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Increased resistance to apoptosis during differentiation and syncytialization of bewo choriocarcinoma cells

Advances in Bioscience and Biotechnology 2012年第6期3卷 805-813页

作者： Bih-Rong Wei Chuan Xu Neal S. Rote Department of Reproductive Biology Case Western Reserve University School of Medicine and Department of Obstetrics and Gynecology University Hospitals Case Medical Center Cleveland OH USA

Transition from mononuclear villous cytotrophoblast into multinuclear syncytiotrophoblast in the human placenta is accompanied by changes in apoptosis-related proteins and an apparent increased resistance to induced apoptosis. We investigated the specific nature and timing of changes in Bcl-2, Bax, p53, and caspases 3 and 8 in forskolin-treated bewo choriocarcinoma cells, a model for villous cytotrophoblast differentiation. bewo cells were treated with forskolin or vehicle alone for up to 72 h and evaluated at 24 h intervals for syncytialization and quantitative expression specific apoptosis-related proteins and mRNAs. Syncytialization was quantified using fluorescent staining of intercellular membranes and enumeration of the percentage of nuclei in multinucleate cells, and differential localization of apoptosis-related proteins to multinuclear or mononuclear cells was determined by quantitative immunofluorescence. Forskolin treatment for up to 72 h resulted in 80% syncytialization, increased expression of Bcl-2 protein (P ) and mRNA (P ), and significantly decreased expression of protein and mRNA for Bax, p53, and caspases 3 and 8. Syncytialized cells expressed higher levels of Bcl-2 protein concurrent with increased resistance to cisplatin-induced apoptosis. Thus, syncytialization of bewo cells was accompanied by altered transcription of apoptotic-related proteins characteristic of increased apoptosis resistance secondary to increased expression of the anti-apoptotic protein Bcl-2 and diminish expression of pro-apoptotic proteins.

关键词： bewo Trophoblast Placenta Caspase 8 Caspase 3 Bcl-2 Intercellular Fusion

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基于基因芯片整合分析筛选及验证bewo细胞合体化相关调控因子

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重庆医科大学学报 2019年第8期44卷 1041-1048页

作者：顾珺巍丁裕斌付利娟王永恒王应雄刘太行重庆医科大学公共卫生与管理学院生殖生物学实验室教育部生殖与发育国际合作联合实验室

目的:合体滋养层细胞(syncytiotrophoblast,STB)是一类多核化上皮细胞位于人类胎盘最外层,由单核滋养细胞(cytotrophoblast,CTB)分化、融合而来,肩负妊娠维持关键激素的分泌和母胎间营养交换的重要职责,也是母胎屏障重要组成部分之一。... 详细信息

目的:合体滋养层细胞(syncytiotrophoblast,STB)是一类多核化上皮细胞位于人类胎盘最外层,由单核滋养细胞(cytotrophoblast,CTB)分化、融合而来,肩负妊娠维持关键激素的分泌和母胎间营养交换的重要职责,也是母胎屏障重要组成部分之一。然而,目前关于胎盘滋养细胞的合体化过程的调控机制仍不明确。本研究即利用生物信息学的方法筛选并初步验证潜在调控绒毛膜癌bewo细胞合体化调控的关键基因。方法:从GEO数据库检索并下载bewo细胞合体化前后的基因芯片数据集,并利用生物信息学分析方法对所有相关数据集进行综合分析,筛选出差异表达基因并进行GO及KEGG聚类分析,进一步通过PPI蛋白互作网络寻找节点基因,最后利用qRT-PCR验证候选基因在合体化前后的差异表达。结果:从2组数据中共筛选出137个差异表达基因,其中25个差异基因为2组数据集共有,参与细胞迁移、细胞黏附、激素代谢、MAPK信号通路等。进一步借助蛋白质互作网络分析,得到3个候选基因并通过qRT-PCR验证,结果与信息分析结果一致。结论:本研究为滋养细胞合体化研究提供了潜在靶基因,也为解析其分子调控机制提供了线索。

关键词： bewo 合体化基因芯片生物信息

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乙酰普鲁兰纳米粒子bewo b30细胞毒性及摄取研究

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首都医科大学学报 2016年第4期37卷 418-423页

作者：蒋子雯周志敏唐红波杜博张其清代荫梅首都医科大学附属北京妇产医院妇科北京100026 中国医学科学院北京协和医学院生物医学工程研究所天津市生物医学材料重点实验室天津300192

