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油菜bnatg8-拟南芥转基因系的建立及其自噬功能的研究

油菜BnAtg8-拟南芥转基因系的建立及其自噬功能的研究

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作者：秦英兰州大学

学位级别：硕士

自噬(Autophagy,AP)是一种重要的细胞分子生物学活动,通过对受损或死亡的细胞、细胞器以及生物大分子的降解和再利用,在维持细胞的静态平衡、发育模式重构、自体免疫以及抵抗逆境胁迫过程中发挥重要的用。自噬的早期研究主要集中于酵母... 详细信息

自噬(Autophagy,AP)是一种重要的细胞分子生物学活动,通过对受损或死亡的细胞、细胞器以及生物大分子的降解和再利用,在维持细胞的静态平衡、发育模式重构、自体免疫以及抵抗逆境胁迫过程中发挥重要的用。自噬的早期研究主要集中于酵母,随后扩展到动物细胞,相比而言,植物自噬的研究起步较晚,并且主要集中在离体培养的细胞,而在个体水平上的研究相对较少。本研究利用携带GFP标签和甘蓝型油菜自噬相关基因Atg8(Bn Atg8)的表达载体,通过农杆菌介导的花序浸染法转化野生型拟南芥,得到了相应Bn Atg8转基因系,并通过形态学比较、GFP和MDC荧光检测以及RT-PCR等技术,分析比较了拟南芥野生型、bnatg8转基因系以及自噬atg5和atg7突变体在正常生长和逆境胁迫条件下在形态学、生理生化、细胞以及分子生物学中的差异,探究了自噬在植物生长发育以及抗逆活动中的功能。主要结果如下:(1)通过转化及PCR鉴定,成功获得了3个Bn Atg8-拟南芥转基因纯合系,其中两个GFP和bnatg8二者都有表达(GFP-Bn Atg8转基因系),另一个只Bn Atg8表达(bnatg8转基因系)。(2)通过半定量RT-PCR法分析比较了20、40、60天苗龄的转基因拟南芥叶片以及50天苗龄植株的叶片、花序茎及果荚中Bn Atg8基因的转录水平,结果发现,不同苗龄转基因系叶片中bnatg8基因的转录水平存在显著的差异,其中60天的转录水平高于40和20天的转录水平,40天的转录水平又高于20天的转录水平(60d>40>d20d).此外,在叶片中的表达水平高于在花序茎和果荚中的表达水平,在花序茎中的表达水平又高于在果荚中的表达水平(叶片>花序茎>果荚)。(3)激光共聚焦显微观察转基因系根尖GFP荧光分布发现,绿色荧光广泛分布在根尖的各个部位,荧光呈点状分布,其荧光强度从分生区到伸长区至根冠依次减弱。观察转基因植株花粉形成过程中不同时期中细胞内GFP荧光发现,荧光也呈点状分布,并且在四分体时期的荧光强度要高于小孢子。(4)自噬体(泡)特异染色剂MDC染色后荧光显微镜观察发现,转基因植株和野生型根尖所有区域都显示MDC荧光,但转基因根尖的荧光强度高于野生型根尖的荧光强度。(5)观察分析转基因系、野生型和自噬突变体生长过程中的表型发现,在初生根和下胚轴的生长方面,转基因系的生长速率大于野生型的生长速率,而野生型的生长速率又大于自噬突变体的生长速率;在叶面积方面,转基因型的最大,为野生型次之,自噬突变体的最小。在抽薹期方面,转基因系和自噬突变体的相对于野生型的都明显提前,生长周期缩短,其中自噬缺失突变体的变化更为明显。此外,与野生型相比,转基因系的株高和种子产量没有明显的改变,而自噬突变体的株高明显变矮,单株种子产量也明显降低。(6)生理学研究发现:在饥饿胁迫下,野生型和转基因系的萌发率无明显差异,但是两个自噬突变体的萌发率要远远低于野生型;在盐胁迫下,在种子萌发率方面,转基因系明显地高于自噬突变体,但又低于野生型。以上结果表明,油菜bnatg8的表达对拟南芥的生长发育,耐环境胁迫的能力以及自噬活动的强度有明显的影响。这种情况表明,自噬在调节植物生长发育方面也可能发挥一定的作用。这种作用对于植物的生长发育来说既有积极的的一面也有消极的一面,只有适量强度的自噬才利于植物的生长发育。

