂进一步探究WEPE的作用机制。结果显示,WEPE一方面激活AMPK信号通路,促进Acc的磷酸化,从而增强脂肪的β氧化,同时增强AS160的磷酸化水平,促进GLUT4膜转位,增加细胞对葡萄糖的摄取;一方面抑制PKcθ的表达,削弱PKcθ对AKT磷酸化的抑制作用,提高细胞的胰岛素敏感性;第三,WEPE下调细胞中Bip、cHOP、eIF2α、IRE1α的表达水平,缓解内质网应激,从而改善棕榈酸对细胞葡萄糖摄取的削弱作用。综上所述,WEPE通过caMKKβ-AMPK-AS160/p38 MAPK途径促进c2c12肌细胞葡萄糖摄取,且在棕榈酸所诱导的胰岛素抵抗肌细胞中,WEPE通过激活AMPK-AS160通路和缓解内质网应激,从而改善胰岛素抵抗。

关键词：余甘子果实水提物 c2c12肌细胞葡萄糖摄取胰岛素抵抗

泽泻醇A-24-乙酸酯促进c2c12肌细胞葡萄糖摄取并改善肌细胞胰岛素抵抗的作用及机制研究

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泽泻醇A-24-乙酸酯促进C2C12肌细胞葡萄糖摄取并改善肌细胞胰岛素...

作者：陈嘉翔华东师范大学

学位级别：硕士

泽泻是我国栽培历史悠久的传统常用中药材,在现代药理研究中发现泽泻具有利尿、抗炎、抗肿瘤、降糖降脂、抗脂肪肝等生物学活性。目前有研究表明泽泻粗提取物具有降低糖尿病大鼠血糖,保护胰岛组织的作用。但是泽泻具有降糖活性的物质基... 详细信息

