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利用bac-to-bac表达系统高效表达胰岛素样生长因子Ⅱ

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南京医科大学学报（自然科学版） 2001年第3期21卷 175-178页

作者：赵红汪承亚段宇 P.H.Steenbergh J.S.Sussenbach 陈家伟南京医科大学第一附属医院内分泌科江苏南京210029 南京医科大学第一附属医院血液科江苏南京210029 Laboratory for Physiological Chem istry Utrecht Universi-ty

目的 :利用 bac- to- bac表达系统高效表达成熟的胰岛素样生长因子 (IGF- )。方法 :首先构建含 IGF- c DNA的重组供体质粒 p Fast bac1,然后重组 p Fast bac1所含的转位元件 mini- Tn7,在感受态细胞 DH10 bac内转位到粘粒上的连接位... 详细信息

目的 :利用 bac- to- bac表达系统高效表达成熟的胰岛素样生长因子 (IGF- )。方法 :首先构建含 IGF- c DNA的重组供体质粒 p Fast bac1,然后重组 p Fast bac1所含的转位元件 mini- Tn7,在感受态细胞 DH10 bac内转位到粘粒上的连接位点mini- att Tn7构成重组粘粒 ,重组粘粒转染昆虫细胞 Sf9产生重组杆状病毒 ,重组杆状病毒进行感染 Sf9细胞。结果 :琼脂糖凝胶分析显示重组供体质粒 p Fast bac1的成功构建 ;琼脂糖凝胶分析重组粘粒的 PCR产物表明已获得重组粘粒 ;十二烷基磺酸钠(SDS) - PAGE和 Western Blotting显示 7KD左右蛋白质条带的出现。结论 :利用 bac- to- bac表达系统成功表达具有免疫学活性的 IGF- ,可用于临床疾病的诊治。

关键词：重组人胰岛素样生长因子Ⅱ bac-to-bac表达系统昆虫细胞

应用bac-to-bac双启动子表达系统在家蚕中表达BmCecB2

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应用Bac-to-Bac双启动子表达系统在家蚕中表达BmCecB2

作者：李昕琦安徽农业大学

学位级别：硕士

家蚕抗菌肽Cecropin B是家蚕免疫系统产生的一种具有生物活性的小分子多肽,无分子内的二硫键,分子质量约为4kDa,其N端和C端分别具有强碱性和强疏水性。抗菌肽Cecropin B具有抗细菌、抗真菌、抗病毒等作用,此外抗菌肽还可作为绿色健康的... 详细信息

