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甘蓝型油菜有限花序调控基因的定位与分析

甘蓝型油菜有限花序调控基因的定位与分析

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作者：赵海菲贵州大学

学位级别：硕士

甘蓝型油菜(Brassica napus,AABB,2n=38)是我国和世界范围内主要的油菜栽培类型。甘蓝型油菜的花序一般为无限花序,而有限花序的变异材料是近些年才被发现的,前期研究证实有限花序具有开花提前、生育期提前、株高降低等特性。本研究以... 详细信息

甘蓝型油菜(Brassica napus,AABB,2n=38)是我国和世界范围内主要的油菜栽培类型。甘蓝型油菜的花序一般为无限花序,而有限花序的变异材料是近些年才被发现的,前期研究证实有限花序具有开花提前、生育期提前、株高降低等特性。本研究以一个新发现有限花序突变体GD605-2为实验材料,利用微观表型观察、传统标记定位、BSA-Seq定位、基因同源克隆、q RT-PCR分析、关联标记开发与应用等方法来研究有限花序形成机理,获得的研究结果如下:1.利用石蜡切片技术观察了GD605-2的野生型(无限花序)和突变型材料(有限花序)的3-8叶期茎的顶端分生组织,了解它们之间发育的微观表型差异。根据切片结果,推断出花序发生变异的时期在油菜发育的5叶期和6叶期之间。2.利用1,059对ILP标记对甘蓝型油菜的两个极端DNA混池(有限花序混池和无限花序混池)进行检测,获得的多态性标记用于检测作图群体的基因型,并创建包含17个多态性标记的两个连锁群:LG01和LG02,分别包含有限花序候选基因:Bnadti1及Bnadti2;其中,LG01染色体总长度为77.8 c M,标记间平均距离为7.07c M,Bnadti1距离Bnap PIP744的距离为0.8 c M,距离Bnap PIP976的距离为2.9 c M;染色体LG02总长度为41.8 c M,标记间平均距离为6.9 c M,Bnadti2距离Bnap PIP1870为2.9 c M,距离Bnap PIP859为1.5 c M。3.对甘蓝型油菜的两个极端DNA混池(有限花序混池和无限花序混池)及亲本进行BSA-Seq分析,根据结果进行滑窗计算,筛选ED值最高的区域在C02和C06染色体上,在C02染色体中,候选期间为3.080 Mb,包含235个候选基因,在C06染色体中,候选期间为0.280 Mb,包含47个候选基因。4.传统定位结果中,Bnadti1被定位在C02:328,559-684,422 bp区间内,与BSA-Seq在C02上定位的区间(C02:320,000-3,400,000)相重合,被确定为同一区间;为了缩小Bnadti1基因所在区间,利用BSA-Seq定位区间内In Del标记开发设计引物,对该区间进行加密,最终将候选区间缩小至720 kb大小(Chr C02:1080,000-1800,000,720 kb);通过对缩小的区间进行序列比对分析发现只有TFL1基因与开花调控相关,命名为:Bna TFL1。传统定位结果中,Bnadti2被定位在C06:24,148,136-33,558,240bp区间内,与BSA-Seq在C06上定位的区间:C06:27,000,000-27,280,000相重合,被确定为同一区间;本区间内只有一个AP1基因与花序发育相关,所以被确定为Bnadti2的候选基因,命名为:Bna AP1。5.采用分子标记辅助转育的方法,利用本研究获得的有限花序调控基因的关联标记标记Bnap PIP744和Bnap PIP859,已成功将有限花序性状转入20份育种材料中。6.利用PCR扩增和测序技术对转育材料中的Bna TFL1和Bna AP1进行克隆,克隆得到的Bna TFL1基因全长1,077 bp,在野生植株和转育植株中氨基酸序列发生两处突变,分别为第26位(P→R)和第175位(A→S);运用生物信息学方法,得到转育材料中的Bna TFL1属亲水性蛋白,分子式为CHNOS,等电点(PI)为9.69。同时,克隆了Bna AP1的CDS序列,序列长为770 bp,在野生植株和转育植株中氨基酸序列也发生两处突变,突变位点为第122位(S→P)和第160位(A→S);运用生物信息学方法发现转育植株中的的Bna AP1属亲水性蛋白,分子式为C1309H2089N391O399S163,等电点(PI)=8.25。7.通过对Bna TFL1和Bna AP1在转育材料和野生型材料中不同时期和不同组织的荧光定量PCR分析,结果表明Bna TFL1基因主要在植株茎内表达,且在转育植株内表达量高于野生型植株,且在6叶期时的表达量最大。Bna AP1基因主要在野生型单株的叶片中表达,且在6叶期时的表达量最大;在转育材料中,Bna AP1基因主要是茎尖中表达,且在5叶期时的表达量最高。本研究对课题通过对自主发现的一个新的有限花序突变体材料GD605-2的调控基因进行了定位、克隆与分析,相关结果可为油菜有限花序调控机理研究及有限花序油菜品系选育打下了基础。

关键词：甘蓝型油菜有限花序基因定位 BnaTFL1 bnaap1

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