泽泻是我国栽培历史悠久的传统常用中药材,在现代药理研究中发现泽泻具有利尿、抗炎、抗肿瘤、降糖降脂、抗脂肪肝等生物学活性。目前有研究表明泽泻粗提取物具有降低糖尿病大鼠血糖,保护胰岛组织的作用。但是泽泻具有降糖活性的物质基础尚不明确,其调节糖代谢的作用机理亦不清楚。泽泻醇A-24-乙酸酯(AA-24-a)是泽泻活性三萜成分中含量较高的一种物质,同时也是泽泻质量控制的标准之一。通过前期对泽泻中降糖活性成分的筛选,发现AA-24-a具有明显促进c2c12肌细胞葡萄糖摄取的作用,在此基础上,本文以c2c12肌细胞,以及棕榈酸诱导的胰岛素抵抗的c2c12细胞为模型,系统研究了AA-24-a对c2c12肌细胞糖代谢以及胰岛素敏感性的影响,并深入探究了其作用机制。首先,我们基于c2c12肌细胞,探究了AA-24-a对葡萄糖摄取的调控作用及其机制。我们通过2-NBDG法测定细胞对葡萄糖的摄取能力并提取细胞膜蛋白,检测GLUT4的转位,发现AA-24-a能够显著促进c2c12细胞对葡萄糖的摄取并能促进GLUT4的转位。通过Western Blotting以及q-PcR技术检测糖代谢相关的蛋白、转录因子的表达水平,我们发现AA-24-a对基础状态下c2c12细胞的胰岛素信号通路蛋白IRS1酪氨酸632位点、AKT丝氨酸473位点与苏氨酸308位点的磷酸化水平均无明显影响,但是AA-24-a显著上调了AMPK、Acc、p38以及AS160蛋白的磷酸化水平,提示AA-24-a促进葡萄糖摄取的能力与AMPK信号通路有关。我们使用AMPK特异性抑制剂compound c对细胞进行预处理,我们发现compound c逆转了AA-24-a促进AMPK、Acc、p38以及AS160磷酸化水平的作用,削弱了AA-24-a对葡萄糖摄取与GLUT4转位的促进作用。使用ca MKKβ抑制剂STO-609进行预处理,我们发现STO-609同样抑制了AA-24-a增强AMPK、Acc、p38以及AS160磷酸化水平的作用,削弱了AA-24-a对葡萄糖摄取与GLUT4转位的促进作用,证明AA-24-a通过ca MKKβ激活AMPK,进一步磷酸化p38以及AS160进而促进GLUT4的转位以及葡萄糖摄取。我们还发现AA-24-a能够促进细胞内ppargc1a,tfam,nrf1,nrf2,tfb1m,tfb2m等与细胞线粒体生物合成有关的基因的表达,提示AA-24-a可能具有促进线粒体功能的作用。而后,我们使用棕榈酸诱导的胰岛素抵抗的c2c12肌细胞模型,探究了AA-24-a对肌细胞胰岛素敏感性及相关信号通路的调控机制。棕榈酸可诱导小鼠c2c12肌细胞产生胰岛素抵抗,主要表现为细胞中胰岛素介导的葡萄糖摄取及胰岛素信号通路功能受损。AA-24-a能够显著改善棕榈酸诱导的c2c12细胞的胰岛素抵抗状态,包括增加胰岛素刺激下的葡萄糖摄取以及IRS1酪氨酸632位点、AKT丝氨酸473位点与苏氨酸308位点的磷酸化水平。同时,AA-24-a上调了AMPK以及AS160的磷酸化水平,下调了内质网应激标志蛋白Bi P的表达水平。AMPK特异性抑制剂compound c阻断了AA-24-a对胰岛素介导的葡萄糖摄取和胰岛素信号通路的恢复作用,消除了AA-24-a促进AMPK、AS160的磷酸化,抑制Bi P蛋白的表达的作用。证明AA-24-a改善胰岛素抵抗的作用是通过AMPK介导的。综上所述,AA-24-a能够通过ca MKKβ活化c2c12肌细胞中AMPK信号通路,并能够通过ca MKKβ-AMPK-p38/AS160途径促进c2c12肌细胞的葡萄糖摄取,具有一定的降糖作用。在胰岛素抵抗c2c12肌细胞中,AA-24-a能够通过AMPK抑制内质网应激,缓解其对胰岛素信号通路的抑制作用,具有胰岛素增敏的作用,同时AA-24-a还通过激活AMPK-AS160通路改善棕榈酸削弱的葡萄糖摄取功能。本研究为泽泻资源的利用提供了理论依据,也为泽泻中药现代化提供了药效物质基础和作用靶点方面的实验依据,有望为寻找新型具有降糖与改善胰岛素抵抗活性的天然产物提供了实验素材。

关键词：泽泻醇A-24-乙酸酯 c2c12肌细胞葡萄糖代谢胰岛素抵抗

司美格鲁肽改善棕榈酸诱导c2c12骨骼肌细胞萎缩的机制研究

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中华内分泌代谢杂志 2024年第4期40卷 326-332页

作者：赵丽华徐志凯田雪王瑞旭卢亚男何建秋郭晓宇韩桂艳高宇承德医学院 067000 承德医学院附属医院内分泌科河北省泛血管疾病重点实验室067000

目的探讨胰升糖素样肽-1受体激动剂(GLP-1RA)司美格鲁肽改善棕榈酸诱导c2c12骨骼肌细胞萎缩的机制。方法c2c12细胞分为对照组、0.5 mmol/L棕榈酸组、0.5 mmol/L棕榈酸+15 nmol/L司美格鲁肽组、0.5 mmol/L棕榈酸+90 nmol/L司美格鲁肽组及... 详细信息

