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"有故无殒"理论指导下基于肝细胞bax/bcl-2凋亡通路的何首乌"毒-证"机制研究

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中药药理与临床 2019年第6期35卷 82-87页

作者：王丽平罗文佳欧莉高峰余金花李敏白杨卫培峰陕西中医药大学咸阳712046

目的:在"有故无殒"理论的指导下通过研究何首乌对肝细胞凋亡及Bax/Bcl-2通路的影响以探讨何首乌肝毒性是否与中医证候存在关联性。方法:大鼠注射氢化可的松,建立大鼠肾阳虚模型和肾阴虚模型,分为空白对照组、肾阳虚模型组、肾阳虚制首乌... 详细信息

目的:在"有故无殒"理论的指导下通过研究何首乌对肝细胞凋亡及Bax/Bcl-2通路的影响以探讨何首乌肝毒性是否与中医证候存在关联性。方法:大鼠注射氢化可的松,建立大鼠肾阳虚模型和肾阴虚模型,分为空白对照组、肾阳虚模型组、肾阳虚制首乌6 g/kg、12 g/kg、24 g/kg组、肾阳虚生首乌6 g/kg组、肾阴虚模型组、肾阴虚制首乌6 g/kg、12 g/kg、24 g/kg剂量组、肾阴虚生首乌6 g/kg组。给药3个月后,检测血清AST、ALT、ALP的变化;采用TUNEL法测定肝组织细胞凋亡指数;实时荧光定量PCR技术检测各组大鼠肝组织bcl-2和bax mRNA的表达情况。结果:与模型组比较,制首乌12 g/kg的肾阴虚和肾阳虚组体现出了明显差异,其中肾阳虚证候制首乌组大鼠血清ALT、肝细胞凋亡指数以及bax/bcl-2比值均显著升高,而肾阴虚证制首乌组大鼠无明显升高。肾阴虚组与肾阳虚组相比较,制首乌12 g/kg组和制首乌24 g/kg组肾阳虚大鼠的血清ALT、肝细胞凋亡指数以及bax/bcl-2比值升高均明显高于肾阴虚证。结论:何首乌肝毒性与中医不同证候存在一定关联性,对证使用时较为安全,而药不对证时,导致肝损伤的风险增高。

关键词：有故无殒何首乌肝细胞凋亡 Bax/Bcl-2通路

半夏提取物对耐药慢性髓系白血病细胞K562增殖抑制及凋亡作用机制研究

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半夏提取物对耐药慢性髓系白血病细胞K562增殖抑制及凋亡作用机制...

作者：冯嘉昆昆明理工大学

学位级别：硕士

背景近十年来,我国白血病发病以2%的速度递增,白血病是一种起源于造血前体细胞的恶性肿瘤。化疗取得完全缓解后进行造血干细胞移植,是目前治疗白血病可能达到治愈的主要手段。然而化疗的副作用及多药耐药的产生,给临床治疗白血病预期的... 详细信息