目的通过乙酰普鲁兰纳米粒子对人绒毛膜癌细胞（bewo b30）的细胞毒性以及细胞摄取研究,为普鲁兰基纳米药物跨胎盘屏障机制及妊娠期用药提供科学依据。方法以透析法制备异硫氰酸荧光素标记的乙酰普鲁兰纳米粒子（fluorescein isothiocya... 详细信息

目的通过乙酰普鲁兰纳米粒子对人绒毛膜癌细胞（bewo b30）的细胞毒性以及细胞摄取研究,为普鲁兰基纳米药物跨胎盘屏障机制及妊娠期用药提供科学依据。方法以透析法制备异硫氰酸荧光素标记的乙酰普鲁兰纳米粒子（fluorescein isothiocyanate labelled pullulan acetate nanoparticles,PA-FITC NPs）,分别利用激光粒度分析仪、扫描电镜、透射电镜考察乙酰普鲁兰纳米粒子粒径、Zeta电位、形貌及结构;用细胞计数试剂盒-8（cell counting kit-8,CCK-8）检测细胞生长曲线,考察不同浓度纳米粒子（0.4~2.0 mg/m L）对bewo b30细胞的细胞毒性;考察纳米粒子浓度、孵育时间、孵育温度对bewo b30细胞摄取纳米粒子的影响。结果 PA-FITC纳米粒子水合直径为（348.0±114.3）nm,Zeta电位为（-26.0±5.1）m V,呈表面光滑、内部结构规整的球形。PA-FITC纳米粒子在0.4~2.0 mg/m L浓度范围内细胞存活率为95.0%~100.5%,差异无统计学意义（P〉0.05）;bewo b30细胞摄取实验表明：细胞吞噬纳米粒子的量随着PA-FITC NPs的浓度升高和孵育时间延长而增大;当孵育温度从37℃降低至4℃,PA-FITC NPs的细胞摄取量显著降低（P〈0.05）。结论乙酰普鲁兰纳米粒子呈球形,对bewo b30细胞无明显细胞毒性;bewo b30细胞摄取PA-FITC纳米粒子与纳米粒子浓度、孵育时间和孵育温度呈正相关。

关键词：普鲁兰 bewo b30细胞纳米药物妊娠期用药

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乙型肝炎病毒感染bewo细胞模型的建立

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中国妇幼保健 2011年第31期26卷 4901-4903页

作者：刘明慧魏俊妮郭珍杨佳张玥张临瑞王素萍山西医科大学公共卫生学院流行病学教研室山西太原030001

目的:建立乙型肝炎病毒(HBV)感染人胎盘滋养层细胞系bewo的细胞模型,为HBV母婴传播过程中胎盘细胞感染机制的研究提供体外细胞模型。方法:选择人胎盘滋养层细胞系bewo进行体外培养,用高浓度HBV DNA阳性血清(5×106/拷贝.ml-1)与bewo细... 详细信息

目的:建立乙型肝炎病毒(HBV)感染人胎盘滋养层细胞系bewo的细胞模型,为HBV母婴传播过程中胎盘细胞感染机制的研究提供体外细胞模型。方法:选择人胎盘滋养层细胞系bewo进行体外培养,用高浓度HBV DNA阳性血清(5×106/拷贝.ml-1)与bewo细胞共培养48 h后,采用选择性PCR技术检测培养细胞中HBVrcDNA和HBVcccDNA。结果:HBV DNA阳性血清与bewo共培养48 h,bewo细胞中HBV rcDNA和HBV cccDNA均呈现阳性结果(243 bp和373 bp)。HBVDNA阳性血清与bewo共培养对细胞形态无明显影响。结论:HBV能够直接感染人胎盘滋养层细胞系bewo,该细胞系可用于进行HBV母婴传播过程中胎盘细胞感染机制的研究。

关键词：乙型肝炎病毒人胎盘滋养层细胞系 bewo HBVcccDNA 母婴传播

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Toll样受体3在乙肝病毒致bewo细胞凋亡中的作用

Toll样受体3在乙肝病毒致bewo细胞凋亡中的作用

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作者：李小燕山西医科大学

学位级别：硕士

目的①探索乙肝病毒能否在bewo细胞中复制,建立对乙肝病毒易感的细胞模型;②探索乙肝病毒能否能使得bewo发生凋亡;③探索TLR3是否在乙肝病毒致bewo细胞凋亡中起作用。方法①bewo细胞与HBV DNA含量为5.0×106 (copies/ml)的血清共培养后,... 详细信息

