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作物学报 2014年第4期40卷 745-750页

作者：王淑文陆俊杏万华方翁昌梅王珍李加纳卢坤梁颖西南大学农学与生物科技学院/重庆市油菜工程技术研究中心/南方山地农业教育部工程研究中心重庆400715

植物MAPKs(mitogen-activated protein kinases)在多种生物和非生物胁迫中起重要作用。课题组前期克隆了甘蓝型油菜bnmapk1基因,并获得bnmapk1超量表达植株。本文以甘蓝型油菜中油821DH系为对照,以超量表达bnmapk1的转基因油菜为试材,... 详细信息

植物MAPKs(mitogen-activated protein kinases)在多种生物和非生物胁迫中起重要作用。课题组前期克隆了甘蓝型油菜bnmapk1基因,并获得bnmapk1超量表达植株。本文以甘蓝型油菜中油821DH系为对照,以超量表达bnmapk1的转基因油菜为试材,采用离体叶片接种的方法,测定染病叶片病斑的大小及病斑周围叶片的草酸含量,并用qRT-PCR检测转基因植株4个病程相关蛋白(OXO、Cu/Zn-SOD、PR2、PR3)编码基因在核盘菌胁迫下的相对表达动态变化。结果表明,甘蓝型油菜bnmapk1超量表达可显著抑制核盘菌对离体叶片的侵染,控制染病叶片内草酸毒素的积累,可能可以解除核盘菌对OXO表达的负调控,使另外3个与病程相关蛋白基因(Cu/Zn-SOD、PR2、PR3)表达上调。表明bnmapk1超量表达可有效提高油菜菌核病抗性。

关键词： bnmapk1 甘蓝型油菜菌核病抗性病程相关基因

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甘蓝型油菜bnmapk1的原核表达、亚细胞定位及酵母双杂交文库筛选

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作物学报 2020年第9期46卷 1312-1321页

作者：王珍姚梦楠张晓莉曲存民卢坤李加纳梁颖西南大学农学与生物科技学院/油菜工程研究中心/西南大学现代农业科学研究院重庆400715

植物的丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinases,MAPKs)级联是生长进程中多种信号跨膜传递的共同通路,它可以将外源刺激转入细胞内并引发细胞应答。目前C族MAPKs在甘蓝型油菜中的研究报道还很有限。本研究通过1个甘蓝型... 详细信息

植物的丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinases,MAPKs)级联是生长进程中多种信号跨膜传递的共同通路,它可以将外源刺激转入细胞内并引发细胞应答。目前C族MAPKs在甘蓝型油菜中的研究报道还很有限。本研究通过1个甘蓝型油菜的C族bnmapk1基因的生物学进程聚类分析发现,bnmapk1可能参与蛋白磷酸化、生长素介导的信号途径、逆境应答、细胞周期及转录等过程。bnmapk1具有369个氨基酸残基,其相对分子质量约为42.5 kD,其可溶性蛋白可在原核系统中被诱导表达。bnmapk1的亚细胞定位结果显示,bnmapk1主要在细胞核内表达。Bait质粒pGBKT7-bnmapk1在酵母双杂交系统中无毒性及自激活活性。为深入研究bnmapk1蛋白参与的生物学进程,从甘蓝型油菜中油821苗期根、茎、叶中分别提取总RNA,分离得到mRNA,利用SMART技术合成并纯化双链cDNA后建立甘蓝型油菜混合cDNA文库。以共转化法筛选与bnmapk1相互作用的蛋白,对其分析与鉴定显示,bnmapk1在生长发育、非生物及生物逆境、转录、蛋白合成及代谢、翻译及翻译后修饰等过程中起作用。研究结果为MAPKs级联,尤其是C族MAPKs的研究提供了新的视野,为甘蓝型油菜抗性的机理研究及分子育种奠定了重要的理论依据。

关键词：甘蓝型油菜 bnmapk1 原核表达亚细胞定位酵母双杂交

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甘蓝型油菜bnmapk1超量表达及中油821的转录差异表达分析

