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类鼻疽菌诱导宿主细胞线粒体自噬促进其胞内增殖的机制研究

类鼻疽菌诱导宿主细胞线粒体自噬促进其胞内增殖的机制研究

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作者：夏瑀培中国人民解放军陆军军医大学

学位级别：硕士

类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei,***）简称类鼻疽菌,是一种革兰阴性短杆菌,所致疾病称为类鼻疽。类鼻疽作为一种人畜共患的热带医学传染病,主要流行于澳大利亚北部、东南亚等地区,我国的广东、海南、香港、台湾等地也... 详细信息

类鼻疽伯克霍尔德菌（Burkholderia pseudomallei,***）简称类鼻疽菌,是一种革兰阴性短杆菌,所致疾病称为类鼻疽。类鼻疽作为一种人畜共患的热带医学传染病,主要流行于澳大利亚北部、东南亚等地区,我国的广东、海南、香港、台湾等地也是主要疫区,其临床表现为急性细菌性肺炎、弥漫性内脏脓肿和局部感染,伴随败血症时死亡率可高达40%。目前对于类鼻疽尚无特效药和有效疫苗,加之病程进展较快和疾病复发率高的治疗难点,因此深入研究其感染致病机制,将为类鼻疽的防控提出新的思路。线粒体自噬作为机体维持细胞稳态的重要调控手段,通过清除受损线粒体和其产生的副产物活性氧从而降低其可能引起的机体损伤。近年来越来越多研究发现病原体通过主动诱导线粒体自噬操纵宿主抗感染免疫反应,从而达到持续性感染的目的。作为一种兼性胞内寄生菌,类鼻疽菌感染能诱导线粒体自噬且在实现其感染和定植中发挥重要作用,但具体机制尚不清楚。为此,本论文重点探究了类鼻疽菌感染宿主细胞后诱导的线粒体自噬促进其胞内存活的生物学意义,并在此基础上从病原体与宿主互作层面,初步探讨了类鼻疽菌诱导线粒体自噬的分子机制。【研究目的】（1）探讨类鼻疽菌诱导宿主细胞线粒体自噬的生物学意义;（2）从病原体-宿主互作层面初步揭示类鼻疽菌诱导线粒体自噬的分子机制。【研究方法】（1）构建类鼻疽菌感染巨噬细胞模型,使用透射电镜、激光共聚焦显微镜观察线粒体超微结构;通过流式细胞术和全波长酶标仪检测线粒体功能障碍;通过q-PCR、Western-blot、电镜、激光共聚焦显微镜分析类鼻疽菌感染后诱导线粒体自噬的发生;胞内生存实验和流式细胞术分别检测类鼻疽菌的胞内增殖和活性氧产生。（2）采用siRNA、q-PCR、Western-blot、流式细胞术检测分析经典自噬途径与类鼻疽菌诱导的线粒体自噬的关系,以及对细菌胞内存活的影响;通过深度测序筛选宿主差异基因表达,分析类鼻疽菌感染宿主细胞前后内质网应激信号通路变化;生信分析预测筛选类鼻疽菌引起线粒体自噬的关键分子,采用同源重组技术构建其敲除菌株,并通过q-PCR、激光共聚焦观察其感染RAW264.7后线粒体自噬的改变。【研究结果】（1）类鼻疽菌感染后宿主细胞线粒体发生明显的结构形态损伤和功能严重受损、类鼻疽菌感染巨噬细胞后双层膜性囊泡结构包裹线粒体的细胞数量明显增多,感染细胞线粒体自噬小体数量明显增多,mtDNA拷贝数明显降低,线粒体分子伴侣蛋白HSP60和内膜蛋白TIM23表达明显下调。（2）类鼻疽菌通过诱导线粒体自噬促进宿主细胞内线粒体活性氧清除,增强线粒体自噬能提高巨噬细胞内类鼻疽菌载量,且类鼻疽菌诱导的线粒体自噬是通过减少活性氧来促进其胞内增殖的。（3）类鼻疽菌诱导的宿主细胞线粒体自噬依赖经典自噬途径,抑制宿主细胞ATG7、Beclin 1表达可干扰类鼻疽菌诱导的线粒体自噬过程,导致受损线粒体无法被清除并在胞内蓄积。（4）宿主差异表达基因筛选发现类鼻疽菌感染细胞后内质网应激信号通路表达均出现升高,细胞内质网应激激活。（5）生物信息学筛选类鼻疽菌Ⅲ型分泌系统针尖蛋白bipd为类鼻疽菌诱导线粒体自噬的关键候选靶标,Δbipd敲除株感染RAW264.7后mtDNA清除降低,诱导线粒体自噬能力明显受抑。【主要结论】（1）类鼻疽菌感染诱导宿主细胞线粒体自噬,线粒体结构和功能严重受损,并通过诱导线粒体自噬清除宿主细胞内活性氧来促进其胞内增殖;（2）类鼻疽菌感染宿主细胞内质网应激激活可能是线粒体自噬的上游调控因素,其Ⅲ型分泌系统针尖蛋白bipd可能介导了类鼻疽菌诱导的宿主细胞线粒体自噬。【创新性和研究意义】我们报道了类鼻疽菌可以诱导宿主细胞线粒体自噬现象及其通过清除线粒体活性氧有利于类鼻疽菌在胞内增殖的生物学意义,从病原体-宿主互作界面探讨了类鼻疽菌诱导线粒体自噬的分子机制,揭示了经典自噬和内质网应激在类鼻疽菌诱导的线粒体自噬中的调控作用,初步鉴定了bipd作为类鼻疽菌Ⅲ型分泌系统针尖蛋白可能是该菌调控线粒体自噬的重要分子。该研究为深入阐明类鼻疽菌感染机理、制订类鼻疽防治的新策略提供了一定的理论和实验依据。

关键词：类鼻疽菌线粒体自噬内质网应激 bipd

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