家蚕抗菌肽Cecropin B是家蚕免疫系统产生的一种具有生物活性的小分子多肽,无分子内的二硫键,分子质量约为4kDa,其N端和C端分别具有强碱性和强疏水性。抗菌肽Cecropin B具有抗细菌、抗真菌、抗病毒等作用,此外抗菌肽还可作为绿色健康的饲料添加剂应用在畜牧生产中,促进动物健康生长,提高动物自身免疫力,因此抗菌肽的研究已成为生命科学领域的一大热点。抗菌肽从生物组织中分离获得大量的抗菌肽难度大,成本高,以融合蛋白的形式表达,表达产物活性较低,纯化过程比较复杂,并且翻译后加工修饰不完善,而采用bac-to-bac杆状病毒表达系统所产生的重组病毒多数情况下通过皮下注射的方式接种昆虫,效率低下,因此通过构建可同时表达polh基因和外源目的基因的真核表达系统进行抗菌肽基因工程的研究已成为一个热门话题。本研究应用bac-to-bac表达系统,构建含有家蚕抗菌肽cecropin B2基因与polh基因的双启动子载体,在家蚕中表达,获得具有抑菌活性的Cecropin B抗菌肽,并进行表达量分析,研究结果如下：1.获得重组杆状病毒BmNPV-CecB2/polh分别以质粒PET-32a-BmCecB2和野生型T3株基因组DNA为模板进行PCR扩增,合成BmCecB2基因和polh基因,再将两个基因克隆到pFastbacDual转移载体Pp10和Pph的MCS的下游,构建重组质粒pFastbacDual-CecB2/polh,再转化到DH10bac E.coli感受态细胞,发生转座,获得重组bacmid-CecB2/polh, bacmid DNA通过转染BmN细胞获得重组杆状病毒BmNPV-CecB2/polh。2.目的基因在家蚕幼虫中表达及鉴定重组bacmid-CecB2/polh通过脂质体介导转染BmN细胞,转染72h后,BmN细胞有明显的感染症状,在显微镜下可见细胞呈现圆球形,并能观察到大量的多角体。重组病毒液经口添食家蚕幼虫,144h后,添食重组病毒的家蚕有明显感染症状,蚕血呈乳白色,收集受感染家蚕的血液,超声裂解细胞,Tricine-SDS-PAGE结果表明家蚕抗菌肽cecropin B基因与polh基因在家蚕体中均得到表达,家蚕抗菌肽cecropin B基因大小约为4.9KD,polh基因大小约为29KD。抑菌试验的结果显示表达的家蚕抗菌肽Cecropin B具有抑菌活性,抑菌直径为10mm。ELISA表达量检测结果得知蚕体粗提物中BmCecB2平均浓度0.115μ/mL,蚕血BmCecB2平均浓度为0.109μg/mL,为今后进一步的实验研究提供依据。通过以上研究结果表明,构建双启动子表达载体同时表达家蚕抗菌肽cecropin B基因及polh基因,由此获得的重组病毒既可以在家蚕培养细胞内表达,也可以利用多角体经口添食感染家蚕幼虫实现高效率表达,为大规模生产及畜牧业应用提供理论基础。

关键词：抗菌肽Cecropin B 多角体蛋白 pFastbacDual bac-to-bac表达系统抗菌活性

基于bac-to-bac系统研究BmSPR基因在昆虫细胞的表达

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基于Bac-to-Bac系统研究BmSPR基因在昆虫细胞的表达

作者：戴伟宏安徽农业大学

学位级别：硕士

墨蝶呤还原酶(SPR)是生物体内催化GTP分解代谢合成四氢生物蝶呤(BH4)最后一步反应的关键酶。对SPR的研究主要集中在高等脊椎动物,在昆虫中的研究报道不多。我们的前期研究表明家蚕(Bombyx mori)的SPR基因(BmSpr)是决定黄体色突变体(lem... 详细信息

