检索结果-南通市图书馆

作者：张成杰湖北大学

学位级别：硕士

果胶酶可以促进果胶类聚合物中的α-1,4糖苷键断裂生产果胶低聚糖,在动物饲料、果浆工业、造纸行业、纺织行业等都有很强的运用潜力,特别是在纺织行业的苎麻脱胶工艺中。传统工艺中一般使用强碱溶液在高温下,除去苎麻纤维中的果胶质、... 详细信息

果胶酶可以促进果胶类聚合物中的α-1,4糖苷键断裂生产果胶低聚糖,在动物饲料、果浆工业、造纸行业、纺织行业等都有很强的运用潜力,特别是在纺织行业的苎麻脱胶工艺中。传统工艺中一般使用强碱溶液在高温下,除去苎麻纤维中的果胶质、蜡质等纤维共生物杂质,但由于碱精练过程中大量使用了烧碱和表面活性剂,处理后需要用大量的酸中和并用大量的水清洗,因此,被处理的苎麻纤维损失较大,强度也损伤严重。此外,该工艺用水量大、能耗高、耗时长,废液中COD值很高是一种非绿色的加工工艺。为此,作为生物脱胶过程中的至关重要酶制剂,碱性果胶酶的研发以及其在苎麻脱胶中的应用,使绿色、温和的生物脱胶技术成为可能。在碱性条件下,作为苎麻纤维主体的纤维素有润胀的趋向,而果胶酶利用其专一性有效分解去除在苎麻纤维表面对蜡质等疏水性共生物起黏结作用的果胶质,使疏水性物质从苎麻纤维表面脱落,从而达到精练效果,而纤维本身不受到损伤。因此,经生物脱胶后的苎麻纤维能最大程度的保持纤维强度,失重小,手感柔软厚实,且富有弹性。并且可节约大量工艺用水、生产时间、能耗、原料及对废水的处理费用,减少对环境排放水中的盐含量及COD等。因此,成本更低廉、活性更高的碱性果胶酶成为纺织工业的关注热点。本实验对bacillus subtilis168来源的碱性果胶酶基因(pel168)分别在大肠杆菌和毕赤酵母中进行表达。表达酶液经纯化后进行SDS-PAGE检测,结果显示,在大肠杆菌中表达的蛋白(PEL168E)与我们所推测的蛋白分子量相同,大小为46kDa。然而在酵母中表达的蛋白(PEL168P)经SDS-PAGE检测以后却有两条带,大小分别为48.6kDa和51.4kDa,因此我们用去糖基化酶对PEL168P经行处理,验证后发现它确实被糖基化。酶学性质的研究表明,该酶的最适温度为50℃,最适PH为9.4。当PEL168E和PEL168P分别在60℃水浴锅中处理20分钟以后,PEL168E完全失去活性,而PEL168P还保留了26%的残余活性。PEL168P的比酶活为1320U/mg, Km值和Vmax分别为0.09mg/ml以及18.13μmol/min。K+,Li+,Ni2+和Sr2+对其活性没有影响,而Mn2+,Hg2+和Cu2+几乎完全抑制了酶的活性,Zn2+,Fe3+,Mg2+和Co2+也部分抑制酶的活性,但是当有适当浓度的Ca2+参与反应时,该酶的活性能提高38%以上与此同时,为了提高其在酵母中的表达水平,我们利用酵母密码子的偏爱性及简并性对pel168基因经行了优化,其中有294个碱基被优化,优化后的基因转入毕赤酵母中进行异源蛋白(PEL168S)表达。挑选具有相同拷贝数的优化前和优化后基因的酵母重组菌株,在相同的环境下甲醇诱导72h,发现密码子优化后PEL168S的酶活是优化前PEL168P的1.52倍。通过Realtime-PCR检测到所筛选的高拷贝重组菌株最多整合了11个拷贝的果胶酶酶基因pel168s。除此之外,对于PEL168P在苎麻脱胶和生物煮练中的应用也进行了一系列的测定,结果表明碱性果胶酶在纺织工业的绿色生产中起着重要的作用。

关键词： bacillus subtilis168 碱性果胶酶异源表达毕赤酵母糖基化密码优化应用

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N端截短CBM41对枯草芽孢杆菌来源普鲁兰酶酶学性质的影响

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生物技术通报 2022年第6期38卷 245-251页

作者：付巧林啟兰薛强熊海容王亚伟中南民族大学生命科学学院武汉430074 武汉轻工大学生命科学与技术学院武汉430048

采用N端截短方式对bacillus subtilis 168来源普鲁兰酶进行蛋白结构改造,构建不同形式的截短突变体,考察N端结构对酶学特性的影响。利用基因工程的手段分别删去CBM41结构域N端前2、4和6个氨基酸,获得突变体M1(ΔN2)、M2(ΔN4)和M3(ΔN6)... 详细信息

