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中国畜牧兽医 2024年第5期51卷 2091-2100页

作者：郭禹程晶左玉柱范京惠姜海军河北农业大学动物医学院保定071001 北京市农林科学院畜牧兽医研究所北京100097

【目的】禽偏肺病毒(Avian metapneumovrus,aMPV)是副黏病毒科偏肺病毒属成员,其所造成的鸡肿头症和产蛋率下降对养殖业造成严重危害。为更好地预防aMPV并研究其发病机制,本研究将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protei... 详细信息

【目的】禽偏肺病毒(Avian metapneumovrus,aMPV)是副黏病毒科偏肺病毒属成员,其所造成的鸡肿头症和产蛋率下降对养殖业造成严重危害。为更好地预防aMPV并研究其发病机制,本研究将增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)插入c型aMPV(aMPV/c)基因组中,构建表达EGFP的重组aMPV,并使用不同的载体及启动子构建aMPV迷你基因组,来优化aMPV反向遗传操作系统(reverse genetic system,RGS)的构建。【方法】将EGFP插入pBluescript-aMPV RGS的P和M蛋白之间非编码区并进行拯救,观察绿色荧光蛋白的表达情况,同时测定重组病毒滴度及遗传稳定性。为优化RGS的构建,采用含有T7启动子的pBluescript SK(+)和含有T7、cMV启动子的pcDNA3.1两种载体构建aMPV迷你基因组。首先将aMPV/c基因组两端的先导区(leader)和尾随区(trailer)与EGFP的cDNA进行PcR扩增,并切胶回收;其次将各胶回收片段按照leader-EGFP-trailer的顺序进行无缝克隆连接,并测序验证;最后将连接完整的迷你基因组反向插入两个载体中,构建aMPV/c的迷你基因组(pBR-aMPV/c和pc-aMPV/c)。在拯救迷你基因组的试验中,将两个aMPV/c迷你基因组与3个表达N、P和L蛋白的质粒共转染到BHK-21细胞中,观察绿色荧光蛋白的表达情况。【结果】拯救的aMPV-EGFP重组病毒测序结果显示,EGFP已成功插入aMPV基因组中,并在前3代aMPV-EGFP重组病毒中稳定表达。aMPV-EGFP重组病毒滴度在感染96 h后达到105.5 TcID 50/mL。而pBR-aMPV/c和pc-aMPV/c两个重组质粒的测序结果也证明了含有EGFP的aMPV迷你基因组构建完成。将3个重组质粒分别与辅助质粒共转染至BHK-21细胞中,转染24 h后观察到细胞中绿色荧光蛋白表达,证明aMPV-EGFP重组病毒及pBR-aMPV/c和pc-aMPV/c两个aMPV迷你基因均都成功表达了EGFP。【结论】本研究成功构建了两个aMPV迷你基因组并拯救了aMPV-EGFP重组病毒,重组病毒具有良好的遗传稳定性。而cMV和T7作为aMPV/c RGS中的启动子时,二者的拯救效率相同。pBluescript SK(+)和pcDNA3.1均可用于aMPV/c RGS的构建,本研究为aMPV/c RGS的构建提供了多种方法。

关键词： c型禽偏肺病毒迷你基因组反向遗传系统 cMV启动子增强绿色荧光蛋白 T7启动子

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引起种(蛋)鸭输卵管积液综合征的新发病毒——c型禽偏肺病毒

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福建农业学报 2023年第12期38卷 1387-1394页

作者：傅秋玲江南松梁齐章刘荣昌万春和程龙飞陈红梅林琳焦文龙吴胜会江斌郑小兰林建生傅光华黄瑜福建省农业科学院畜牧兽医研究所/福建省禽病防治重点实验室/福建省畜禽疫病防控产业技术创新研究院福建福州350013

【目的】明确引起种(蛋)鸭特征性输卵管积液和产蛋下降的新发疫病[俗称种(蛋)鸭输卵管积液综合征]的病原。【方法】对自闽粤赣浙皖桂等地产蛋率较高的部分鸭群表现以输卵管内乳糜性积液、黏膜出血水肿增厚及不同程度产蛋下降为特征的病(... 详细信息