目的探讨胰升糖素样肽-1受体激动剂(GLP-1RA)司美格鲁肽改善棕榈酸诱导c2c12骨骼肌细胞萎缩的机制。方法c2c12细胞分为对照组、0.5 mmol/L棕榈酸组、0.5 mmol/L棕榈酸+15 nmol/L司美格鲁肽组、0.5 mmol/L棕榈酸+90 nmol/L司美格鲁肽组及0.5 mmol/L棕榈酸+900 nmol/L司美格鲁肽组,ccK-8检测各组细胞存活率,2-NBDG荧光探针检测各组细胞葡萄糖摄取情况,免疫荧光法检测肌管直径,Western印迹法检测葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)、磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、Ⅲ型纤维连接蛋白结构域5(FNDc-5)、肌球蛋白重链(MHc)、肌细胞生成素(MyoG)、肌肉萎缩盒F基因(Atrogin-1)及肌肉环状指基因1(MuRF-1)蛋白的表达水平。结果与对照组相比,棕榈酸组细胞存活率及葡萄糖摄取均明显降低,肌管直径减小,p-Akt、GLUT4、FNDc-5、MHc及MyoG蛋白表达水平显著下降,Atrogin-1及MuRF-1表达显著升高(均P细胞存活率、葡萄糖摄取和肌管直径,以及p-Akt、GLUT4、FNDc-5、MHc和MyoG的蛋白表达水平,降低Atrogin-1及MuRF-1蛋白表达(均Pc2c12细胞胰岛素抵抗,并通过促进肌细胞合成、抑制肌细胞降解,改善肌细胞萎缩,FNDc-5可能参与其中。

关键词：司美格鲁肽胰岛素抵抗 c2c12肌细胞骨骼肌细胞萎缩 Ⅲ型纤维连接蛋白结构域5

密骨胶囊通过NF-κB和AKT-mTOR信号通路对肌少症的作用机制

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中国骨质疏松杂志 2023年第7期29卷 942-948页

作者：孙雯丁劼王培歌李小凯郭海玲赵咏芳上海中医药大学附属曙光医院石氏伤科医学中心上海201203 上海市中医药研究院骨伤科研究所上海201203

目的利用网络药理学和小鼠c2c12肌细胞体外细胞实验,研究密骨胶囊治疗肌少症的主要活性成分和潜在作用机制。方法从TcMSP等网络数据库对密骨胶囊的中药成分进行活性成分和主要靶点的收集,并从Genecards等数据库中对肌少症的疾病基因... 详细信息

目的利用网络药理学和小鼠c2c12肌细胞体外细胞实验,研究密骨胶囊治疗肌少症的主要活性成分和潜在作用机制。方法从TcMSP等网络数据库对密骨胶囊的中药成分进行活性成分和主要靶点的收集,并从Genecards等数据库中对肌少症的疾病基因进行搜索,交集预测密骨胶囊作用于肌少症的靶点和通路。体外实验对小鼠c2c12肌细胞进行培养及诱导分化。用密骨胶囊含药血清预处理细胞,再用TNF-α炎症因子进行刺激,造成肌细胞萎缩。免疫印迹法和聚合酶链式反应法证明其对肌细胞内NF-κB通路和AKT-mTOR通路中相关蛋白表达情况。结果在密骨胶囊对肌肉的作用中,核心靶点为MTOR、ESR1、EGFR、SIRT1、cTNNB1、VEGFA、ALB、IL6、TP53、TNF、AKT1,可能干预HIF-1、AGE-RAGE、TNF、PI3K-AKT-mTOR等信号通路。密骨胶囊含药血清干预后c2c12肌细胞增粗,降低MuRF1 mRNA表达。免疫印迹实验结果中,密骨胶囊含药血清降低TNF-α刺激的Atrogin-1蛋白量,抑制iκbα磷酸化降解,减少蛋白降解。密骨胶囊含药血清减少TNF-α对p-AKT、p-4EBP1的抑制,增加蛋白合成。结论通过网络药理学和体外实验验证,密骨胶囊可能对肌少症有防治作用。密骨胶囊抑制NF-κB通路,减缓肌蛋白降解。密骨胶囊激活AKT-mTOR通路,促进肌细胞内蛋白合成。