目的①探索乙肝病毒能否在bewo细胞中复制,建立对乙肝病毒易感的细胞模型;②探索乙肝病毒能否能使得bewo发生凋亡;③探索TLR3是否在乙肝病毒致bewo细胞凋亡中起作用。方法①bewo细胞与HBV DNA含量为5.0×106 (copies/ml)的血清共培养后,PCR检测细胞中HBV cccDNA的表达情况;②通过流式细胞技术、TUNEL法检测细胞的凋亡情况,探讨能够使得bewo细胞发生凋亡的HBV DNA的剂量、作用时间;③观察PolyI:C刺激对与HBV DNA阳性血清共培养的bewo细胞凋亡的影响,同时流式细胞技术检测TLR3蛋白的改变,推测TLR3在乙肝病毒致bewo细胞凋亡中所起的作用。结果①与HBV DNA阳性血清共培养48小时后,PBS反复洗涤,继续生长24h、48h后bewo细胞中能够检测出HBV cccDNA;②bewo细胞与50μl HBV DNA含量为5.0×106 (copies/ml)的血清共培养8h、24h、48h,早期凋亡率分别为4.34±3.42%、1.98±1.42%、6.58±3.44%,总凋亡率分别为10.78±5.36%、7.21±2.39%、16.35±9.61%,与同期对照组比较差别无统计学意义,P值均大于0.05;③bewo细胞与100μl HBV DNA含量为5.0×106 (copies/ml)血清的共培养8h,早期凋亡率为5.55±1.80%,总凋亡率为10.88±2.33%,与对照组比较差别无统计学意义(P=0.064、P=0.997)。与100μl HBV DNA含量为5.0×106 (copies/ml)血清共培养24h、48h后,bewo细胞早期凋亡率分别为20.76±2.13%、24.23±6.87%,总凋亡率分别为25.58±2.11%、30.95±9.02%,凋亡指数分别为27.17±1.22%、30.47±1.92%,与对照组比较差别均有统计学意义,P值均小于0.001。④Poly I:C刺激后再与HBV DNA阳性血清共培养24h、48h,bewo细胞早期凋亡率分别为6.28±3.70%、6.25±1.35%,总凋亡率分别为7.69±3.71%、6.67±1.54%,均低于HBV DNA阳性血清直接刺激组,t检验差别有统计学意义(P值均小于0.05);⑤PolyI:C刺激组bewo细胞TLR3蛋白平均荧光强度为36.0217±2.71701,对照组细胞为32.5852±1.40918,差别有统计学意义(P=0.02)。结论①乙肝病毒能够在bewo细胞中复制,bewo细胞适合进行体外乙肝病毒感染试验;②乙肝病毒能够使得bewo细胞发生凋亡,上调TLR3的表达,TLR3可能参与了乙肝病毒致bewo细胞凋亡的信号转导;③PolyI:C刺激后上调了TLR3蛋白的表达,降低了与HBV DNA阳性血清共培养的bewo细胞的凋亡率。PolyI:C对TLR3的活化可能增强bewo细胞的抗病毒能力,减少凋亡的发生。

关键词：乙肝病毒细胞凋亡 TLR3 bewo

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TLR3及其相关细胞因子在bewo细胞抗HBV感染中的作用

TLR3及其相关细胞因子在Bewo细胞抗HBV感染中的作用

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作者：阎娟娟山西医科大学

学位级别：硕士

目的：①了解人胎盘滋养层细胞系bewo细胞HBV感染与TLR3蛋白表达的关系;②探讨HBV刺激的bewo细胞TLR3与其信号转导过程相关细胞因子表达的关系;③探讨TLR3和相关细胞因子在bewo细胞抗HBV中的作用。方法：(1)培养人胎盘滋养层细胞系bewo... 详细信息