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作物学报 2023年第3期49卷 856-868页

作者：王珍张晓莉刘淼姚梦楠孟晓静曲存民卢坤李加纳梁颖西南大学农学与生物科技学院/油菜工程研究中心重庆400715 西南大学现代农业科学研究院重庆400715 贵州大学农业生物工程研究院/山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室贵州贵阳550025 江苏沿江地区农业科学研究所/南通市农业科学研究院江苏南通210014

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是我国重要的油料作物之一,具有较高的产量及营养价值。挖掘油菜广谱抗逆基因并深入探究其分子机制,对提高油菜抗逆性且保证产量及品质具有重要意义。MAPK级联(Mitogen-activated protein kinase cascades... 详细信息

甘蓝型油菜(Brassica napus L.)是我国重要的油料作物之一,具有较高的产量及营养价值。挖掘油菜广谱抗逆基因并深入探究其分子机制,对提高油菜抗逆性且保证产量及品质具有重要意义。MAPK级联(Mitogen-activated protein kinase cascades)是多种信号跨膜传递的交汇点,参与生长发育、生物及非生物胁迫应答等生物学过程。为了解甘蓝型油菜bnmapk1基因的生物学功能,本研究以bnmapk1超量表达(OE)和中油821(CK)油菜为材料进行数字基因表达谱分析。结果显示,与CK相比,650个基因在OE油菜中差异表达;其中上调表达基因243个,下调表达基因407个。GO注释共富集到生物学过程118条途径,其中18条与光合作用相关(包含77个差异表达基因);分子功能7条途径,包括草酸氧化酶活性、锰离子结合、氧化还原酶活性等;细胞组分38条途径,包括叶绿体、质体、类囊体等。KEGG分析结果表明,bnmapk1参与调控油菜光合作用、碳代谢、次生代谢物生物合成等14条过程。此外,利用实时荧光定量PCR验证8个候选基因在OE和CK油菜中的表达,其表达变化与测序结果基本一致。本研究结果为甘蓝型油菜bnmapk1在生长发育及光响应等生物学过程中的功能分析奠定了基础,也为农作物广谱抗逆遗传育种提供了理论依据。

关键词：甘蓝型油菜 bnmapk1 差异表达基因(DEGs) 光合作用数字基因表达谱测序(DGE-seq)

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Molecular mechanism of bnmapk1 regulating drought response and growth and development process in Brassica napus L.

Molecular mechanism of BnMAPK1 regulating drought response a...

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第十九届中国作物学会学术年会

作者： Zhen Wang Cun-min Qu Jia-na Li Kun Lu Ying Liang College of Agronomy and Biotechnology Southwest University/Chongqing Engineering Research Center for Rapeseed Academy of Agricultural Sciences Southwest University

MAPKs(Mitogen-activated protein kinases) cascade is a common pathway for multiple signal transmembrane transmission. After receiving signals, plants amplify signals to cells through phosphorylation of the MAPKs cascade to respond to stresses, with MAPKKKs(MAPK kinase kinases) transmitting signals to MKKs(MAPK kinases) and further to MAPKs. Our previous results indicated that the growth period of overexpression bnmapk1 transgenic rapeseed was significantly advanced, and the drought resistance was significantly improved. In this study, many molecular biological techniques were performed to identify bnmapk1-interacting drought-/growth-related proteins and upstream regulatory factors of bnmapk1. Our work revealed the molecular network of bnmapk1 in drought responses and growth and development processes. The main results are as follows: 1. The data of dehydration and PEG treatment to drought-sensitive and drought-resistant rapeseed showed that the transcription level of bnmapk1 was positively correlated with the resistance of drought in rapeseed. 2. 33 DEGs in water deprivation, ABA, water transport, and H2 O2/ROS metabolism process were obtained in RNA-Seq, which indicated that bnmapk1 may regulate drought response. 3. AtOE-bnmapk1 Arabidopsis showed significantly lower water loss rate and wilting degree than WT, indicating the overexpressing bnmapk1 in Arabidopsis can increase the drought resistance of plants. 4. The data of qPCR, RNA-Seq, and GUS signals in Probnmapk1:GUS Arabidopsis showed that the spatial and temporal expression of bnmapk1 was ubiquitous. 5. Combining Y2 H and Split-LUC assays with IP-MASS analysis, we found that bnmapk1 may interact with BnCYP20-3 and BnADH2 to improve the drought resistance of plants, and may also interact with BnCYP20-3 and BnTUF to advance the growth period of rapeseed. 6. In addition, Y1 H, Y2 H, and cis-transcriptional activation assays showed that the transcription of bnmapk1 was regulated by BnRHON1 and BnPIG3 to response to