关键词：密骨胶囊肌少症网络药理学 c2c12肌细胞信号通路

富集黄酮的去柱头藏红花花部提取物的降血糖作用及机制研究

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富集黄酮的去柱头藏红花花部提取物的降血糖作用及机制研究

作者：刘一凡华东师范大学

学位级别：硕士

藏红花为珍稀的药食两用资源植物,干燥柱头为其药用部位,是传统名贵中药材,《本草纲目》有记载其柱头活血,治惊悸的功能。而柱头占整朵花质量比例极小,其余采摘过后包括花梗、花瓣、花托及雄蕊等在内的花部被丢弃,丢弃部分占总采收质量... 详细信息

藏红花为珍稀的药食两用资源植物,干燥柱头为其药用部位,是传统名贵中药材,《本草纲目》有记载其柱头活血,治惊悸的功能。而柱头占整朵花质量比例极小,其余采摘过后包括花梗、花瓣、花托及雄蕊等在内的花部被丢弃,丢弃部分占总采收质量的92.6%,我国每年丢弃藏红花废弃物达几十万吨,造成资源浪费。实验室前期从去柱头花部中筛选出富集黄酮的去柱头藏红花花部提取物(EFRc),能够有效促进c2c12肌细胞对葡萄糖的消耗,表明EFRc可促进肌细胞对葡萄糖的利用,可能具有降糖、改善糖代谢紊乱的作用,但此作用需进一步在体内水平进行评价,此外EFRc调节糖代谢的作用机制也未被阐明。为此本文采用STZ诱导的类似1型糖尿病模型,探究了EFRc的降糖活性,并进一步探索其作用机制。首先腹腔注射链脲佐菌素(STZ)诱导小鼠以建立类似1型糖尿病模型,灌胃给予两个剂量的EFRc(100 mg/kg和200 mg/kg),在此过程中,通过监测小鼠的空腹血糖变化来评估EFRc的降糖效果。结果显示,连续给药34天后100和200 mg/kg剂量的EFRc均能够降低小鼠的空腹血糖和血清葡萄糖含量,但对口服葡萄糖耐量异常没有明显改善。同时,注射STZ导致小鼠饮水量上升,与STZ组相比,EFRc处理组的饮水未有明显变化。肝脏和胰腺的H&E染色结果显示,相较于正常对照组,糖尿病模型组肝细胞边缘模糊破碎,细胞核染色浅,EFRc组细胞形态相对完整。糖尿病模型组胰腺体积变小,胰腺周边细胞形状不规则,EFRc处理组的胰腺体积有一定程度的增大。基于EFRc改善血糖升高和缓解组织形态的损伤,对EFRc发挥降糖作用的机制进行进一步探索,结果发现,EFRc上调肝脏和肌肉中调节糖摄取的关键蛋白AMPK、AKT、AS160的磷酸化水平,提示EFRc可能通过激活AMPK和AKT信号通路改善STZ诱导的糖代谢紊乱。为了明确EFRc发挥降糖作用的机制,本文采用c2c12肌细胞进行进一步的探究。结果显示50μg/m L和100μg/m L的EFRc可显著促进c2c12肌细胞对葡萄糖的消耗和摄取,并同体内实验一样能够刺激AMPK和AKT及下游AS160的磷酸化表达。但是进行AMPK siRNA转染后,EFRc上调AKT、AS160磷酸化的作用被削弱,同时,EFRc促进c2c12肌细胞葡萄糖摄取的作用也由于转染了AMPK siRNA被削弱,结果表明:EFRc促进c2c12肌细胞葡萄糖摄取的作用是通过激活AMPK实现的,AMPK进一步刺激AKT、AS160磷酸化促进糖摄取。综上所述,EFRc能够降低STZ诱导的类似1型糖尿病小鼠的高血糖,能够促进c2c12肌细胞对葡萄糖的摄取和消耗,EFRc的降糖作用是通过激活AMPK进而刺激AKT、AS160的磷酸化表达实现的。本研究明确了EFRc的降糖活性和作用机制,为藏红花废弃部位高值化的利用提供了实验依据,也为发掘EFRc的药用价值提供了理论支持和现实意义。

关键词：降血糖糖摄取藏红花去柱头花部提取物 c2c12肌细胞链脲佐菌素