目的：①了解人胎盘滋养层细胞系bewo细胞HBV感染与TLR3蛋白表达的关系;②探讨HBV刺激的bewo细胞TLR3与其信号转导过程相关细胞因子表达的关系;③探讨TLR3和相关细胞因子在bewo细胞抗HBV中的作用。方法：(1)培养人胎盘滋养层细胞系bewo细胞,分为PolyI:C(TLR3配体)刺激组及对照组bewo细胞,采用FAC(流式细胞技术)测定的TLR3表达;(2)采用100μl HBV DNA含量为5.0×106 (copies/ml)的血清与bewo细胞共培养作为HBV感染方法,设立三组：空白对照组,HBV刺激组,PolyI:C+HBV刺激组。于HBV刺激8 h、16 h、24 h、48h后收集培养上清及细胞进行以下实验：①FACS测定空白对照组、HBV刺激组和PolyI::C+HBV刺激组bewo细胞TLR3的表达以及不同刺激时间点的TLR3表达变化;②用ELISA法(酶联免疫吸附法)检测HBV刺激组和PolyI:C+HBV刺激组细胞培养液中IL-2、IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-β的含量;③用FQ-PCR(荧光定量PCR)检测HBV刺激组及PolyI:C+HBV刺激组细胞培养液以及bewo细胞中HBV DNA病毒载量。结果：①PolyI::C刺激组bewo细胞TLR3蛋白平均荧光强度为53.58±3.11,对照组细胞为42.14±3.85,差别有统计学意义(t=-10.721,P＜0.001)。②用FAC检测HBV刺激不同的时间点(8h、16h、24h、48h) bewo细胞的TLR3蛋白含量,表达水平在空白对照组、HBV刺激组及PolyI:C+HBV刺激组中四个不同时间点均有统计学差异(P＜0.05),对照组的bewo细胞4个时间点内TLR3蛋白平均荧光强度分别为47.93、50.13、54.70、50.70,HBV刺激可使TLR3蛋白水平升高,在8h为59.85,16h为70.45,24h为79.18,48h为87.27,且随时间变化TLR3蛋白表达水平有升高趋势,PolyI:C+HBV刺激组TLR3蛋白量高于对照组及HBV刺激组,8h为68.67,16h为82.98,24h达到94.08,48h为79.66,24h TLR3蛋白达到高峰值。③与HBV刺激组相比,PolyI:C+HBV刺激组IL-6、IL-10、TNF-α、IFN-β含量在不同的时间点(8 h、16 h、24 h、48h)表达水平均有显著性差异,且随着时间延长表达水平上升;TNF-α在与HBV共培养8h时表达量即开始上升,IL-6是在24h后升高幅度较大,IL-10的浓度在HBV感染组表现为迟缓上升,而PolyI:C+HBV感染组16h小时后上升幅度加大,IFN-β随着与HBV共培养的时间的增加呈现低幅度缓慢上升。与HBV刺激组相比,PolyI:C+HBV刺激组IL-2表达量未呈现统计学差异。④用FQ-PCR检测HBVDNA,结果显示：PolyI:C+HBV刺激组培养上清中HBV DNA含量均低于HBV刺激组,在HBV刺激8h时,两组HBV DNA含量尚未见统计学差异(t=3.635,P＞0.05),但在刺激16h之后,两组HBV DNA水平均有统计学差异(t=12.728,P＜0.05;t=7.603,P＜0.05;t=11.314,P＜0.05)。结论：①HBV刺激后bewo细胞TLR3蛋白表达增加;PolyI:C可通过上调bewo细胞TLR3蛋白表达来降低HBV感染与复制水平。②HBV刺激能诱导bewo细胞分泌细胞因子IL-6、IL-10、TNF-αIFN-β, PolyI:C增强了bewo细胞分泌细胞因子的能力,提示TLR3可能通过其信号转导途径的相关细胞因子发挥抗HBV感染的能力。③活化TLR3可降低bewo细胞HBV的复制程度。

关键词：乙型肝炎病毒细胞因子 TLR3 bewo PolyI:C

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TLR3基因在bewo细胞HBV感染和清除中的作用

TLR3基因在BeWo细胞HBV感染和清除中的作用

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作者：郭珍山西医科大学

学位级别：硕士

目的: ①探讨HBV刺激不同TLR3表达水平的bewo细胞后,各组bewo细胞TLR3蛋白表达与HBV感染与复制的关系;②探讨HBV刺激不同TLR3表达水平的bewo细胞后,各组bewo细胞分泌TLR3信号转导过程中相关细胞因子的水平与HBV感染与复制的关系。 ... 详细信息