关键词： Brassica napus bnmapk1 drought,growth and development MAPKs cascade

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bnmapk1对甘蓝型油菜耐高、低温的影响及其机理研究

BnMAPK1对甘蓝型油菜耐高、低温的影响及其机理研究

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作者：姚梦楠西南大学

学位级别：硕士

油菜作为世界第三大油料作物,是食用植物油的主要来源之一。我国油菜种植面积和产量可达全球三分之一,居世界首位,存在巨大的发展潜力,在国家食用油安全战略中起到至关重要的作用。然而,在油菜生育期常常会遇到高、低温等非生物胁迫,对... 详细信息

油菜作为世界第三大油料作物,是食用植物油的主要来源之一。我国油菜种植面积和产量可达全球三分之一,居世界首位,存在巨大的发展潜力,在国家食用油安全战略中起到至关重要的作用。然而,在油菜生育期常常会遇到高、低温等非生物胁迫,对油菜产量和品质造成影响。因此,培育油菜抗逆品种对提高油菜产量与品质有重要意义。促分裂原活化蛋白激酶（Mitogen-activated protein kinases,MAPKs）是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在真核生物中普遍存在,具有基本调节功能的进化保守信号模块。MAPK级联在多种植物中都能参与应对生物或非生物胁迫相关途径,广泛参与植物生长发育过程。在前期研究中,本实验室发现bnmapk1的超量表达提高了甘蓝型油菜对高温的耐受性。在此基础上,本研究以超量表达bnmapk1甘蓝型油菜与野生型中油821为试验材料,研究了低温、高温处理下bnmapk1的作用及其机理,主要结论如下:1、bnmapk1对低温处理下甘蓝型油菜生长及生理特性的影响对长势一致的超表达及野生型植株进行4℃低温处理,检测叶绿素、脯氨酸、可溶性糖、丙二醛含量和抗氧化酶活性（SOD、POD、CAT）的动态变化。结果表明,bnmapk1的超量表达可减缓叶叶绿素降解、促进脯氨酸和可溶性糖积累、降低丙二醛含量,一定程度上增强抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性。2、甘蓝型油菜耐低温的分子机理研究为进一步研究bnmapk1提高甘蓝型油菜耐低温的分子机理,取低温处理下的超表达和野生型材料相同部位叶片进行转录组测序。转录组分析表明,低温胁迫下,甘蓝型油菜可能通过激素信号转导等刺激响应途径、光合作用、有机物（次生物质）生物合成或代谢等途径来进行调节,它们可能相互交错,共同作用,即油菜在低温下的调节途径错综复杂。3、bnmapk1提高甘蓝型油菜低温抗性的分子机理研究转录组测序结果表明,超量表达bnmapk1能够更主动地应对低温,bnmapk1可能参与细胞、代谢、发育过程,包括光合途径调节、根系、器官生长发育调节、物质代谢、核糖体生物发生活性等,从而提高甘蓝型油菜耐冷性。同时,超量表达bnmapk1改变了45个基因的表达模式,显示bnmapk1在低温胁迫下可能促进油菜光合能力及光合产物转运、促进蛋白质降解及激蛋白合成,降低一些水解酶、转移酶、开花促进蛋白等合成或其他生物过程。