关键词：植物自噬 bnatg8 atg5 atg7 盐胁迫饥饿胁迫早衰

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油菜-bnatg8转基因系的建立与分析

油菜-BnAtg8转基因系的建立与分析

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作者：陈昕兰州大学

学位级别：硕士

自噬(Autophagy, AP)是真核生物在正常的生长发育过程中,或者遭受生物、非生物胁迫时细胞质组分降解-再利用的方式之一,对于维持细胞的稳态平衡、发育模式的重构、自体免疫以及抗氧化胁迫等方面都有着重要的作用。此外,有研究表明自噬... 详细信息

自噬(Autophagy, AP)是真核生物在正常的生长发育过程中,或者遭受生物、非生物胁迫时细胞质组分降解-再利用的方式之一,对于维持细胞的稳态平衡、发育模式的重构、自体免疫以及抗氧化胁迫等方面都有着重要的作用。此外,有研究表明自噬还与植物的抗逆性相关。参与自噬过程的基因被称为自噬相关基因(Autophagy-related gene, ATG), ATG8是ATG基因家族重要的成员之一,与自噬体的形成密切相关。此前,本课题组在雄性可育系(Male fertility, MF)和不育系(Male sterile, MS)的油菜(Brassica napus L.)小孢子母细胞中发现存有类似植物自噬体(泡)结构,并且克隆出了ATG8基因(命名为bnatg8)。本实验将bnatg8和bnatg8-GFP分别导入甘蓝型油菜MF和MS系基因组建立了相应的bnatg8过表达系,旨在通过对这些转基因系的形态学、遗传学、细胞生物学和分子生物学分析,进一步确认小孢子母细胞中自噬体(自噬现象)的存在及其形成机制。主要研究结果如下：(1)以油菜的下胚轴为受体,结合农杆菌介导的遗传转化和离体诱导植物再生,经过PCR鉴定,共得到8个MF-bnatg8(MFA1-8)、10个MF-bnatg8-GFP (MFAG1-10)、11个MS-bnatg8(MSA1-11)和11个MS-bnatg8-GFP(MSAG1-11)过表达转基因系。(2)在含有潮霉素平板上对以上转基因系T1代进行筛选,共得到4个具单拷贝插入的转基因杂合系(MFAG-2、MFAG-3、MSA-7和MSAG-7)。与MF相比,MFAG-2的花序茎明显变细,MFAG-3的果荚数明显减少,MFAG-2和MFAG-3的分支数明显减少。与MS相比,MSA-7和MSAG-7分支数明显减少。(3) RT-PCR半定量检测发现,在以上4个转基因系当中,bnatg8转基因均有表达,表达水平都低于内源Atg8基因的表达水平。(4)激光共聚焦显微镜观察发现,MFAG-2和MSAG-7的幼苗根尖均显示GFP荧光信号,但荧光信号定位有所不同：在MFAG-2中主要集中在分生区和伸长区,而在MSAG-7中主要集中在分生区和根冠区。观察子叶原生质体发现GFP信号主要分布在叶绿体周围。(5)用自噬体特异性染色剂MDC对MFAG-2和MSAG-7幼苗根尖染色后用激光共聚焦显微镜观察发现,在MFAG-2中MDC信号主要分布在分生区和伸长区,而在MSAG-7中MDC信号主要分布在分生区和根冠部位。MDC与GFP信号出现位置基本一致。MDC信号定位和强度在转基因和野生型根尖中无明显区别。(6)研究MFAG-2和MSAG-7转基因系的抗盐性发现,在盐(NaCl)胁迫条件下(150mmol,12h光照/12h黑暗,7d),野生型(MF、MS)和转基因系初生根和下胚轴的生长速率与对照组相比都明显下降,但是转基因系降低的程度明显小于野生型。(7)分析MFAG-2和MSAG-7转基因系对饥饿胁迫的响应发现,在不加碳(蔗糖)的培养基上培养7天后,初生根和下胚轴伸长的速率在野生型和转基因系之间无明显差异。以上结果说明,bnatg8的过表达可以提高油菜的抗盐性,也表明自噬与植物的抗盐性可能有关。因时间关系,仅对转基因系的表型,生理生化和分子生物学特征进行了初步分析。对于转基因系内bnatg8-GFP在花粉母细胞中的情况有待进一步研究。

关键词：自噬 bnatg8 油菜 MDC GFP

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