检索结果-南通市图书馆

作者：李逸菲河南农业大学

学位级别：硕士

四季秋海棠（Begonia semperflorens）是秋海棠科（Begoniaceae）秋海棠属（Begonia）多年生常绿草本,绿叶系列‘超级奥林匹克’（‘Super Olympia’）对环境胁迫的响应和适应导致叶片花色素苷积累过量而呈色变红,适于研究活性氧（react... 详细信息

四季秋海棠（Begonia semperflorens）是秋海棠科（Begoniaceae）秋海棠属（Begonia）多年生常绿草本,绿叶系列‘超级奥林匹克’（‘Super Olympia’）对环境胁迫的响应和适应导致叶片花色素苷积累过量而呈色变红,适于研究活性氧（reactive oxygen species,ROS）诱导花色素苷合成机制。ROS在环境因子诱导花色素苷合成中起重要作用,植物NADPH氧化酶（Respiratory Burst Oxidase Homologues,RBOHs）是植物细胞内ROS的主要生产者,在植物防御反应、生长发育调节和细胞信号转导等方面具有重要作用。ROS作为氧代谢的天然副产物参与细胞信号转导和体内平衡,其过量累积则严重损害植物细胞结构。因此,探明植物对胁迫响应中的Rboh依赖机制成为迫切需要。课题组前期研究发现,异源表达bsrbohd产生的ROS爆发能诱导拟南芥叶片花色素苷合成。为了进一步确认bsrbohd产生的ROS爆发对四季秋海棠花色素苷合成的诱导机理,本研究构建bsrbohd干扰表达（RNAi）载体,分别将干扰载体和空载体转化四季秋海棠;以野生型和空载四季秋海棠为对照,进行低温处理,检测野生型、空载、三个干扰株系RNAi1、RNAi2和RNAi3与三个过表达株系OE1、OE2和OE3的活性氧与花色素苷含量,bsrbohd与花色素苷合成相关基因表达量;通过转录组测序筛选差异表达基因。主要研究结果如下:1.构建bsrbohd干扰表达载体,通过农杆菌介导的叶盘法转化四季秋海棠,经抗性筛选与转录水平鉴定选出干扰株系RNAi1、RNAi2和RNAi3与空载株系EV1。对低温（昼15℃/夜5℃）下各株系进行表型观察发现,三个过表达株系叶片变红程度明显高于对照植株,而三个干扰株系叶片仅表现出轻微变化,花色素苷含量测定结果与此一致。表明相较于对照株系,过表达bsrbohd后植株叶片产生了更高的花色素苷积累,干扰植株叶片花色素苷积累则较少。2.分别测定低温0-6 d时所有株系叶片超氧阴离子产生速率和过氧化氢含量。结果显示,正常条件下九个株系活性氧含量差异不显著,而后三个过表达株系活性氧含量显著高于对照植株,干扰株系则低于后者,组织化学染色结果表现出类似趋势。这表明bsrbohd基因所编码的NADPH氧化酶低温下被激活并正常行使功能,且过表达该基因能增加ROS产物使过表达植株较对照植株显示出对环境变化更强的响应能力,而干扰植株则反之。3.实时荧光定量PCR分析显示,bsrbohd表达上调后,花色素苷合成相关基因表达也随之上调,过表达株系各基因表达量几乎均显著高于对照植株,干扰株系各基因表达量则反之。这表明在四季秋海棠中bsrbohd过表达能显著增加花色素苷生物合成相关基因表达量,进而促进花色素苷的生物合成,在四季秋海棠中干扰bsrbohd后则反之。4.转录组学分析显示,DEGs主要富集在类黄酮生物合成途径、乙烯激活信号负调节通路和过氧化氢反应通路中。类黄酮生物合成途径分析表明结构基因CHS、DFR通过与MYB、b HLH、NAC等转录因子结合共同调控四季秋海棠花色素苷的合成;乙烯激活信号负调节通路中筛选到5个显著下调的ERF基因,表明乙烯响应因子ERF参与调控ROS产生进而调控花色素苷的生物合成;过氧化氢反应通路中筛选到3个WRKY转录因子,2个b HLH转录因子和3个ERF转录因子,均随bsrbohd的上调而显著上调表达。以上结果表明,bsrbohd上调表达引发ROS爆发,H2O2作为信号分子调节花色素苷相关调控基因的表达,引起花色素苷相关结构基因表达上调,最终导致四季秋海棠花色素苷积累。

关键词：四季秋海棠 bsrbohd基因活性氧花色素苷

四季秋海棠遗传转化体系的建立及bsrbohd基因的功能验证

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

四季秋海棠遗传转化体系的建立及BsRbohD基因的功能验证

作者：王瑞博河南农业大学

学位级别：硕士

四季秋海棠(Begonia semperflorens)是一种多年生常绿草本花卉,被广泛用做观赏植物用于造景。四季秋海棠‘超级奥林匹克’是一种绿叶红花品种,但常因外界环境改变,如高光、低温,引起叶色的变化,具体表现为因花色素苷积累而变红。植物NA... 详细信息