此外,许多转录因子在超表达材料低温响应基因和两材料间遗传性差异表达基因中显著富集,包括超表达材料特异响应的161个转录因子基因和两材料间遗传差异表达的118个转录因子基因,它们分别集中在bHLH、AP2/ERF-ERF、WRKY、bZIP、GARP-G2-like、MYB、C2C2-GATA和AP2/ERF-ERF、MYB、WRKY、bHLH、HB-HD-ZIP、MYB-related、NAC家族中。表明低温下,bnmapk1蛋白可能对这些转录因子有调控作用,它们共同参与油菜的低温信号途径,相互作用,在油菜耐低温育种中可能具有利用价值。4、甘蓝型油菜耐高温的分子机理研究为进一步研究bnmapk1提高甘蓝型油菜耐热性的分子机理,将超表达和野生型油菜植株进行40℃高温处理,随后取相同部位叶片进行转录组测序。高温胁迫下,转录组测序发现:甘蓝型油菜中存在大量胁迫应答途径,包括代谢发育和刺激响应等方面,其中基础代谢起到重要作用。同时,核糖体、蛋白质合成、内质网中蛋白质加工、翻译等过程及途径起到重要作用。即高温下大量的蛋白合成、加工及代谢具有关键作用。5、bnmapk1提高甘蓝型油菜高温抗性的分子机理研究转录组测序发现,超量表达bnmapk1能够更主动地应对高温,包括代谢发育和刺激响应等方面,其中主要与有机物的合成相关。bnmapk1促进蛋白酶体在油菜响应高温时起作用,bnmapk1可能使蛋白质的代谢调控起到重要作用。同时,超量表达bnmapk1使211个基因的表达模式发生改变,发现bnmapk1可能抑制WRKY7（Bna A03g46550D）、WRKY33（Bna Cnng66020D）、WRKY33（Bna A04g22040D）的表达,同时促进早期光诱导蛋白（Bna A01g24440D）、DNA错配修复蛋白MSH1（Bna A07g05700D）的表达。此外,许多转录因子在超表达材料高温响应基因和两材料间遗传性差异表达基因中显著富集,包括超表达材料特异响应的334个转录因子基因和两材料间遗传差异表达的221个转录因子基因,它们分别集中在AP2/ERF-ERF、bHLH、MYB、bZIP、C2H2、GARP-G2-like和MYB、AP2/ERF-ERF、bHLH、NAC、HB-HD-ZIP、HSF家族。它们在高温处理下可能受到bnmapk1蛋白的调控,在甘蓝型油菜中共同参与高温响应途径,共同

关键词： bnmapk1 低温处理高温处理甘蓝型油菜转录组测序

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油菜bnmapk1调控BnABA1表达及蛋白互作影响ABA合成

油菜BnMAPK1调控BnABA1表达及蛋白互作影响ABA合成

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作者：朱冬鸣西南大学

学位级别：硕士

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是一类高度保守的Ser/Thr蛋白激酶,与植物的生长发育和逆境应答十分紧密。MAPK级联途径通过MAPKKK-MAPKK-MAPK依次磷酸化将胞外信号从上游信号分子传递至下游应答因子,... 详细信息