背景近十年来,我国白血病发病以2%的速度递增,白血病是一种起源于造血前体细胞的恶性肿瘤。化疗取得完全缓解后进行造血干细胞移植,是目前治疗白血病可能达到治愈的主要手段。然而化疗的副作用及多药耐药的产生,给临床治疗白血病预期的完全缓解和巩固治疗带来了诸多困难。中药作为我国传统医学领域独具特色的理论与方法。其治疗白血病的手段,具有个体化、辩证施治的明显优势,实践证明中医中药在治疗白血病中显示出重要作用。近年来随着中药及其有效成分抗白血病的临床及实验研究日益广泛,部分研究发现温阳中药中的有效成分可以改变白血病细胞的生物学活性,诱导白血病细胞成熟分化和凋亡。半夏是传统中草药材,内含多种有效活性成分,半夏提取物和生物总碱抑制白血病细胞增殖有相关的研究,但其作用机制尚不明确,值得深入研究。本文力图通过部分中药有效成分改变白血病细胞生物学特性,从而增加对化疗药物的敏感性,取得早期更好的完全缓解。为干细胞移植等可能治愈白血病的技术手段创造条件。目的探索半夏提取物有效成份对耐药白血病细胞株K562-ADR(耐阿霉素的慢性髓系白血病细胞株K562)增殖的抑制作用和诱导细胞凋亡的作用,探寻其作用的分子水平机制;探讨半夏提取物在耐药的白血病治疗中可能的应用价值。研究方法用氯仿低温超声方法提取半夏有效成分,分别干预经阿霉素处理的K562-ADR细胞株设置0.1 mg/ml、0.3 mg/ml、0.5 mg/ml、0.7 mg/ml、1 mg/ml、2 mg/ml、3 mg/ml 7种浓度,尔后通过IC50计算得半数抑制浓度,再优化浓度范围。观察半夏提取物干预慢性髓系白血病耐药细胞K562-ADR形态学改变;CCK-8法检测半夏提取物对K562-ADR细胞增殖的抑制作用;实时荧光定量PCR检测半夏提取物对K562-ADR细胞检测bax、bcl-2、MDM2、BCR-ABL、PML基因表达量。研究结果1.阿霉素耐药性检测试验结果显示:K562-ADR细胞耐药倍数是K562的59.39倍。2.CCK-8法检测结果显示:半夏提取物对K562、K562-ADR白血病细胞的增殖均有较强的抑制作用。3.由Graphpad Prism分别计算得半夏提取物对K562组IC50为1.83mg/ml,K562-ADR组IC50为2.36mg/ml。4.RT-PCR和Western blot检测PML在K562-ADR细胞内的表达情况,结果发现K562-ADR细胞中的PML表达高于K562细胞;5.RT-PCR显示:(1)5mg/ml在48h、72h干预时bcl-2有最大值(Pbax表达量下调,提示该浓度下bax/bcl-2途径可能不参与K562-ADR细胞凋亡;(2)1、3、5mg/ml半夏提取物干预48h后影响K562、K562-ADR细胞MDM2、BCR-ABL、PML转录表达水平,结果显示1、3mg/ml半夏提取物可能激活K562-ADR细胞MDM2、BCR-ABL、PML表达;而使用5mg/ml时,BCR-ABL、PML转录水平表达量下调。(3)0.5、0.7mg/ml半夏提取物干预48、72 h后影响K562-ADR细胞转录bax、bcl-2表达水平,bcl-2表达水平下调(P通过bax、bcl-2途径促进细胞凋亡,且在48～72小时的抑制生长曲线、凋亡蛋白表达最为稳定。2.在较高浓度1、3、5mg/ml范围的半夏提取物对阿霉素耐药的慢性髓系白血病细胞,bax、bcl-2 m RNA表达量受半夏提取物浓度和时长影响。3.较高浓度1、3、5mg/ml范围,MDM2及BCR-ABL、PML表达水平受半夏提取物浓度和时长影响,不同浓度m RNA表达量不同。4.耐药的慢性髓系白血病细胞可能通过PML介导调控,5mg/ml半夏提取物干预48h下调PML的表达水平。

关键词：耐药白血病半夏提取物 Bax/Bcl-2通路 MDM2 PML 细胞凋亡

半夏提取物对白血病细胞增殖抑制及凋亡作用机制研究

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半夏提取物对白血病细胞增殖抑制及凋亡作用机制研究

作者：刘伟昆明理工大学

学位级别：硕士

研究背景白血病是一种常见的起源于造血前体细胞的恶性肿瘤,在我国发病率较高,目前主要的治疗方法为造血干细胞移植和化疗。化疗是目前治疗白血病的主要手段,然而化疗的副作用及多药耐药的产生,给临床治疗白血病预期的完全缓解和巩固治... 详细信息