采用N端截短方式对bacillus subtilis 168来源普鲁兰酶进行蛋白结构改造,构建不同形式的截短突变体,考察N端结构对酶学特性的影响。利用基因工程的手段分别删去CBM41结构域N端前2、4和6个氨基酸,获得突变体M1(ΔN2)、M2(ΔN4)和M3(ΔN6)。3种突变体最适反应温度(40-45℃)和最适pH(6.0)均与WT一致,WT、M1、M2和M3的T_(m)值分别为48.57℃、50.03℃、48.43℃和49.50℃,M1、M2和M3的比活力均高于野生型,是WT的1.18、1.60和2.44倍,WT、M1、M2和M3的K_(m)值分别为23.89、29.01、17.29和19.08 mg/mL。上述结果表明,通过截短普鲁兰酶N端氨基酸可获得性质得到改良的突变体,为提高该酶的热稳定性、比活力和底物结合能力提供新的方法和思路。

关键词： N端截短普鲁兰酶 bacillus subtilis168 酶学特性

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Surfactin合成酶相关基因研究

Surfactin合成酶相关基因研究

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作者：刘丽霞南京农业大学

学位级别：硕士

芽孢杆菌属中的一些成员能产生大量的生物活性分子,可以抑制病原菌的生长。枯草芽孢杆菌,作为普遍使用和充分研究的生物之一,其基因组中有4-5%用于合成抗菌物质,可以产生二十多种结构不同的抗菌化合物。其中,环状脂肽surfactin具有强大... 详细信息

芽孢杆菌属中的一些成员能产生大量的生物活性分子,可以抑制病原菌的生长。枯草芽孢杆菌,作为普遍使用和充分研究的生物之一,其基因组中有4-5%用于合成抗菌物质,可以产生二十多种结构不同的抗菌化合物。其中,环状脂肽surfactin具有强大的生物表面活性,同时具有抗细菌、抗肿瘤、抗病毒、抗支原体和防止纤维蛋白凝块等生物活性。因此,研究人员对surfactin的兴趣日趋增加,希望通过对surfactin等脂肽的改造获得更具潜力的活性物质。 Surfactin通过非核糖体多肽合成酶(nonribosomalpeptide synthetases, NRPS)催化而得,合成酶中模块的顺序和类型决定了产物中氨基酸的顺序。因此,通过对合成酶的修饰可以实现对产物的改造。在合成过程中,还涉及到一个功能酶Sfp(由sfp基因编码),在Sfp缺失的情况下将不能产生surfactin。故对surfactin合成酶的改造分析,不仅包括对surfactin合成酶基因的改造分析,还包括sfp基因的改造分析。本论文主要对bacillus subtilis fmbj中surfactin合成酶基因内编码SrfAC-A结构域的基因进行克隆表达,并对其进行定点突变;将外源sfp基因整合入bacillus subtilis168中,使其产surfactin。主要结果分述如下： 1.从枯草芽孢杆菌fmbj寺扩增出FsrfAC-A基因,在大肠杆菌表达系统中表达,并对其活性进行了测定。根据NCBI上***168菌株的srfAC-A基因序列,设计引物,用PCR的方法从枯草芽孢杆菌fmbj中克隆出srfAC-A基因,命名为FsrfAC-A。用酶切和酶连的方法将FsrfAC-A基因与表达质粒pET23a相连,并在大肠杆菌表达系统中进行表达。用Ni2+柱对重组蛋白FSrfAC-A进行分离纯化后,用非放射性的方法测定其活性。测定结果发现,FSrfAC-A对Leu和Ile有选择活性,且对Ile的活性更高。 2.对FsrfAC-A基因进行了定点突变,将突变体在大肠杆菌表达系统中表达,并构建了突变基因重组整合质粒(用于枯草芽孢杆菌系统)。用重叠延伸PCR的方法将克隆所得的FsrfAC-A基因进行突变,使FSrfAC-A结构域的278位由苯丙氨酸变为苏氨酸,322位由半胱氨酸变为丙氨酸,331位由苯丙氨酸变为半胱氨酸。将突变后基因分别连于pET23a和pET32a,并在大肠杆菌中表达,发现都为非可溶性表达。将突变后基因与枯草芽孢杆菌整合质粒pE5916相连得到重组整合质粒,但因fmbj野生菌株的感受态制备不易,使后续实验不能进行。 3.用同源重组的方法将外源sfp基因整合入枯草芽孢杆菌168菌株中,将其改造为产surfactin的菌株。通过分析多株枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)和解淀粉液化芽孢杆菌(bacillus amyloliquefaciens)的sfp基因,从基因的上下游找出较为保守的区域,设计引物,从实验室保存的枯草芽孢杆菌Nja-9中扩增出sfp基因。将获得的sfp基因与P43启动子和终止子相连,构建了sfp基因表达框,并连于枯草芽孢杆菌整合质粒pDG1730上,利用pDG1730本身的淀粉酶E基因与B. subtilis168菌株的基因组DNA进行整合,获得了产surfactin的重组菌株B. subtilis121.

关键词： Surfactin合成酶 srfAC-A 克隆表达 bacillus subtilis168 sfp 基因修饰

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