目的: ①探讨HBV刺激不同TLR3表达水平的bewo细胞后,各组bewo细胞TLR3蛋白表达与HBV感染与复制的关系;②探讨HBV刺激不同TLR3表达水平的bewo细胞后,各组bewo细胞分泌TLR3信号转导过程中相关细胞因子的水平与HBV感染与复制的关系。方法: ①利用脂质体转染试剂Lipofectamine 2000将抑制TLR3基因的质粒pEGFP-Genesil-tlr3转染入bewo细胞,以下调bewo细胞的TLR3表达;用40ug/mlPolyI:C刺激bewo细胞以上调TLR3蛋白的表达,然后用HBV感染各组细胞;②本次实验采用bewo细胞与100ul HBV DNA含量为5.0×106（copies/ml）的病人血清共同培养作为HBV感染的方法,共设立四个组:正常对照组、HBV刺激正常细胞组、HBV刺激抑制TLR3质粒转染组、PolyI:C+HBV刺激组,于HBV刺激各组细胞8h、16h、24h、48h后收集各组细胞的培养上清及细胞进行下一步实验;③用流式细胞术（FACS）测定以上各组细胞TLR3蛋白的表达量,并分析不同HBV刺激时间点下TLR3蛋白表达水平的变化;用荧光定量PCR法检测HBV刺激后各组细胞培养上清中的HBV DNA载量;④用酶联免疫吸附法（ELISA）检测各组细胞培养上清中IL-10、TNF-α、IFN-β的表达。结果: ①PolyI:C刺激bewo细胞后,TLR3蛋白表达量增加,其平均荧光强度为65.11±2.73,正常对照组细胞为53.27±4.45,差异有统计学意义（t=-4.536,P＜0.05）。 ②将抑制TLR3的质粒（pEGFP-Genesil-tlr3）用脂质体转染法转染入bewo细胞后,其平均转染效率为50.24%。 ③用FACS检测不同时间点（8h、16h、24h、48h）HBV刺激各组bewo细胞的TLR3蛋白表达量,其在四个实验组中的4个不同时间点上差异均有统计学差异（P＜0.05）。正常对照组bewo细胞在4个时间点上TLR3蛋白平均荧光强度分别为52.88、53.78、55.07、54.70;HBV刺激bewo细胞可使TLR3蛋白水平升高,在8h为62.50,16h为69.65,24h为71.78,48h为73.49,且随时间变化TLR3蛋白表达水平有升高趋势;PolyI:C +HBV刺激组TLR3蛋白表达量高于正常对照组及HBV刺激正常细胞组,8h为77.27,16h为85.36,24h为91.26,48h为88.27,在24h时TLR3蛋白表达量达到高峰;HBV刺激抑制TLR3质粒转染组TLR3蛋白表达量先下降再升高,其在8h为46.19,16h为45.96,24h为46.34,48h为49.55,与正常对照组相比,除在48h差异无统计学意义（P＞0.05）外,其他时间点均有统计学差异（P＜0.05）。 ④用荧光定量PCR法检测HBV刺激正常细胞组、PolyI:C+HBV刺激组和HBV刺激抑制TLR3质粒转染组的不同HBV刺激时间点（8h、16h、24h、48h）上各组细胞培养上清中HBV DNA拷贝数,结果显示三组间差异在4个时间点上均有统计学意义（P＜0.05）,且各组均随着HBV刺激时间的延长,HBV DNA拷贝数降低。与HBV刺激正常组相比,PolyI:C+HBV刺激组HBV DNA拷贝数较低,HBV刺激抑制TLR3质粒转染组的HBV DNA拷贝数较高。 ⑤在HBV刺激的4个时间点（8h、16h、24h、48h）上,PolyI:C+HBV刺激组分泌细胞因子IL-10、TNF-α、IFN-β的水平比HBV刺激正常细胞组高,差异均有统计学意义（P＜0.05）;HBV刺激质粒转染组分泌的细胞因子水平低于HBV刺激正常细胞组,不同时间点上差异也均有统计学意义（P＜0.05）。随着HBV刺激时间的延长,TNF-α表达水平在8h开始上升,24h达到高峰后开始下降;IL-10和IFN-β的表达水平在PolyI:C+HBV刺激组16h后上升幅度较大,其余各组上升较为缓慢。结论 ①HBV刺激bewo细胞后其TLR3蛋白表达增加;PolyI:C上调bewo细胞TLR3蛋白表达水平后在HBV刺激下,TLR3蛋白表达量进一步升高;抑制TLR3质粒转染的bewo细胞在HBV刺激下TLR3蛋白表达量降低;同时HBV刺激后各组细胞培养上清中HBV DNA拷贝数随着TLR3蛋白表达量的升高而降低,从而说明TLR3在清除HBV感染与抑制HBV复制中起到重要作用。 ②HBV刺激能诱导bewo细胞分泌细胞因子IL-10、TNF-α和IFN-β,PolyI:C刺激增强了bewo细胞分泌细胞因