研究背景白血病是一种常见的起源于造血前体细胞的恶性肿瘤,在我国发病率较高,目前主要的治疗方法为造血干细胞移植和化疗。化疗是目前治疗白血病的主要手段,然而化疗的副作用及多药耐药的产生,给临床治疗白血病预期的完全缓解和巩固治疗带来了诸多困难。中药作为我国传统治疗白血病的手段,具有个体化、辩证施治的明显优势,实践证明中医中药在治疗白血病中显示出重要作用。近年来随着中药及其有效成分抗白血病的临床及实验研究日益广泛,部分研究发现温阳中药中的有效成分可以改变白血病细胞的生物学活性,诱导白血病细胞成熟分化和凋亡。半夏是传统中草药材,内含多种有效活性成分,半夏提取物和生物总碱抑制白血病细胞增殖有相关的研究,但其具体作用机制缺乏研究。目的探索半夏提取物有效成份对白血病细胞增殖的抑制作用和诱导细胞凋亡的作用,探寻其分子水平的作用的机制;探讨半夏提取物在白血病治疗中可能的应用价值。研究方法用氯仿低温超声方法提取半夏有效成分,分别制备100,200,300,400,500ug/ml5种浓度,作用于3种白血病细胞株。观察半夏提取物处理髓系白血病细胞K562、HL60和淋巴系白血病细胞C8166细胞的形态学改变;CCK-8法检测半夏提取物对3种白血病细胞增殖的抑制作用;Annexin V/PI双染流式细胞术检测半夏提取物处理对3种白血病细胞凋亡的诱导作用;实时荧光定量PCR检测半夏提取物对3种白血病细胞检测bax、bcl-2和Caspase-3基因表达量,免疫印迹检测半夏提取物对3种白血病细胞相关凋亡蛋白表达的影响。研究结果1.CCK-8法检测结果显示:半夏提取物处理对3种白血病细胞的增殖均有较强的抑制作用,且在500ug/ml浓度下半夏提取物诱导凋亡作用最为稳定。2.Annexin V/PI双染流式细胞术检测显示:随着半夏提取浓度的增加,3种白血病细胞凋亡比率逐渐升高。300ug/ml和500ug/ml作用72h,凋亡率明显高于对照组,表明半夏提取物处理可以诱导3种白血病细胞发生凋亡,提示半夏提取物对白血病细胞增殖的抑制作用可能是由于半夏提取物促进白血病细胞凋亡。3.实时荧光定量PCR显示:半夏提取物作用3种白血病细胞72h后,与对照组比较明显提高了bax,Caspase-3 mRNA的表达量,降低了bcl-2 mRNA的表达量（P＜0.05）。4.蛋白免疫印迹显示:半夏提取物作用3种白血病细胞72h后,能上调促凋亡蛋白bax,下调抗凋亡蛋白bcl-2,同时激活下游信号蛋白Caspase-3表达。结论1.半夏提取物在500ug/ml浓度时,抑制白血病细胞增殖、促进细胞凋亡作用最为明显,且在48～72小时的抑制生长曲线、凋亡蛋白表达最为稳定。2.半夏提取物对白血病细胞的作用机制可能为上调bax基因表达、下调bcl-2基因表达;以及影响下游基因Caspase-3 mRNA的表达来抑制白血病细胞增殖,促进其凋亡。

关键词：白血病半夏提取物 Bax/Bcl-2通路凋亡

bax通路在mfn2诱导肝癌细胞凋亡过程中作用的研究

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Bax通路在mfn2诱导肝癌细胞凋亡过程中作用的研究

作者：朱峰浙江大学

学位级别：硕士

目的：增殖抑制基因（HSG）又称为线粒体融合蛋白基因（mfn2）能够有效的抑制受损伤血管平滑肌增殖及细胞周期,使细胞停滞于G0／G1期,近来文献报道mfn2基因能抑制肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡,本实验主要探讨HSG基因诱导肝癌细胞凋亡、抑... 详细信息

