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利用家蚕生物反应器生产重组腺相关病毒（raav）载体

利用家蚕生物反应器生产重组腺相关病毒（rAAV）载体

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作者：常鹏飞江苏大学

学位级别：硕士

腺相关病毒(adeno-associated virus,aav)在基因治疗领域具有广阔的应用前景,它具有非致病性、低免疫原性、广泛的组织趋向性以及可以长期稳定地表达目的基因等优势。但是重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,r aav)载... 详细信息

腺相关病毒(adeno-associated virus,aav)在基因治疗领域具有广阔的应用前景,它具有非致病性、低免疫原性、广泛的组织趋向性以及可以长期稳定地表达目的基因等优势。但是重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,r aav)载体的产量和生产成本限制了其在基因治疗上的进一步发展。目前已开发出了多种r aav生产方式,包括腺病毒生产系统、疱疹病毒生产系统、昆虫细胞杆状病毒生产系统等。利用重组杆状病毒表达系统在昆虫细胞中生产r aav是一种高效灵活的生产方式,当前主要利用苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,Ac MNPV)表达系统在Sf9细胞中生产r aav载体。为了建立一个更高效、低成本的生产体系,以家蚕生物反应器为平台,利用家蚕核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus,Bm NPV)表达系统来生产一种重组嵌合型r aav2/HBo V1载体。aav2和HBo V1(Human Bocavirus type-I)都属于细小病毒科,以HBo V1的衣壳蛋白包装aav2的基因组可以形成一种属间交叉的假包装嵌合型重组病毒r aav2/HBo V1,它不仅具有HBo V1的组织趋向性,而且具备HBo V1衣壳的基因装载能力(～5.4kb),可以为肺部疾病的基因治疗提供一个针对性更强的独特嵌合型病毒载体。本实验中,首先鉴定了杆状病毒转移载体p Fast Bac-aav2itr-e GFP和p Fast Bac-aav2Rep-HBo V1Cap,通过杆粒筛选和家蚕细胞系转染获得两个重组家蚕杆状病毒:r Bm NPV/aav2itr-e GFP和r Bm NPV/aav2Rep-HBo V1Cap。细胞水平连续的共感染实验表明,e GFP、Rep及Cap蛋白均可以稳定表达至P4-P5代。直接注射两个P3 r Bm NPV共感染5龄起蚕的家蚕幼虫(菁松-镇江株),72h后观察到e GFP在幼虫体内高效表达。同时,解剖已感幼虫发现,脂肪体和血淋巴中蛋白表达量最高。另外,通过直接注射重组杆状病毒来共感染的家蚕蚕蛹,在感染48h后就已经出现蛋白表达,表明蚕蛹中蛋白的表达效率高于幼虫。raav的纯化方法对载体的产量和质量有很大的影响。密度梯度超速离心是实验室纯化r aav的主要方法之一,适用于所有r aav血清型,并且有利于去除空壳病毒。比较了氯化铯(Cs Cl)密度梯度超速离心与碘克沙醇(iodixanol)密度梯度超速离心纯化r aav2/HBo V1的效果,发现碘克沙醇法的纯化质量要优于Cs Cl法,不仅用时更短,且分离纯度远高于Cs Cl法。针对纯化的r aav2/HBo V1进行了定量和转导活性分析。根据q PCR定量得知,Bm N细胞样品中的r aav2/HBo V1的平均产量约为2×10VG/cell,每只幼虫中的平均产量为2.5×10VG,每颗蚕蛹的平均产量可达到4.6×10VG。结果表明r aav2/HBo V1在家蚕生物反应器中可实现高效生产,能够满足大规模低成本生产r aav载体的要求。通过透射电子显微镜(TEM)观察到,纯化的r aav2/HBo V1病毒空壳率仍然很高,表明这一生产系统仍需要进一步优化,如增加表达对HBo V1病毒衣壳包装很重要的NP1蛋白;或调整aav2基因组与HBo V1衣壳基因的构成比例等。在人支气管上皮细胞(16HBE)中观察到纯化的r aav2/HBo V1具备一定的转导活性,但荧光表达较低,推测由于r aav2/HBo V1并不特异感染16HBE细胞造成的。气液界面上培养的极化的人呼吸道上皮细胞(HAE-ALI)是野生型HBo V1感染以及r aav2/HBo V1载体体外转导的最佳细胞系,之后将尝试利用流式细胞荧光分选技术(FACS)更准确地在HAE-ALI细胞中检测r aav2/HBo V1的转导活性。总之,我们建立了一个用于在家蚕杆状病毒表达系统中生产新型嵌合型r aav2/HBo V1载体的BEV/昆虫生产系统,并总结出较高效的载体纯化方法。新系统可以成功地将r aav2基因组假包装在HBo V1衣壳中形成一种具转导活性、可特异治疗人类肺部疾病的r aav2/HBo V1载体。这项工作展示出了家蚕-昆虫生物反应器在r aav载体的规模化生产上具有很大的应用潜力,为r aav载体的生产提供了新的思路。

关键词： raav2/HBoV1 家蚕杆状病毒表达系统家蚕蚕蛹 bmnpv/aav2Rep-HBoV1Cap bmnpv/aav2itr-egfp

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