关键词：乙肝病毒 TLR3 bewo PolyI:C 细胞因子

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Hypericum caprifoliatum and Hypericum connatum affect human trophoblast-like cells differentiation and Ca^(2+) influx

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Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine 2014年第5期4卷 367-373页

作者： Aline O.da Conceio Gilsane Lino von Poser Benoit Barbeau Julie Lafond State University of Santa Cruz Federal University of Rio Grande do Sul BioMed Research Center University of Quebec-Montreal Maternal-Fetal Physiology Laboratory Biological Sciences DepartmentUniversity of Quebec-Montreal

Objective:To study the effect of crude methanol and n-hexane extracts of Hypericum connatum(***) and Hypericum caprifoliatum on trophoblast-like ***:bewo and JEG-3 trophoblast-like cells were submitted to different extract concentrations(1.5,10 and 15 μg/mL) and evaluated in relation to cell viability and in titro trophoblast differentiation and *** viability was evaluated using WST-1 *** was measured by luciferase production,hCG production/release,and mitogenactivated protein kinase signaling pathway *** function of the trophoblast-like cells was measured by^(25)Ca^(2*) influx ***:The results showed a decrease in cell viability/*** plants and different extracts induced a significant decrease in hCG production/release and luciferase *** did not cause mitogen-activated protein kinase signaling pathway disturbance;however,Hypericum caprifoliatum n-hexane extract at 15 μg/mL inhibited extracellular signalregulated kinase 1/2 *** significant increase in Ca^(2+) influx by JEG-3 cells was seen after short and long incubation times with *** methanolie extract at 15 μg/***:The results indicated that these two Hypericum species extracts can interfere on trophoblast differentiation and Ca^(2+)influx,according to their molecular *** in vivo experiments are necessary to establish their action on placental formation and function,this study suggests that attention must be paid to the potential toxic effect of these plants.

关键词： bewo JEG-3 Hypericaceae ERK1/2 p38 Ca^(2+)influx

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c-Myc基因在人滋养细胞合体化中的作用

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中国细胞生物学学报 2020年第3期42卷 418-426页

作者：徐增伟王永恒刘太行王应雄丁裕斌重庆医科大学公共卫生与管理学院生殖生物学实验室教育部生殖与发育国际合作联合实验室重庆400016

c-Myc属于bHLH家族转录因子,在人多能干细胞维持细胞自我更新中发挥着重要作用,但在人胎盘滋养细胞分化中的功能尚不明确。该研究采用免疫组化、免疫荧光、Western blot及qRT-PCR技术,初步证实人早孕绒毛、原代滋养细胞及福斯科林诱导B... 详细信息

c-Myc属于bHLH家族转录因子,在人多能干细胞维持细胞自我更新中发挥着重要作用,但在人胎盘滋养细胞分化中的功能尚不明确。该研究采用免疫组化、免疫荧光、Western blot及qRT-PCR技术,初步证实人早孕绒毛、原代滋养细胞及福斯科林诱导bewo细胞合体化前后c-Myc均高表达于细胞滋养细胞,并在滋养细胞合体化过程中表达下调。qRT-PCR检测c-Myc网络相关因子在滋养细胞合体化过程中的作用,发现细胞周期相关因子CCNA2及CDK2表达下调,CDKN2A表达上调;c-Myc调控网络中滋养细胞干性相关因子OCT4、SOX2及hTERT在滋养细胞合体化过程中表达下调。研究初步发现,c-Myc可能通过其调控网络及细胞周期,影响滋养细胞增殖及分化平衡,从而参与滋养细胞合体化。

关键词：滋养细胞 c-Myc bewo 合体化

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细胞膜转运体介导的恩曲他滨跨胎盘转运研究

细胞膜转运体介导的恩曲他滨跨胎盘转运研究

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作者：曾清泉浙江大学

学位级别：硕士

研究目的获得性免疫缺陷综合征/艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)是一种全球性的流行病。截至2017年,全球现存3690万感染人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)。联合国艾滋病规划署2018年的统计数据显示... 详细信息