【目的】明确引起种(蛋)鸭特征性输卵管积液和产蛋下降的新发疫病[俗称种(蛋)鸭输卵管积液综合征]的病原。【方法】对自闽粤赣浙皖桂等地产蛋率较高的部分鸭群表现以输卵管内乳糜性积液、黏膜出血水肿增厚及不同程度产蛋下降为特征的病(死)麻鸭、樱桃谷种鸭和种番鸭中采集的样品(输卵管积液、输卵管黏膜、卵巢和肝脾脏器),开展鸭已知病原核酸监测、病原分离鉴定和开产麻鸭人工感染试验。【结果】细菌分离显示,输卵管积液里未分离到细菌,排除细菌感染引起;经病毒核酸监测,只有c型禽偏肺病毒(Avain metapneumoviurs subgroup c,aMPV/c)阳性,未检测到其他引起禽产蛋异常的病毒;以aMPV/c单一阳性的样品经鸭胚进行病毒分离与传代,发现接种鸭胚未见死亡,但胚体表面稍水肿和出血、肝脏出血;对第5代鸭胚液进行RT-PcR检测,结果显示a MPV/c分离阳性率为72.2%;对获得的4株分离株(JX2126、FJ2228、FJ2375和GD2381株)的基因片段进行测序和序列分析发现,该片段与最早报道的番鸭a MPV/c法国分离株(Muscovy duck/1999/99178/France)同源性最高,为96.1%,而与A、B、D型禽偏肺病毒(Avain metapneumoviurs subgroup A,B,D,aMPV/A,B,D)分离株的同源性仅分别为67.8%~68.7%、66.1%~66.8%和71.4%,与人偏肺病毒(Human metapneumoviurs,hMPV)分离株的同源性为67.7%~68.3%;遗传进化分析表明,以上4株分离株与a MPV/c处于同一进化分支上,而与其他亚型aMPV和hMPV亲缘关系较远;经开产麻鸭人工感染试验,成功复制出与自然感染病例相同的临床病症,并能回收到病毒。【结论】明确引起种(蛋)鸭输卵管积液综合征的病原为c型禽偏肺病毒。本研究为该病的快速准确诊断和精准防控提供科学依据。

关键词：种(蛋)鸭输卵管积液综合征产蛋下降输卵管积液 c型禽偏肺病毒分离与鉴定

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c型禽偏肺病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PcR方法的建立及应用

引用

中国家禽 2018年第17期40卷 17-21页

作者：陈基明张文赵长润何怡宁王海勇韦平韦天超磨美兰广西大学动物科学技术学院广西南宁530005

根据GenBank发表的禽偏肺病毒(aMPV)F基因序列,设计一对特异性引物,建立c亚型aMPV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PcR方法。对该反应体系进行条件优化,建立了标准曲线,并进行特异性、敏感性及重复性试验,然后将建立的方法应用于临床样品和... 详细信息

根据GenBank发表的禽偏肺病毒(aMPV)F基因序列,设计一对特异性引物,建立c亚型aMPV的SYBR GreenⅠ实时荧光定量PcR方法。对该反应体系进行条件优化,建立了标准曲线,并进行特异性、敏感性及重复性试验,然后将建立的方法应用于临床样品和攻毒样品的检测。结果显示:标准曲线循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系;建立的方法只能检测出c亚型aMPV,最低可以检测到0.8×10~1拷贝/μL的核酸模板,重复性试验的变异系数小于4%。应用建立的方法对43份临床样品检测,结果显示均为阴性;对42份35日龄SPF鸡人工感染后1～21 d的气管和肺脏样品进行检测,结果显示攻毒样品均为阳性。因此,研究建立的特异、灵敏、重复性好的c型aMPV实时荧光定量PcR方法,既可适合于该病的早期诊断和流行病学调查,又为该病毒的致病机制研究提供技术支撑。

关键词： c型禽偏肺病毒基因 SYBR Green Ⅰ 荧光实时定量PcR

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