墨蝶呤还原酶(SPR)是生物体内催化GTP分解代谢合成四氢生物蝶呤(BH4)最后一步反应的关键酶。对SPR的研究主要集中在高等脊椎动物,在昆虫中的研究报道不多。我们的前期研究表明家蚕(Bombyx mori)的SPR基因(BmSpr)是决定黄体色突变体(lem)的遗传基因,家蚕具有与哺乳动物相似的BH4从头合成途径。墨蝶呤(SP)是形成昆虫体表色的内源性色素之一,也是GTP分解代谢途径的中间产物,大量沉积于lem蚕幼虫的体表。SP也可在SPR和二氢叶酸还原酶(DHFR)的催化作用下经补救途径合成BH4。作为芳香族氨基酸羟化酶和一氧化氮合酶的重要辅助因子,BH4的缺乏不仪可以引发苯丙酮尿症等牛理代谢疾病,而且能够致使多种神经性代谢综合症,同时也是导致高血压、动脉粥样硬化、糖尿病等内皮功能异常的重要原因。木实验室近两年已经研究了BmSPR的原核表达及酶活特征,试图以从lem蚕幼虫提纯的SP为底物,通过共表达BmSPR和BmDHFR,建立体外合成BH4的实验体系。本研究首先利用在线分析软件对BmSPR的疏水性、信号肽、亚细胞定位、功能结构域以及蛋白高级结构进行了全面的生物信息学分析和预测。其次,利用bac-to-bac昆虫杆状病毒表达系统,在两种昆虫培养细胞BmN和Sf9中进行了BmSPR的真核表达研究及重组蛋白的鉴定。在bac-to-bac表达实验中,首先将BmSpr克隆到杆状病毒表达载体pFastbacHT B中,获得了重组质粒pFastbacHT B-BmSpr,再将该重组质粒分别转化到含有不同杆状病毒粒子(bacmid)的AcMNPV和BmNPV的DH10bac感受态细胞株。在含有能够表达转座酶的辅助质粒DH10bac的细胞中完成同源重组,获得了重组杆状病毒,分别命名为pAc-BmSpr和pBm-BmSpr。经过验证所获得重组bacmid准确无误后,参照Lipofectamine 2000的说明书,以脂质体介导法用重组bacmid pAc-BmSpr和pBm-BmSpr分别转染相应的宿主细胞Sf9和BmN。通过多次感染,获得较高的病毒滴度后,大量感染宿主细胞,以收获重组目的蛋白BmSPR。SDS-PAGE和Western Blot的检测结果表明,重组蛋白BmSPR在两种昆虫细胞中都能够稳定地表达。bac-to-bac昆虫杆状病毒表达系统具有高效安全性,并能获得生物学活性完全的目的酶蛋白。木研究为今后利用该表达系统大量表达和纯化重组BmSPR,进一步开展BH4体外制备的应用基础研究奠定了必要的实验基础。

关键词：墨蝶呤还原酶生物信息学 bac-to-bac表达系统昆虫细胞

BVDV-1病毒样颗粒的构建及免疫原性研究

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BVDV-1病毒样颗粒的构建及免疫原性研究

作者：杨霞延边大学

学位级别：硕士

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是引起牛病毒性腹泻的病原体,BVDV分为两种基因型BVDV-1和BVDV-2,目前BVDV-1主要用于疫苗的生产诊断和研究。VLP由病毒的一种或多种蛋白组成,携带病毒的许多特征,可用于疫苗开发。本试验以BVDV-1(BVDV-BA)基因组... 详细信息

牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是引起牛病毒性腹泻的病原体,BVDV分为两种基因型BVDV-1和BVDV-2,目前BVDV-1主要用于疫苗的生产诊断和研究。VLP由病毒的一种或多种蛋白组成,携带病毒的许多特征,可用于疫苗开发。本试验以BVDV-1(BVDV-BA)基因组为模板,构建由C、E、E1、E24种结构蛋白组成的BVDV-1病毒样颗粒,在构建出BVDV-1 VLPs的基础上对BVDV-1 VLPs免疫原性进行检测,以期能够为BVDV的预防提供新型、安全、高效潜在候选疫苗。首先试验以BVDV-BA株基因组为模板,通过RT-PCR方法获得C、E、E1和E2目的基因,将扩增得到的C、E、E1和E2基因克隆至p EASY-Blunt载体上,将重组质粒转化至Trans5α感受态细胞。将克隆得到C、E、E1和E2基因分别克隆到杆状病毒穿梭载体p Fast bac HTA中,得到重组穿梭质粒,将重组穿梭质粒转化至DH10bac大肠杆菌感受态细胞,获得阳性重组杆粒r B-C、r B-E、r B-E1、r B-E2;将重组杆粒转分别染至SF9细胞,拯救重组杆状病,获得重组杆状病毒r BV-C、r BV-E、r BV-E1、r BV-E2。用Western Blot检测P1代重组杆状病毒的蛋白表达情况,将重组杆状病毒传三代进行扩大培养,同时利用Western Blot等方法检测P2代和P3代重组杆状病毒C、E、E1和E2蛋白的表达情况;利用SF9悬浮细胞大量制备BVDV-1 VLPs,并纯化BVDV-1VLPs;应用透射电镜形态观察。以氢氧化铝为佐剂,设置高剂量组(100μg BVDV-1 VLPs)、高剂量组加佐剂组(100μg BVDV-1 VLPs+氢氧化铝)、低剂量组(50μg BVDV-1 VLPs)、低剂量组加佐剂组(50μg BVDV-1 VLPs+氢氧化铝),对照组(PBS、氢氧化铝佐剂),采用肌肉注射的方式免疫雌性BALB/C小鼠,然后对试验各组小鼠脏器观察、体重进行测定,以及特异性抗体,淋巴细胞亚群数量、脾细胞分泌IFN-γ和IL-4检测分析,并对其在第三次免疫后的第12周进行特异性抗体检测,来验证免疫产生的抗体在体内的持续时间。琼脂糖凝胶电泳结果显示,试验成功克隆出目的基因C、E、E1和E2,并利用p Fast bac HTA载体,成功构建重组杆粒r B-C,r B-E,r B-E1和r B-E2。转染SF9细胞结果和Western-Blot鉴定蛋白表达结果显示通过拯救重组杆状病,成功获得了能表达BVDV-1的C、E、E1和E2蛋白的重组杆状病毒,且P1代、P2代和P3代均能稳定表达目的蛋白;电镜结果显示共感染策略成功包装出具有与BVDV形态结构相似的BVDV-1 VLPs。纯化BVDV-1 VLPs Western-Blot结果显示包装出的BVDV-1 VLPs包含有C、E、E1和E2 4种蛋白。小鼠免疫试验表明,小鼠体重有所增加,脏器形态结构的没有变化;BVDV-1 VLPs和BVDV-1 VLPs+氢氧化铝佐剂均能通过肌肉注射免疫途径诱导小鼠血清特异性抗体水平上升;BVDV-1 VLPs氢氧化铝佐剂能同时增加CD4+T细胞和CD8+T细胞的生成;BVDV-1 VLPs与氢氧化铝联用时能提高小鼠体内IFN-γ和IL-4分泌水平。说明BVDV-1 VLPs与氢氧化铝联用时能同时诱发试验组小鼠的细胞免疫应答和体液免疫应答,氢氧化铝佐剂能辅助BVDV-1 VLPs更好的诱发机体的免疫应答。抗体在体内持续时间检测结果显示在三免后的第12周仍能检测到特异性抗体的存在。综上所述,试验成功地扩增出BVDV-1中C、E、E1和E2目的基因;并且成功构建了由C、E、E1和E2 4种蛋白组成的BVDV-VLPs;BVDV-1 VLPs在与氢氧化铝联合使用免疫小鼠时引起机体细胞免疫应答和体液免疫应答。

关键词： BVDV-1 病毒样颗粒 bac-to-bac表达系统免疫原性

甘蓝夜蛾核型多角体病毒bac-to-bac系统的构建

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华中昆虫研究 2016年第1期 191-204页

作者：吴柳柳张忠信中国科学院武汉病毒研究所

甘蓝夜蛾核型多角体病毒(Mamestra brassicae multiple nucleopolyhedrovirus MbMNPV)作为广谱杆状病毒生物杀虫剂已广泛应用。本文成功构建一个能在多种商品化昆虫细胞中进行外源蛋白表达和基因工程操作的Ⅱ组甲型杆状病毒bac-to-bac... 详细信息

甘蓝夜蛾核型多角体病毒(Mamestra brassicae multiple nucleopolyhedrovirus MbMNPV)作为广谱杆状病毒生物杀虫剂已广泛应用。本文成功构建一个能在多种商品化昆虫细胞中进行外源蛋白表达和基因工程操作的Ⅱ组甲型杆状病毒bac-to-bac表达载体系统,该系统能在Tn368细胞中表达回复的病毒多角体蛋白,也可高效表达其他外源蛋白。该系统的建立为MbMNPV广谱杀虫特性机制研究及重组高效广谱杆状病毒株构建提供便利工具,具有商业开发价值。