研究目的获得性免疫缺陷综合征/艾滋病(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)是一种全球性的流行病。截至2017年,全球现存3690万感染人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)。联合国艾滋病规划署2018年的统计数据显示,43%HIV携带者是女性,且大多数为育龄期妇女。世界卫生组织(world health organization,WHO)建议,所有HIV 阳性孕妇和哺乳期妇女应接受抗逆转录病毒治疗。没有药物治疗的HIV感染会导致CD4+T细胞进行性减少、免疫失调、机会感染和肿瘤并发症的风险增加。恩曲他滨(emtricitabine,FTC)是一种高效且耐受良好的抗逆转录病毒核苷类药物,也是WHO推荐HIV感染的孕妇控制HIV病毒载量及降低母婴传播风险的一线抗病毒药物之一。为了降低耐药性的发生,WHO建议几种不同药理作用的抗逆转录病毒药物合用,称为高效联合抗逆转录病毒治疗。HIV感染孕妇采用高效抗逆转录病毒治疗既可以非常有效地控制母体病毒载量又可降低母婴传播的发生率,胎盘上表达着不同转运体其参与各类抗病毒药物的胎盘转运,药物合用在胎盘上可能存在药物-药物相互作用而引起胎儿侧有效药物浓度改变,即药物浓度升高引起的胚胎毒性或药物浓度下降引起的抗病毒失败。FTC为强极性化合物,尽管许多研究报道FTC的胎盘透过性良好,但其转运机制尚未阐明。本研究旨在阐明哪些转运体参与FTC透过血-胎盘屏障;探究抗逆转录病毒药物合用药物FTC-替诺福韦(tenofovir,TFV)-依法韦仑(efavirenz,EFV)是否影响 FTC 在 bewo细胞和人原代滋养细胞(primary human trophoblast cells,PHTCs)中的积聚;考察妊娠不同时期平衡型核苷转运体1(equilibrative nucleoside transporter,ENT)1蛋白表达是否改变以预测FTC在妊娠期的转运变化。研究方法应用bewo细胞和PHTCs进行FTC积聚实验、不同转运体抑制剂与FTC共孵育初步确定参与FTC跨膜转运的转运体、应用瞬时或稳定高表达的转运体细胞模型和小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)技术进一步确认参与FTC胎盘转运的相关转运体,以LC-MS/MS法测定细胞内FTC浓度。应用实时定量PCR和western blotting技术,检测不同妊娠期的人和小鼠胎盘中核苷转运体mRNA和ENT/Entl的蛋白表达。通过比较TFV或EFV存在下,bewo细胞和PHTCs中FTC积聚差异,考察TFV、EFV对FTC转运的影响。研究结果***的胎盘转运机制根据不同转运体抑制剂存在下bewo细胞内FTC积聚量的变化结果表明,摄取转运体 ENTs、浓缩型核苷转运体(concentrative nucleoside transporters,CNTs)、有机阳离子转运体(organic cation transporters,OCTs)、外排转运蛋白乳腺癌耐药蛋白(breast cancer resistance protein,BCRP)和多药耐药相关蛋白(multidrug resistance-associated proteins,MRPs)可能参与 FTC 的转运。PHTCs 的积聚抑制实验也表明,ENTs和OCTs可能参与FTC转运。***与胎盘相关转运体的相互作用首先应用siRNA转染bewo细胞,通过敲低ENT1的表达后bewo细胞内FTC的积聚减少,证明了 ENT1参与FTC的转运;应用ENTs抑制剂NBTI对ENT1和ENT2的选择性抑制,发现ENT2不参与FTC的跨膜转运;应用瞬时转染或稳定高表达转运体的细胞模型,证明FTC是CNT1、肉碱/有机阳离子转运体(organic cation/carnitine transporter,OCTN)1、BCRP 和 MRP 1/2/3 的底物,但不是 CNT3、OCTN2 和多药耐药蛋白(multidrug resistance protein,MDR)1 的底物。FTC 在HEK293-hCNT1细胞上的积聚呈典型动力学特征,Km和Vmax分别为162±54.1μM,201±15.2 pmol/mgprotein/min;FTC 在 MDCK-hOCNT1 细胞上的积聚呈非典型动力学特征,低浓度下(10-400 μM),Km和Vmax值分别为489±119μM和0.364±0.0709 nmol/mg protein/min;而高浓度下(800-5000 μM),Km and Vmax 分别为 13.3±1.18 mM 和 6.01±0.450 nmo

关键词：恩曲他滨胎盘转运体 bewo 胎盘人原代滋养层细胞

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