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灰霉菌胁迫下小立碗藓PpLOX2基因的抗病功能研究

灰霉菌胁迫下小立碗藓PpLOX2基因的抗病功能研究

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作者：车天敏贵州师范大学

学位级别：硕士

氧脂类化合物在植物防御病原菌中有重要作用。苔藓保留着维管束植物在进化过程中失去的c20途径,脂氧合酶2(LOX2)能够以c20脂肪酸作为底物,产生特殊的氧脂化合物。本研究室已完成灰霉菌侵染后小立碗藓(Physcomitrium(Physcomitrella)pate... 详细信息

氧脂类化合物在植物防御病原菌中有重要作用。苔藓保留着维管束植物在进化过程中失去的c20途径,脂氧合酶2(LOX2)能够以c20脂肪酸作为底物,产生特殊的氧脂化合物。本研究室已完成灰霉菌侵染后小立碗藓(Physcomitrium(Physcomitrella)patens)转录组测序,发现PpLOX2基因在侵染早期上调表达。本研究以小立碗藓作为实验材料,构建了pTFH15.3-PpLOX2过表达载体;PEG 6,000介导p TFH15.3-PpLOX2的原生质体转化;G 418抗性筛选、PcR分子鉴定获得过表达植株。灰霉菌(Botrytis cinerea)侵染小立碗藓PpLOX2过表达植株,通过表型显微观察、RNA-seq和HPLc-Lc-MS/MS等实验手段研究PpLOX2基因的抗病功能及机制,得到如下结果:***2基因在小立碗藓对灰霉菌的早期防御反应中发挥重要作用。LOXs基因家族有8个成员,小立碗藓接种灰霉菌后,通过RT-q PcR分析,发现PpLOX1、PpLOX2、PpLOX3、PpLOX7均呈现上调表达,但PpLOX2在接种第3 d表达显著,是未处理(未经灰霉菌侵染)小立碗藓的18.17倍。2.获得小立碗藓PpLOX2基因过表达植株。构建小立碗藓PpLOX2过表达载体,经PEG介导的原生质体遗传转化至小立碗藓,抗生素G 418筛选、PcR分子鉴定结果表明获得9株PpLOX2过表达植株。与对照(小立碗藓WT)相比较,PpLOX2-OE4植株中PpLOX2表达量约为对照的4.47倍,PpLOX2-OE5的表达量约为3.51倍,PpLOX2-OE8的表达量约为4.35倍。3.过表达PpLOX2基因植株抗性明显增强。灰霉菌侵染小立碗藓WT和PpLOX2-OE(PpLOX2-OE4、PpLOX2-OE5、PpLOX2-OE8)植株后观察表型,3株PpLOX2-OE植株的茎叶体黄化和褐色化程度比WT植株浅;RT-q PcR技术检测接种后PpLOX2-OE植株的PpLOX2的表达水平,过表达植株中PpLOX2基因的表达量随着接种时间的增加不断增加;RT-PcR检测接种灰霉菌后小立碗藓细胞内菌丝拷贝数发现,PpLOX2-OE植株的表达量低于WT,其中PpLOX2-OE4植株细胞内菌丝拷贝数显著低于WT。研究结果表明,PpLOX2基因过表达显著增强了小立碗藓对灰霉菌的抗病能力。***-seq分析结果显示,PpLOX2-OE4/WT共检测到913个差异表达基因(DEG),接种灰霉菌24 h/48 h/72 h后分别共获取到4,146、10,565和1,990个DEG。KEGG分类显示,与氧脂化合物合成途径中(亚油酸代谢、花生四烯酸代谢、α-亚麻酸代谢)未处理组有7个DEG,处理24 h中17个DEG,48 h有41个DEG,72 h有7个DEG。结果表明,这些代谢通路和生物合成过程在小立碗藓响应灰霉菌过程中具有重要作用。此外,差异代谢物和DEG还富集到甘油磷脂代谢途径、甘油酯代谢途径,此外还参与到苯丙烷类生物合成、MAPK信号途径、植物激素信号转导以及植物防御相关途径,这些DEG和代谢物可能参与小立碗藓对灰霉菌的抗性反应。

关键词：小立碗藓灰霉菌脂氧合酶 PpLOX2 抗病 c20脂肪酸

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