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广东省遗传学会第九届代表大会暨学术研讨会

作者：谢昆田玲郭新雨 Kang Li Jianping Li Xiaojuan Deng Zhijun Huang Sheng Li Qingyou Xia Qingrong Li 杨婉莹曹阳 Laboratory of Insect Molecular Biology and Biotechnology Guangdong Provincial Key Laboratory of Agro-animal Genomics and Molecular BreedingCollege of Animal ScienceSouth China Agricultural University Depatment of Life science and technology HongHe University Key Laboratory of Insect Developmental and Evolutionary Biology Institute of Plant Physiology and EcologyShanghai Institutes for Biological SciencesChinese Academy of Sciences State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology

细胞自噬(autophagy)和凋亡(apoptosis)在生物遗传发育中,包括细胞胁迫、组织重构和人类疾病等发挥重要作用。20羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)激素和饥饿信号诱导昆虫细胞发生高水平自噬(PCDⅡ)和凋亡(PCDⅠ)的程序性细胞死亡(PCD... 详细信息

细胞自噬(autophagy)和凋亡(apoptosis)在生物遗传发育中,包括细胞胁迫、组织重构和人类疾病等发挥重要作用。20羟基蜕皮酮(20-hydroxyecdysone,20E)激素和饥饿信号诱导昆虫细胞发生高水平自噬(PCDⅡ)和凋亡(PCDⅠ)的程序性细胞死亡(PCD)。我们先前的研究发现,在家蚕变态发育时期的PCD进程中20E诱导中肠发生的细胞自噬先于凋亡(Apoptosis,2012)。哺乳动物的研究揭示,自噬蛋白质Atg5和Beclin-1(Atg6)的截短型分子tAtg5-N(24kDa)和Beclin-1-C(35 kDa,37 kDa)具有在饥饿诱导的细胞自噬中触发凋亡的分子开关功能。本文在前文研究基础上进一步揭示:(1)20E和PBS饥饿信号诱导家蚕Bm-12细胞的自噬先与凋亡4h,20E诱导的自噬响应快于和强于PBS信号,而PBS诱导的凋亡响应则早于和强于20E的诱导;(2)在Bm-12细胞中,通过RNAi bmatg5和bmatg6,过表达正常型/位点缺失突变型的bmatg5和bmatg6,bmatg5(31kDa)和bmatg6(49kDa)加强了2种信号诱导Bm-12细胞自噬的水平,其截短型分子bmatg5-N(24kDa)、bmatg6-C1(35kDa)和bmatg6-C2(37kDa)参与了这2种信号诱导细胞自噬触发凋亡的PCD进程;(3)过表达bmatg5(31kDa)和bmatg6(49kDa)的各种截短型分子于Bm-12细胞,证明只有bmatg5-N、bmatg6-C1和bmatg6-C2这3种截短型分子可直接诱导凋亡早期信号Cyt C由线粒体到细胞质的释放和凋亡信号Caspase-3表达活性的增强,证明这3种截短型分子具有在自噬细胞中诱导凋亡的功能。通过这些证据链,首次在昆虫揭示家蚕bmatg5和bmatg6的截短型分子bmatg5-N、bmatg6-C1和bmatg6-C2介导了20E和饥饿诱导的细胞自噬中的凋亡诱导,解释了昆虫变态发育的组织重构中20E激素诱导幼虫组织发生自噬先于凋亡的PCD本质。

关键词：自噬蛋白质(autophagy related proteins) bmatg5 bmatg6 20羟基蜕皮酮(20E) 饥饿细胞自噬(autophagy) 细胞凋亡(apoptosis) Bm-12细胞家蚕(Bombyxmori)

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BmCalpains are involved in autophagy and apoptosis during metamorphosis and after starvation in Bombyx mori

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Insect Science 2018年第3期25卷 379-388页

作者： Hui-Yu Yi Wan-Ying Yang Wen-Mei Wu Xing-Xia Li Xiao-Juan Deng Qing-Rong Li Yang Cao Yang-Jin Zhong Ya-Dong Huang Guangdong Provincial Key Laboratory ofAgro-animal Genomics and Molecular Breeding/Guangdong Provincial Sericulture and Mulberry Engineering Research Center College of Animal Science South China Agricultural University Guangzhou China College of Life Science and Technology Jinan University Guangzhou China The Sericultural and Agri-Food Research Institute of the Guangdong Academy of Agricultural Sciences Guangzhou China