促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPKs)是一类高度保守的Ser/Thr蛋白激酶,与植物的生长发育和逆境应答十分紧密。MAPK级联途径通过MAPKKK-MAPKK-MAPK依次磷酸化将胞外信号从上游信号分子传递至下游应答因子,该通路在生物体内基因的表达、细胞的生长发育、信号传导等生物学过程中扮演极其重要的角色。脱落酸(ABA)在植物的生长发育过程,如种子的发育、休眠、萌发中具有重要作用,且还作为一种“逆境激素”参与各种生物与非生物逆境胁迫应答。植物MAPK级联途径参与了ABA介导的信号转导途径,具有重要作用,但MAPK级联和ABA合成途径的关系研究相对较少。ABA的生物合成起始于ABA1酶介导的玉米黄质环氧化作用。本课题组前期发现bnmapk1与BnABA1之间存在相互作用,并筛选到BnABA1A07和BnABA1C07与bnmapk1互作的区段。基于此,本研究深入解析了bnmapk1与BnABA1对ABA生物合成的调控机理。具体结果如下:***1与BnABA1互作磷酸化位点为酪氨酸(Tyr)、苏氨酸(Thr)双重磷酸化位点对与bnmapk1发生相互作用的BnABA1A07(575-630AA)和BnABA1C07(613-668 AA,命名为ABX)两个区段进行氨基酸序列比对发现,这两个区段97%序列相似仅有两个氨基酸残基不同,暗示BnABA1A07和BnABA1C07被bnmapk1磷酸化的氨基酸残基可能是一致的。运用PCR定点突变的方法分别将编码ABX的6、21、25位丝氨酸(Ser)的碱基,15、49、52位Thr的碱基,33位Tyr的碱基突变为不能磷酸化的丙氨酸(Ala)GCT。构建不同磷酸化位点突变体p GADT7/ABX/A重组表达载体,利用酵母双杂交技术筛选出ABX可能和bnmapk1互作存在的两个磷酸化位点ABX-Tyr33与Thr52。将ABX-Tyr33和Thr52同时突变为Ala,构建双磷酸化位点双突变体p GADT7/ABX-Tyr33-Thr52/A重组表达载体,酵母双杂最终得出bnmapk1能够磷酸化ABX氨基酸序列的第33位Tyr和第52位Thr双重磷酸化位点,即bnmapk1与BnABA1互作磷酸化位点为BnABA1A07第607位点的Tyr残基和第626位点的Thr残基,BnABA1C07第645位点的Tyr残基和第664位点的Thr残基。***1差异性介导ABA生物合成和分解代谢途径基因表达促进ABA积累对超量表达植株(OEbnmapk1)与野生型植株(中油821)转录组测序分析,筛选出超量表达植株OEbnmapk1植物ABA合成途径有2个上调表达基因ABA1和NCED3;信号转导途径有6个上调表达基因PYL4、PYL6、PYR1、PYR6、HAI1、HAI2,3个下调表达基因PYL2、ABF1和AREB3;分解代谢途径有2个上调表达基因CYP707A1、CYP707A2。测量正常生长情况下超量表达植株OEbnmapk1的ABA含量显著高于WT植株,说明bnmapk1通过调控BnABA1的基因表达提高植物内源ABA的含量。结果表明bnmapk1在上调ABA生物合成途径的关键酶基因BnABA1和BnNCED3的表达促进ABA合成的同时,也会上调ABA分解代谢CYP707A家族BnCYP707A1和BnCYP707A2的基因表达促进ABA分解,从ABA合成及分解代谢动态平衡决定ABA的水平来看,当ABA合成水平维持在较高状态时,ABA分解代谢水平也会持续提高,以此来维持植物内源ABA的动态平衡。***可以激活bnmapk1并对BnABA1存在负反馈调节在外施ABA(浓度为100μM)条件下,分别于0、3、6、9、12、24 h测定超量表达植株OEbnmapk1、干扰表达植株i MAPK1与WT叶片中ABA含量,BnABA1A07、BnABA1C07以及bnmapk1的基因表达水平。结果表明:外源ABA能激活bnmapk1的基因表达,并且超量表达的bnmapk1使得植株对ABA信号的响应更加迅速,ABA信号水平的提升更加显著。外施ABA处理下超量表达植株OEbnmapk1的内源ABA含量与BnABA1的基因表达量并不完全同步。ABA合成具有自我调节能力,当外施ABA使植物内源ABA信号水平提高时,可以通过负反馈调节抑制ABA合成途径关键酶BnABA1的基因表达来调节ABA的积累。当植物内源ABA信号强度维持在较高的一个水平时,ABA分解代谢酶的活性增强,此时相应的ABA合成的水平也应维持在较高的水平从而达到ABA合成与分解代谢的动态平衡。***1介导ABA信号转导途径调控ABA1基因表达利用plant