四季秋海棠(Begonia semperflorens)是一种多年生常绿草本花卉,被广泛用做观赏植物用于造景。四季秋海棠‘超级奥林匹克’是一种绿叶红花品种,但常因外界环境改变,如高光、低温,引起叶色的变化,具体表现为因花色素苷积累而变红。植物NADPH氧化酶是细胞内ROS产生的主要来源,有研究发现,因为RbohD基因的大量表达促使植物产生大量的活性氧,活性氧的大量积累对植物产生危害,进而激发了植物的应激防御体系。为了探究低温胁迫下四季秋海棠叶片花色素苷合成积累是否与NADPH氧化酶所介导产生的活性氧有关,本研究将前期课题组构好的超表达载体Super-1300-bsrbohd,通过农杆菌花序侵染的方法,分别转化‘哥伦比亚’野生型拟南芥和纯合的T-DNA插入突变体,通过潮霉素(Hyg)抗性筛选和孟德尔遗传定律得到三株单拷贝的纯和过表达株系OE2、OE6、OE19和三株单拷贝的回补株系Compl-RbohD1、Compl-RbohD2、Compl-RbohD3,以野生型拟南芥为对照,进行低温(4℃)处理,检测了野生型,三个过表达株系OE2、OE6、OE19,突变体和三个回补株系Compl-RbohD1、Compl-RbohD2、Compl-RbohD3的超氧阴离子产生速率,过氧化氢含量,花色素苷含量,bsrbohd基因相对表达量以及花色素苷相关结构基因和相关转录调控基因的表达量。此外,目前有关绿叶红花四季秋海棠“超奥”品种遗传转化的研究,鲜有报道。在课题组前期已成功建立四季秋海棠叶片再生体系的基础上,以四季秋海棠bsrbohd基因为外源目的基因,利用根癌农杆菌进行四季秋海棠的遗传转化体系的探索。结果如下:1对于得到的T-DNA插入突变体,通过三引物PCR的方法进行验证,结果证明突变体为纯合突变体,又通过RT-PCR进一步验证了上述突变体所突变基因即AtRbohD基因完全被敲除。2将四季秋海棠bsrbohd基因在拟南芥中异源表达,并通过潮霉素(Hyg)抗性筛选和PCR检测,分别鉴定筛选三个单拷贝的纯合过表达株系OE2、OE6、OE19和三个单拷贝的回补株系Compl-RbohD1、Compl-RbohD2、Compl-RbohD3。3对野生型、突变体三个过表达株系过表达株系OE2、OE6、OE19和回补株系Compl-RbohD1、Compl-RbohD2、Compl-RbohD3八个株系进行低温(4℃)处理,以野生型拟南芥为对照,通过对八个株系超氧阴离子产生速率和过氧化氢含量的测定,分析发现,在CK条件下,过表达株系的ROS水平显著高于野生型,三个回补株系的ROS水平与野生型几乎一致,且显著高于突变体;四季秋海棠bsrbohd基因可以在拟南芥体内异源正常表达,其所控制的NADPH氧化酶功能正常。而在低温处理15D后,八个株系的ROS水平,相较于CK,大大增加,且三个过表达株系的活性氧水平远远高于野生型,三个回补株系的活性氧水平远高于突变体,略高于野生型。说明转入bsrbohd基因后在面对环境改变时正常产生活性氧以应对环境改变,且转基因株系面对环境改变时表现出比野生型更加敏感的现象。4在低温处理前后八个株系的表型图可知,三个过表达株系相较野生型表现出更多的花色素苷积累,三个回补株系的花色素苷积累与野生型无特别大差异,突变体无明显的花色素苷积累现象。对其花色素苷含量进行测定,分析发现,在CK条件下,八个株系的花色素苷含量无显著差异;在低温处理后,三个过表达株系的花色素苷含量显著高于野生型,三个回补株系的花色素苷含量显著高于突变体,且两个回补株系Compl-RbohD1和Compl-RbohD3的花色素苷含量与野生型无显著差异,Compl-RbohD2的花色素苷含量略高于野生型;并且拟南芥花色素苷相关的转录调控基因和花色素苷合成通路上的结构基因在低温胁迫后都表现出了明显的上调,其中三个过表达株系的表达量几乎都显著高于野生型,三个回补株系的表达量显著高于突变体。以上结果说明转bsrbohd基因在拟南芥中正常表达且发挥作用,由bsrbohd基因介导产生的活性氧可以作为信号分子调节花色素苷相关转录调控基因的表达,进而引起花色素苷相关结构基因的表达上调,最终引起花色素苷的合成积累。5在农杆菌GV3101介导的四季秋海棠遗传转化体系中,卡那霉素(Kanarnycin,Kan)对四季秋海棠不定芽分化的筛选压为25mg/l。分别从预培养时间、侵染液浓度、侵染时间和共培养时间4个方面,对四季秋海棠遗传转化体系进行探索。通过对转基因苗DNA分子水平和转录水平的检测,共有两个组合得到了阳性苗,一组是预培养2 D、侵染液浓度OD600=0.7、侵染10 min、共培养4 D,阳性率为11.1%;另一组是预培养1 D、侵染液浓度OD600=0.7、侵染8 min