关键词：甘蓝夜蛾核型多角体病毒 bac-to-bac表达系统感染能力

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白蜡虫蜡酯合酶在昆虫细胞Sf9中的表达

林业科学研究 2016年第2期29卷 191-195页

作者：亓倩于淑惠孙涛王雪庆刘博文杨璞陈晓鸣中国林业科学研究院资源昆虫研究所国家林业局资源昆虫培育与利用重点实验室云南昆明650224

[目的]本研究欲利用bac-to-bac表达系统,在Sf9细胞中表达WS。[方法]将WS编码序列克隆到质粒p Fastbac^(TM)HT B后,转化大肠杆菌DH10bac^(TM),经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆粒r bacmid/Epel WS。将r bacmid/EpelWS转染Sf9细胞。[结果]... 详细信息

[目的]本研究欲利用bac-to-bac表达系统,在Sf9细胞中表达WS。[方法]将WS编码序列克隆到质粒p Fastbac^(TM)HT B后,转化大肠杆菌DH10bac^(TM),经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆粒r bacmid/Epel WS。将r bacmid/EpelWS转染Sf9细胞。[结果]免疫荧光标记检测表明:WS在受感染细胞的细胞质中表达。[结论]本研究成功表达了白蜡虫WS,为白蜡虫WS的生化特性研究奠定了基础。

关键词：白蜡虫蜡酯合酶载体构建 bac-to-bac表达系统 Sf9细胞系

家蚕微孢子虫SWP25基因BmN细胞表达质粒的构建及表达

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江苏农业学报 2016年第5期32卷 1023-1028页

作者：肖圣燕李镇刚冉瑞法黄平朱峰沈中元云南省农业科学院蚕桑蜜蜂研究所云南蒙自661101 江苏科技大学江苏镇江212003 中国农业科学院蚕业研究所江苏镇江212018

本研究旨在构建含家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25的家蚕卵巢细胞(BmN)表达质粒,检测该基因在宿主细胞中的表达,为在细胞水平筛选与家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25相互作用的宿主蛋白奠定基础。利用家蚕核型多角体病毒bac-to-bac表达系统,将... 详细信息

本研究旨在构建含家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25的家蚕卵巢细胞(BmN)表达质粒,检测该基因在宿主细胞中的表达,为在细胞水平筛选与家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25相互作用的宿主蛋白奠定基础。利用家蚕核型多角体病毒bac-to-bac表达系统,将家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25和报告基因EGFP克隆到杆状病毒转移载体pFast bac1中,转化BmDH10bac感受态细胞并筛选阳性重组质粒用于转染BmN细胞。经PCR技术鉴定,成功获得重组杆状病毒质粒v BmEGFP-SWP25。在转染成功的细胞中可观测到绿色荧光信号。使用Western blot方法在感染重组病毒的家蚕BmN细胞中检测到大小约55 000的重组蛋白条带,与理论值一致,表明家蚕微孢子虫孢壁蛋白基因SWP25在BmN中成功表达。

关键词：家蚕微孢子虫孢壁蛋白SWP25基因 bac-to-bac表达系统重组质粒转染融合蛋白表达

家蚕蜕皮激素受体基因EcR-A的启动子活性区域分析

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蚕业科学 2014年第6期40卷 1000-1005页

作者：杜杰黄明霞刘云垒赵国栋卫正国沈卫德苏州大学基础医学与生物科学学院江苏苏州215123 现代丝绸国家工程实验室江苏苏州215123

昆虫蜕皮激素(20-羟基蜕皮酮)与蜕皮激素受体(EcR)和超气门蛋白(USP)相互作用启动蜕皮级联反应过程,由EcR和USP组成的复合物是蜕皮激素的作用靶标。为研究家蚕EcR-A基因(Bm EcR-A)的转录调控机制,利用双荧光素酶报告系统和bac-to-bac表... 详细信息