关键词： bnmapk1 BnABA1 磷酸化 ABA合成甘蓝型油菜

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甘蓝型油菜MAPK1在损伤和病原菌胁迫下的表达模式分析

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中国农业科学 2013年第20期46卷 4388-4396页

作者：陆俊杏陆奇丰张凯柴友荣李加纳钱伟吕俊卢坤梁颖西南大学农学与生物科技学院/重庆市油菜工程技术研究中心/南方山地农业教育部工程研究中心

【目的】分析bnmapk1组织特异性表达特征,探究其在损伤和病原菌胁迫下的特征及参加的信号途径。【方法】在电子克隆的基础上,克隆bnmapk1的启动子序列。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测bnmapk1的诱导表达特征。【结果】从甘蓝型油菜... 详细信息

【目的】分析bnmapk1组织特异性表达特征,探究其在损伤和病原菌胁迫下的特征及参加的信号途径。【方法】在电子克隆的基础上,克隆bnmapk1的启动子序列。利用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测bnmapk1的诱导表达特征。【结果】从甘蓝型油菜中克隆了MAPK1的启动子序列,发现它含有多个激素响应元件和逆境胁迫响应元件。还发现植物激素茉莉酸甲酯(MeJA)、水杨酸(SA)、脱落酸(ABA)和过氧化氢(H2O2),及损伤(wound)和核盘菌(sclerotinia sclerotiorum)均能在转录水平上激活bnmapk1。甘蓝型油菜在损伤和接种核菌盘后,JA信号途径标志基因PDF1.2的表达量被诱导上升,而SA信号途径标志基因PR-1被抑制,推测甘蓝型油菜可能是通过茉莉酸(jasmonic acid,JA)信号途径响应损伤和病原菌入侵。【结论】甘蓝型油菜MAPK1受多种植物激素和胁迫的诱导,并且其启动子中含有多个激素响应元件和逆境胁迫响应元件,可能MAPK1在植物体抵抗外界多种胁迫中起重要作用,并且甘蓝型油菜可能是通过JA信号途径对损伤和病原菌入侵做出响应。

关键词：甘蓝型油菜 bnmapk1 损伤病原菌信号途径

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MAPK1 enhanced stress resistance and promoted growth in Brassica napus

MAPK1 enhanced stress resistance and promoted growth in Bras...

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中国作物学会油料作物专业委员会第八次会员代表大会暨学术年会

作者： WANG Zhen ZHANG Xiao-li YAO Meng-nan LIANG Ying LI Jia-na Chongqing Engineering Research Center for Rapeseed of Agronomy and Biotechnology Southwest University

Mitogen-activated protein kinase(MAPK) cascades are common signal transduction pathway in all eukaryotes,like yeast,fungi,insects,nematodes,mammals and especially plants,constituted by MAPKKKs,MAPKKs,and MAPKs which form the terminal components of prototypical sequential *** this study,bnmapkl gene from C group was cloned to research its molecular function and metabolic *** with wild type plants,resistance of overexpression plants had significantly enhanced to drought,high temperature ***,photosynthetic rate was also improved obviously in overexpression *** addition,growth stages of *** were obviously delayed by inhibiting the expression of ***-seq GO analysis mainly focused on biosynthetic process,amide biosynthetic process and oreganonitrogen compound biosynthetic process,cellular biosynthetic process.Y1 H and Y2 H assays indicated that bnmapk1 involved in abscisic acid metabolic and biosynthetic process,sugar transporter,cell death,xylem cell specification and so *** results provide a new perspective on themolecular mechanisms of bnmapk1 in biotic and abiotic response and growth regulation.

关键词： bnmapk1 stress growth Y1H Y2H RNA-seq

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