Apoptosis and autophagy play crucial roles during Bombyx mori metamorphosis and in response to various adverse conditions, including starvation. Recently, calpain, one of the major intracellular proteases, has been reported to be involved in apoptosis and autophagy in mammals. bmatg5 and bmatg6 have been identified to mediate apoptosis following autophagy induced by 20-hydroxyecdysone and starvation in B. mori. However, B. mori calpains and their functions remain unclear. In this study, phylogenetic analysis of calpains from B. mori, Drosophila melanogaster and Homo sapiens were performed and the results showed distinct close relationships of BmCalpain-A/B with DmCalpain- A/B, BmCalpain-C with DmCalpain-C, and BmCalpain-7 with HsCalpain-7. Then, the expression profiles of BmCalpains were analyzed by quantitative real-time polymerase chain reaction, and results showed that expression ofBmCalpain-A/B, BmCalpain-C and BmCalpain-7 was significantly increased during B. mori metamorphosis and induced in the fat body and midgut of starved larvae, which is consistent with the expression profiles ofbmatgS, bmatg6 and BmCaspase-1. Moreover, the apoptosis-associated cleavage of bmatg6 in Bm-12 cells was significantly enhanced when BmCalpain-A/B and BmCalpain-7 were induced by starvation, and was partially inhibited by the inhibitor of either calpain or caspase, but completely inhibited when both types of inhibitors were applied together. Our results indicated that BmCalpains, including BmCalpain-A/B, -C and -7, may be involved in autophagy and apoptosis during B. mori metamorphosis and after starvation, and may also contribute to the apoptosis-associated cleavage of bmatg6.

关键词： apoptosis autophagy bmatg6 Bombyx mori calpain starvation

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BmCaspase-8-like在细胞自噬中的功能及作用机制研究

BmCaspase-8-like在细胞自噬中的功能及作用机制研究

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作者：孙畅西南大学

学位级别：硕士

细胞自噬是指在压力条件下,细胞受损的细胞器、蛋白聚集物以及入侵的病原微生物被包裹在一种新生的双层膜结构内,运送至溶酶体被降解为大分子物质,最终被细胞重新利用的过程。细胞自噬参与并调节众多的生理过程,包括发育、免疫、癌症、... 详细信息

细胞自噬是指在压力条件下,细胞受损的细胞器、蛋白聚集物以及入侵的病原微生物被包裹在一种新生的双层膜结构内,运送至溶酶体被降解为大分子物质,最终被细胞重新利用的过程。细胞自噬参与并调节众多的生理过程,包括发育、免疫、癌症、衰老等。家蚕是一种重要的具有经济价值的鳞翅目模式生物,一生经历卵、幼虫、蛹、成虫四个时期。家蚕在变态时期,体内部分器官发生退化,细胞自噬与细胞凋亡在此过程中发挥着至关重要的作用。本文基于BmCasp8L的时空表达特征,通过定量分析自噬、凋亡相关基因的时期表达情况,确定在后部丝腺与中肠退化时期BmCasp8L的蛋白表达峰值先于bmatg8-PE;通过在细胞水平的过表达与干涉实验证明其促进细胞自噬的作用;通过Western Blotting、共聚焦观察等实验阐述其抑制BmDREDD对于bmatg6的切割从而促进细胞自噬的分子机制。本研究系统研究了家蚕BmCasp8L基因在细胞自噬中的功能及调控机制,为揭示家蚕及其他鳞翅目昆虫细胞自噬调控机制提供了理论依据。主要研究结果如下:1、BmCasp8L促进饥饿诱导的细胞自噬BmCasp8L具有两个串联的DED结构域,并通过其DED结构域与BmDREDD结合形成淀粉样蛋白聚集体抑制BmDREDD所诱导的细胞凋亡。时期表达谱显示Bmcasp8l在预蛹期后部丝腺高量表达,进一步分析发现,Bmcasp8l与自噬标志分子bmatg8在吐丝至化蛹时期后部丝腺具有相同的表达模式。自噬相关基因bmatg5、bmatg6与凋亡相关基因Bmdredd、Bmcaspase-1在吐丝至化蛹时期均有不同程度的上调。在后部丝腺与中肠退化时期,BmCasp8L的蛋白表达峰值出现在五龄末期,而bmatg8-PE的峰值则出现在吐丝末期。通过EBSS溶液培养家蚕BmE细胞的建立饥饿诱导自噬模型,利用Western Blotting实验证明当过表达BmCasp8L时,bmatg8-PE显著增多;当干涉BmCasp8L时,bmatg8-PE显著减少。在BmE细胞中表达EGFP-bmatg8,通过共聚焦荧光显微镜观察发现,过表达BmCasp8L时,含有绿色荧光点状聚集物的细胞数显著增多;当干涉BmCasp8L时,显著减少。Lyso-Tracker Red染色实验证明过表达BmCasp8L能显著增强细胞染色。2、BmCasp8L通过抑制BmDREDD切割bmatg6促进细胞自噬在自噬诱导过程中加入自噬抑制剂Baf A1与蛋白酶体抑制剂MG-132,我们检测到Baf A1有效地抑制了BmCasp8L在自噬过程中的降解,证明BmCasp8L发生自噬性降解。共聚焦荧光显微镜观察显示在自噬发生后,BmCasp8L与bmatg8发生荧光共定位,证明BmCasp8L聚集于自噬小体。Western Blotting实验表明,BmCasp8L显著抑制了bmatg6在饥饿诱导细胞自噬后的切割。鉴于bmatg6存在Caspase-8的酶切位点,我们将BmDREDD加入转染体系后发现,BmDREDD能够促进bmatg6的切割,而这种促进作用被BmCasp8L所抑制。

关键词：家蚕细胞自噬 BmCaspase-8-like bmatg8 bmatg6

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