昆虫蜕皮激素(20-羟基蜕皮酮)与蜕皮激素受体(EcR)和超气门蛋白(USP)相互作用启动蜕皮级联反应过程,由EcR和USP组成的复合物是蜕皮激素的作用靶标。为研究家蚕EcR-A基因(Bm EcR-A)的转录调控机制,利用双荧光素酶报告系统和bac-to-bac表达系统制备含5'端长度不同Bm EcR-A基因启动子片段的重组杆状病毒,分别将重组杆状病毒感染家蚕后检测启动子的活性。结果表明,在Bm EcR-A启动子的-637^-518 bp和-278^-177 bp区域存在正调控元件,并且能被0.002 g/L 20E诱导。通过构建含5'端长度不同Bm EcR-A启动子片段的荧光素酶报告质粒,在细胞水平上进一步分析Bm EcR-A启动子活性区域,结果显示:在-637^-612 bp和-278^-177 bp区域包含Bm EcR-A基因启动子转录调控必需的重要调控元件;当删除-197^-177 bp区域后,启动子活性明显增强,推测在该区域可能含有一个转录抑制因子结合位点。研究结果提示:上述启动子区域包含有转录调控元件的结合位点,是进一步研究Bm EcR-A启动子核心区域的重要线索。

关键词：家蚕蜕皮激素受体 EcR-A基因启动子活性双荧光素酶报告系统 bac-to-bac表达系统

同安钮夜蛾核型多角体病毒Opdi108基因的分子克隆和细胞定位(英文)

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昆虫学报 2012年第4期55卷 403-411页

作者：常润磊刘莉韦春梅郎国俊许雯毛珊珊林同华南农业大学林学院广州510642 国家林业局桉树研究开发中心广东湛江524022 浙江经贸职业技术学院应用工程系杭州310018 浙江大学昆虫研究所杭州310029

【目的】同安钮夜蛾Ophiusa disjungens(鳞翅目,夜蛾科)是危害桉树的主要害虫之一。同安钮夜蛾核型多角体病毒(OpdiNPV)是从O.disjungens中分离到的新病毒。本研究主要目的是从分子水平上了解该病毒。【方法】对一条PstⅠ的酶切片段进... 详细信息

【目的】同安钮夜蛾Ophiusa disjungens(鳞翅目,夜蛾科)是危害桉树的主要害虫之一。同安钮夜蛾核型多角体病毒(OpdiNPV)是从O.disjungens中分离到的新病毒。本研究主要目的是从分子水平上了解该病毒。【方法】对一条PstⅠ的酶切片段进行了克隆、测序和分析。【结果】在基因数据库中通过对碱基序列的比对,发现了一个Ac108的同源基因,命名为Opdi108(GenBank登录号为EU732666)。该基因的开放阅读框含有225对碱基,其编码蛋白与其他已知杆状病毒同源物有16%～37%的氨基酸序列一致性。在起始密码子ATG上游有一个晚期启动子TAAG。C末端含有His-tag的Opdi108基因在大肠杆菌中Escherichiacoli进行了表达,融合蛋白的分子量为28.7kDa。以荧光蛋白EGFP为标记物,构建了Opdi108与EGFP的重组体,利用bac-to-bac表达系统实现了与AcMNPV的重组,用该重组病毒vEGFP-Opdi108感染斜纹夜蛾Trichoplusiani细胞。感染24和72h后分别用共聚荧光显微镜观察,发现Opdi108定位在细胞质内。【结论】本研究从分子生物学角度研究OpdiNPV,为进一步利用该病毒防治包括同安钮夜蛾在内的害虫,以及构建重组杀虫剂等奠定基础。

关键词：同安钮夜蛾核型多角体病毒 bac-to-bac表达系统细胞定位 Opdi108