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生物工程学报 2014年第10期30卷 1594-1601页

作者：祁静刘涛李珍贡成良吴海苹张春中国科学院苏州生物医学工程技术研究所苏州市分子诊断与治疗技术重点实验室江苏苏州215163 苏州大学基础医学与生命科学学院江苏苏州215006 厦门市鲎试剂实验厂有限公司福建厦门361022

鲎C因子是鲎血细胞中一种对内毒素具有高亲和力的丝氨酸蛋白酶,被内毒素激活后可水解人工合成的三肽底物,因而能替代传统的鲎试剂用于内毒素检测。通过RT-PCR从东方鲎血细胞中扩增出鲎C因子基因(factor C)序列,利用bac-to-bac/bmnpv杆... 详细信息

鲎C因子是鲎血细胞中一种对内毒素具有高亲和力的丝氨酸蛋白酶,被内毒素激活后可水解人工合成的三肽底物,因而能替代传统的鲎试剂用于内毒素检测。通过RT-PCR从东方鲎血细胞中扩增出鲎C因子基因(factor C)序列,利用bac-to-bac/bmnpv杆状病毒表达系统在家蚕幼虫中表达该蛋白,并对其进行活性测定。结果显示:被感染的家蚕血清稀释后能检测到Factor C活性,稀释500倍的血清可以用于内毒素检测,且其灵敏度能达到0.2 EU/mL,有望开发新型的、低成本的内毒素检测试剂。

关键词：鲎C因子家蚕幼虫 bac-to-bac/bmnpv杆状病毒表达系统内毒素检测试剂

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家蚕核型多角体病毒ORF4的研究

家蚕核型多角体病毒ORF4的研究

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作者：苏武杰江苏大学

学位级别：硕士

根据NCBI同源比对,发现bmnpv ORF4(Bm4)与AcMNPV ORF11同源性最高,达96%,两者长度皆为1020bp。在29种已测序的杆状病毒中,还有另外三种杆状病毒中有Bm4的同系物,这三种病毒分别是Plutella xylostella multiplenucleopolyhedrovirus,Rachplusia ou multiple nucleopolyhedrovirus和Maruca vitrataMNPV。在Bm4的启动子区有早期启动子基序。然而,目前Bm4的功能完全未知。为了研究Bm4基因产物在病毒感染环境下在细胞中的定位,我们用融合到Bm4 3'端的EGFP作为报告基因,以bmnpv杆粒作为载体来表达Bm4-EGFP。用共聚焦扫描显微镜观察发现:荧光信号主要集中在细胞核内,然而在细胞膜上也有较弱的信号。通过用SnaBI和BamHI酶切pFastbacl,切除多角体启动子,置换上iel启动子和Bm4启动子,我们成功构建了在iel启动子和Bm4启动子驱动下表达外源基因的重组病毒,为构建Bm4缺失病毒的拯救病毒奠定了基础。同时,用我们构建的pFastbac-4p-EGFP(EGFP在Bm4启动子驱动下的重组转座载体)转染家蚕细胞发现:在没有病毒因子作用下,EGFP在Bm4启动子的驱动下就能表达,说明Bm4是一个立即早期基因。为了缺失Bm4,构建了Bm4转移载体,并将其与bmnpv杆粒共转染家蚕细胞。所得病毒连续感染家蚕3遍,之后,纯化病毒一次。然后提取病毒DNA,并将其转化进感受态DH10B细菌。然后将感受态DH10B细菌涂到含有卡那抗生素、X-gal和IPTG的平板上。挑取蓝色菌落,用Bm4引物做PCR鉴定。鉴定出一个含有Bm4缺失的杆粒的菌落。提取Bm4缺失的杆粒,并将其转染进家蚕细胞,转染后5天,发现细胞有感染症状。收集上清再感染另一瓶细胞,发现有感染症状,说明Bm4在家蚕细胞中不是病毒繁殖的必需基因。为了排出第二位点突变的可能,我们利用bac-to-bac/bmnpv杆状病毒表达系统,以及多角体启动子被iel启动子和Bm4启动子替换的重组转座载体,构建了在Bm4缺失杆粒的多角体基因座位表达Bm4的拯救病毒。为研究Bm4基因产物的具体功能奠定了基础。总之,根据我们的实验结果,可知Bm4是一个其蛋白产物主要定位于核内的立即早期、非必需基因。