目的：增殖抑制基因（HSG）又称为线粒体融合蛋白基因（mfn2）能够有效的抑制受损伤血管平滑肌增殖及细胞周期,使细胞停滞于G0／G1期,近来文献报道mfn2基因能抑制肿瘤细胞增殖,诱导细胞凋亡,本实验主要探讨HSG基因诱导肝癌细胞凋亡、抑制细胞增殖的机制,以及观察bax/bcl-2蛋白家族及其凋亡通路以及线粒体凋亡通路在mfn2诱导肝癌细胞凋亡中的作用。方法：构建含mfn2 cDNA片段的腺病毒Ad-mfn2以及质粒pEGFP-C2-mfn2和pCDNA3.1⊕-mfn2,体外感染或转染入肝癌细胞内,并以含有绿色荧光蛋白的腺病毒Ad-GFP以及空白质粒pEGFP-C2、pCDNA3.1⊕为阴性对照组,Western Blot检测HSG高表达组和对照组细胞内线粒体凋亡通路关键蛋白bax. bcl-2、p53、caspase-3、caspase-9、PARP、Apaf-1等的差异,流式细胞术检测肝癌细胞周期及凋亡的变化。分离并提纯肝癌细胞线粒体蛋白及胞浆蛋白,Western Blot观察细胞色素C和bax在细胞内不同细胞器中含量的变化。构建短发卡RNA shR-mfn2和shR-bax并共转染入正常肝细胞L02和肝癌细胞,流式细胞术、DNA ladder和CCK-8检测细胞凋亡和增殖的变化,报告基因方法检测肝癌细胞高表达mfn2基因后caspase-3活性的变化。结果：感染Ad-mfn2的mfn2高表达组和转染pCDNA3.1⊕-mfn2的中表达组凋亡显著增加（p＜0.01）,较对照组细胞总蛋白内bax、bcl-2、p53表达无显著性差异,但Caspase-3、PARP.Apaf-1蛋白表达显著增加（p=0.004、p=0.045、p=0.010）。Ad-mfn2转染培养的HepG2后,细胞周期阻滞在G0／G1期,S期细胞数量显著减少,而凋亡显著增加。高表达HSG细胞线粒体蛋白内细胞色素C减少、bax增加,相对细胞浆内细胞色素C增加、bax减少,两者有显著性差异（细胞色素C：p=0.024 VSp=0.040;bax:p=0.018 VSp=0.039）.正常肝细胞shRNA干扰mfn2表达显著促进细胞增殖,其与干扰bax表达组无显著性差异（p=0.196）。高表达mfn2组肝癌细胞转染入shR-bax使细胞凋亡显著被抑制（p=0.0103）。肝癌细胞高表达mfn2基因后caspase-3活性相对于对照组及空白对照组显著增加（p＜0.01）。结论：mfn2基因过表达可以抑制肝癌的生长,促进肝癌细胞的凋亡,mfn2是潜在重要的抑癌基因,其在肝癌细胞中的凋亡和抑制增殖作用与bax／bcl-2凋亡通路及线粒体凋亡通路有关。提示mfn2基因在认识及防治肝癌中较大前景。

关键词：凋亡增殖抑制基因（HSG）肝细胞肝癌（HCC）腺病毒细胞周期线粒体 Bax/Bcl-2通路

石榴补血糖浆对东莨菪碱诱导PC12细胞凋亡的保护作用及机制研究

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陕西中医 2024年第5期45卷 588-592页

作者：赵丽蓉黎晨黄正元尹海龙成传芳周本宏武汉大学人民医院药学部湖北武汉430060 新疆维吾尔药业有限责任公司新疆乌鲁木齐830026

目的:探讨石榴补血糖浆对东莨菪碱诱导大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤(PC12)细胞凋亡保护作用,探究石榴补血糖浆体外改善认知功能障碍的保护作用机制。方法:将不同浓度的石榴补血糖浆冻干粉细胞培养液作用于PC12细胞,采用CCK-8法检测细胞活性... 详细信息

目的:探讨石榴补血糖浆对东莨菪碱诱导大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤(PC12)细胞凋亡保护作用,探究石榴补血糖浆体外改善认知功能障碍的保护作用机制。方法:将不同浓度的石榴补血糖浆冻干粉细胞培养液作用于PC12细胞,采用CCK-8法检测细胞活性,根据细胞活性结果将后续实验分为空白对照组(NC)、模型组(SC)、石榴补血糖浆低、中、高剂量组(L、M、H:25、50、100μg/ml)、多奈哌齐对照组(D,10μmol/L);利用ELISA试剂盒检测细胞乙酰胆碱(Ach)、乙酰胆碱酯酶(AchE)、超氧化物歧化酶(SOD)和脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的水平,流式凋亡术检测活性氧自由基(ROS)及细胞凋亡情况;Westernblot法检测凋亡相关蛋白bcl-2、bax、Caspase-3、Cleaved-Caspase-3等蛋白的表达情况。结果:石榴补血糖浆可显著增加PC12细胞的存活率,增加Ach、SOD的水平,降低ROS、MDA及AchE的水平,降低bax/bcl-2的比值和Cleaved-Caspase-3/Caspase-3蛋白的表达。结论:石榴补血糖浆可通过bax/bcl-2信号通路抑制细胞凋亡,减轻氧化应激,影响细胞内神经递质的水平发挥神经保护作用。

关键词：石榴补血糖浆神经保护 Bax/Bcl-2通路认知障碍细胞凋亡 PC12细胞