关键词：四季秋海棠 bsrbohd基因活性氧花色素苷遗传转化体系

四季秋海棠花色素苷相关基因bsrbohd的克隆及功能验证

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

四季秋海棠花色素苷相关基因BsRbohD的克隆及功能验证

作者：王阳河南农业大学

学位级别：硕士

四季秋海棠(Begonia semperflorens)是一种多年生常绿草本花卉,常被用做花坛和地被布景。其中,应用较广的绿叶系列四季秋海棠‘超级奥林匹克’品种常因为环境改变而造成花色素苷合成的积累而变红。花色素苷是使植物体组织呈现红至紫色... 详细信息

四季秋海棠(Begonia semperflorens)是一种多年生常绿草本花卉,常被用做花坛和地被布景。其中,应用较广的绿叶系列四季秋海棠‘超级奥林匹克’品种常因为环境改变而造成花色素苷合成的积累而变红。花色素苷是使植物体组织呈现红至紫色的主要物质,因而具有植物逆境胁迫的“指示剂”之称,因此,在研究环境诱导花色素苷合成方面四季秋海棠可以作为一种优良的研究材料。为了探究低温和高光环境下四季秋海棠叶片花色素苷合成的积累是否与NADPH氧化酶所介导产生的活性氧有直接关联,本研究对课题组前期所获得的NADPH氧化酶家族基因BsRnohD进行了克隆分析、组织特异性表达分析和亚细胞定位分析,通过农杆菌花序侵染的方法将其转化‘哥伦比亚’野生型拟南芥,以未转基因野生型拟南芥为对照分别进行低温和高光处理,并检测了拟南芥各株系的光合特性、生理指标以及相关结构基因的表达量。结果如下:1.从四季秋海棠中成功克隆出NADPH氧化酶家族基因bsrbohd基因(基因登录号为MH784503),该基因序列全长3796bp,CDS区长2784bp,共编码957个氨基酸。2.分别以四季秋海棠叶、雄花、雌花、茎和根的总RNA反转录后得到的各部位cDNA为模板,实时荧光定量PCR结果表明,bsrbohd基因在四季秋海棠叶片、雄花、雌花、茎和根中均有表达,但在不同组织中表达水平不同,其中根>雄花>雌花>叶>茎。3.成功构建了四季秋海棠bsrbohd基因GFP表达载体,以RFP质膜Marker蛋白表达载体为对照,通过注射入烟草叶片下表皮,使其在烟草叶片中瞬时表达,通过激光共聚焦显微镜观察发现四季秋海棠bsrbohd基因所控制的NADPH氧化酶蛋白定位在细胞质膜上。4.将四季秋海棠bsrbohd基因在拟南芥中异源表达,并通过潮霉素Hyb和基因组特异性PCR扩增的方法,鉴定筛选到T3代阳性植株。选取两个转基因阳性株系,以野生型拟南芥为对照,分别进行低温和高光处理。通过对转基因植株和野生型植株光合作用荧光参数测定,结合快速叶绿素荧光诱导动力学曲线和“JIP-test”参数分析发现,野生型拟南芥植株与两个转基因株系在J点、I点和P点出现了明显差异,且均大于转基因株系,两个转基因株系之间无明显差异,两个转基因株系的Fv/Fm、Fv/Fo、ABS/CSo、TRo/CSo、ETo/CSo、REo/CSo、Sm、ETo/RC、REo/RC、PI abs和PI total值相比于野生型拟南芥均下降,而Fo/Fm、Vj、Vi、N、ABS/RC、DIo/RC、TRo/RC和DIo/CSo值与野生型相比均上升,说明在拟南芥中异源表达四季秋海棠bsrbohd基因使拟南芥植物叶片的生理状态和光合机构都发生了变化。对其进行胁迫后测定各生理指标和相关基因相对表达量后分析发现,转基因株系面对环境突变比野生型要更加敏感,表现为超氧阴离子产生速率、过氧化氢含量、花色素苷含量、bsrbohd基因在时间上上调比野生型拟南芥要更快,在含量或表达量上比野生型也更高,而拟南芥相关几个花色素苷合成结构基因的表达量在胁迫后期比野生型也更高,其中对高光胁迫的敏感性要大于低温胁迫,说明该研究所克隆的四季秋海棠bsrbohd基因可以在拟南芥体内异源正常表达,其所控制的NADPH氧化酶功能正常,可以正常产生活性氧以应对环境改变,而由bsrbohd基因介导产生的活性氧可以作为信号分子直接或间接调控更多的花色素苷合成与积累。