关键词：家蚕核型多角体病毒读码框4(ORF4) bac-to-bac/bmnpv杆状病毒表达系统亚细胞定位 ie1启动子基因敲除拯救实验

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家蚕BmARM-like基因的克隆、表达与亚细胞定位研究

家蚕BmARM-like基因的克隆、表达与亚细胞定位研究

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作者：尤征英安徽农业大学

学位级别：硕士

本项目的前期研究工作通过荧光差异显示技术，比较分析了家蚕(Bombyx mori)对bmnpv不同抗性品系基因表达的差异，获得了一个差异表达的片段。本研究通过在家蚕数据库中的比对，获得了该片段所在基因的完整ORF框，分析该基因为一新基因... 详细信息

本项目的前期研究工作通过荧光差异显示技术，比较分析了家蚕(Bombyx mori)对bmnpv不同抗性品系基因表达的差异，获得了一个差异表达的片段。本研究通过在家蚕数据库中的比对，获得了该片段所在基因的完整ORF框，分析该基因为一新基因，在家蚕中未有研究报道，定名为BmARM-like基因，GenBank登录号为：JF500112，对该基因进行克隆、测序、序列分析、原核表达，并对该基因进行了时空表达及亚细胞定位研究，结果如下： 1.运用数据库分析BmARM-like基因的功能域，该基因含有一个Armadillo/beta-catenin-like repeat (ARM)结构和两个HEAT结构，根据有关文献报道ARM有可能参与Wnt信号途径的转导。根据BmARM-like基因的完整ORF的序列设计特异引物，通过RT-PCR方法扩增获得该基因编码框序列，其ORF为1923bp，编码640个氨基酸，其氨基酸序列与蜜蜂、果蝇、人和家鼠相似氨基酸同源性分别为32.50,24.53,22.27和19.11%。 2.将BmARM-like基因片段亚克隆到原核表达载体pET-28a(+)上，转化到BL21（DE3）感受态菌在大肠杆菌中，诱导表达，并对表达的重组蛋白纯化，制备了该重组蛋白的兔多克隆抗体。 3.运用Real-time PCR的方法分析了家蚕BmARM-like基因在P50和A35五龄三天幼虫的中肠、脂肪体、血液、精巢、卵巢和头六个组织的表达以及P50的不同发育阶段新产下三天的卵、幼虫、蛹和蛾的表达情况，结果表明：家蚕BmARM-like基因在P50和A35两品种中的同一组织表达量是有差异的，并且在同一品种的不同组织中家蚕BmARM-like基因的表达量也是有差异的;不同的发育阶段，卵的表达量较低，幼虫时表达量达到最大值，随后经过蛹、蛾又逐渐降低;而通过抗性水平检测实验表明A35对bmnpv的抗性高于P50，推测该基因表达产物有可能通过家蚕的血液组织抑制病毒的不同形式有关。 4.为了研究BmARM-like基因产物在病毒感染环境下细胞中的定位，将BmARM-like片段与EGFP报告基因融合，用杆状病毒表达系统构建了重组病毒：通过病毒感染观察，发现荧光信号主要定位于家蚕细胞的细胞核内，但细胞质和细胞膜上也有微弱的荧光信号。通过以上研究结果表明， BmARM-like基因在mRNA水平上主要在家蚕的中肠及血液组织中高表达，这与家蚕抗病毒的免疫组织主要是中肠和血液相一致;BmARM-like基因的表达产物主要定位在细胞核中，有可能参与一些重要的信号途径的转导相关。因此，本文的研究为进一步揭示BmARM-like基因产物的具体功能奠定了基础。

关键词：家蚕 BmARM-like基因表达分析 Real-time PCR bac-to-bac/bmnpv杆状病毒表达系统亚细胞定位

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