关键词：四季秋海棠 bsrbohd基因组织特异性表达亚细胞定位活性氧花色素苷

四季秋海棠叶片转录组测序分析和低温诱导花色素苷合成机理

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

四季秋海棠叶片转录组测序分析和低温诱导花色素苷合成机理

作者：王佳婉河南农业大学

学位级别：硕士

花色素苷是使植物体组织呈现红至紫色的主要物质,常因各种环境胁迫诱导而在植物叶片上合成积累,因而具有植物逆境胁迫的“指示剂”之称。通过转录组测序技术的发展,我们可以深入探究低温诱导和高光诱导的花色素苷合成机制中的差别部分... 详细信息

花色素苷是使植物体组织呈现红至紫色的主要物质,常因各种环境胁迫诱导而在植物叶片上合成积累,因而具有植物逆境胁迫的“指示剂”之称。通过转录组测序技术的发展,我们可以深入探究低温诱导和高光诱导的花色素苷合成机制中的差别部分和相同部分。本文我们以四季秋海棠‘超级奥林匹克’为研究材料,对不同条件下(正常生长条件CK、高光条件HL和低温条件LT)四季秋海棠叶片进行转录组测序。根据测序结果,共获得21.09Gb Clean Data,各样品Clean Data均达到6.73Gb,Q30碱基百分比在92.10%及以上。低温处理和高光处理分别获得74,779和83,699条unigene,其平均长度分别684pb和640pb。低温组转录组测序中transcript和unigene的N50值分别为2,200和1,249pb,高光组转录组测序中transcript和unigene的N50值分别为2,113和1,098pb。进行基于Unigene库的基因结构分析,其中SSR分析共获得6,567个SSR标记,同时还进行了CDS预测和SNP分析;分别通过5个蛋白质数据库(Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO数据库)对基因进行功能注释,共获得54,799条Unigene的注释结果,并发现:低温和高光均诱导次生代谢途径的转录因子和合成基因上调表达,但是二者作用的机理并不尽相同:低温通过碳代谢到氨基酸生物途径到苯丙素生物合成进入花色素苷合成途径,而高光是通过蛋白质生物合成至类黄酮生物合成途径再到花色素苷合成途径;高光主要诱导次生代谢途径中的花色素苷合成,而低温在诱导花色素苷合成的同时也诱导了木质素和原花色素(proanthocyanidins)的合成。两组转录组数据中的差异基因涉及花色素苷生物合成、转移运输和调控等方面的生物过程。本研究是第一次对秋海棠进行大规模基因表达的检测。从上述转录组测序的数据中发现,低温在诱导花色素苷合成相关的基因(PAL、4CL、CHS、F3H、ANS和3GT)表达的同时,bsrbohd基因(Rboh家族的其他基因没有变化)也应激显著上调。因此用生物信息学方法对其cDNA序列及推测氨基酸序列进了行分析。对低温下bsrbohd基因进行qRT-PCR分析,结果表明,bsrbohd基因在低温处理3h后即开始显著上调表达,并于第9h达到高峰;而几个关键的花色素苷合成基因(BsPAL、BsCHS、BsF3H和BsANS)则分别在低温处理5h、7h、7h和9h后开始显著上调,并于第9h达到最高峰。初步表明bsrbohd基因介导的HO的信号作用可能介入了低温引起的花色素苷合成过程;为了更进一步验证此推论,分别用HO、MV、低温下施加NADPH氧化酶的底物NADPH、NADPH氧化酶的抑制剂DPI、HO的清除剂DMTU等处理四季秋海棠叶片,结果表明:低温、HO、MV显著促进了植物体内HO含量和O.产生速率,同时bsrbohd、BsPAL、BsCHS、BsF3H和BsANS基因的表达显著上调,最终导致积累了显著的、肉眼可见的花色素苷;低温下施加NADPH氧化酶的底物NADPH加剧了上述ROS的产生,相关基因的表达和花色素苷含量的增加;而低温下施加NADPH氧化酶的抑制剂DPI、HO的清除剂DMTU则通过减少ROS的产生和相关基因的表达而降低了花色素苷的合成。因此,推测低温通过bsrbohd基因产生的ROS诱导了四季秋海棠叶片花色素苷的合成。

关键词：转录组测序低温胁迫 bsrbohd基因活性氧花色素苷