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bvdv和IBRV双重实时荧光定量PCR检测方法建立

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中国兽医杂志 2019年第11期55卷 28-31,36,I0003页

作者：刘梦瑶张秋楠吴文学李金祥中国农业大学动物医学院北京海淀100193 中国农业科学院北京海淀100083

根据牛病毒性腹泻病毒(bvdv)5′端非编码区和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gB基因保守区基因序列,参考文献分别合成了2对特异性引物和探针。利用构建的包含bvdv和IBRV目标基因片段的阳性质粒,对退火温度、引物和探针的浓度以及反应条件进... 详细信息

根据牛病毒性腹泻病毒(bvdv)5′端非编码区和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)gB基因保守区基因序列,参考文献分别合成了2对特异性引物和探针。利用构建的包含bvdv和IBRV目标基因片段的阳性质粒,对退火温度、引物和探针的浓度以及反应条件进行了优化,构建了实时荧光定量PCR(qPCR)标准曲线,并对双重qPCR方法的特异性、敏感性和重复性进行了评价。试验结果显示,qPCR最适退火温度为54.0℃,bvdv引物浓度为0.2μmol/L,IBRV引物浓度为0.3μmol/L,bvdv探针浓度0.2μmol/L,IBRV探针浓度为0.1μmol/L。bvdv的RNA最低检测限为100拷贝/μL,IBRV的DNA最低检测限为1拷贝/μL,并具有良好的特异性和重复性,为bvdv和IBRV的同时、快速、定量检测提供了有效的方法。

关键词： bvdv IBRV 实时荧光定量PCR(qPCR):探针

bvdv自体蛋白酶P20和核心蛋白P14基因的克隆及原核表达

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BVDV自体蛋白酶P20和核心蛋白P14基因的克隆及原核表达

作者：李慧昕东北农业大学

学位级别：硕士

牛病毒性腹泻-粘膜病病毒（Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus，bvdv）是黄病毒科、瘟病毒属（Flaviviridae Pestivirus）的代表种，主要引起牛的病毒性腹泻-粘膜病（BVD-MD），表现为腹泻，急、慢性粘膜病，持续性感染与免... 详细信息

牛病毒性腹泻-粘膜病病毒（Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus，bvdv）是黄病毒科、瘟病毒属（Flaviviridae Pestivirus）的代表种，主要引起牛的病毒性腹泻-粘膜病（BVD-MD），表现为腹泻，急、慢性粘膜病，持续性感染与免疫耐受，免疫抑制，母畜流产、死胎和畸胎等。该病呈世界范围分布，严重危害养牛业的发展。 bvdv P20和P14基因位于基因组的5’端，分别编码病毒的非结构蛋白——自体蛋白酶蛋白和结构蛋白核心蛋白，核心蛋白P14具有抗原性，而自体蛋白酶P20的抗原性尚未见报道。为了辅助基因工程亚单位疫苗的应用，本研究克隆bvdv P20和P14基因，并将其在原核系统中表达，旨在为基因工程诊断抗原的研究奠定基础，同时为P20蛋白抗原性的阐述作一必要铺垫。根据GenBank中bvdv Oregon C24V株基因组序列设计二对引物，应用RT-巢式PCR（RT-nested PCR）方法体外扩增bvdv Osloss-Like株P20基因，将其克隆至pMD18-T载体，序列测定及同源性分析表明，bvdv Osloss-Like株P20基因与bvdv VEDEVAC（AJ585412）、Osloss（M96687）、Oregon C24V（AF091605）、SD1（M96751）及NADL（AJ133738）株核苷酸同源性分别为99.21%、93.65%、80.95%、79.96%、78.97%。根据这一结果，参考GenBank上发表的bvdv Osloss株基因组序列设计一对引物，扩增P14基因，并进行序列测定及同源性分析，结果表明bvdv Osloss-Like株P14基因与bvdv VEDEVAC（AJ585412）、Osloss（M96687）、SD1（M96751）、Oregon C24V（AF091605）及NADL（AJ133738）株核苷酸同源性分别为98.37%、94.77%、82.53%、79.41%、78.76%。系统发生分析结果表明bvdv Osolss-Like株P20和P14基因与VEDEVAC株亲源关系较近。利用DNA重组技术，将bvdv P20和P14基因各分别亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1和pPROEX-HTb，构建P20和P14基因重组原核表达载体pGEX-6P-P20、pPROEX-HTb-P20、pGEX-6P-P14及pPROEX-HTb-P14。将上述重组质粒转化至工程菌，在IPTG诱导下重组质粒pGEX-6P-P20和pPROEX-HTb-P20得到高效表达，重组质粒pGEX-6P-P14表达量低，而重组质粒pPROEX-HTb-P14未见有明显表达。因此分别对重组质粒pGEX-6P-P14及pPROEX-HTb-P14的表达条件进行探索，根据结果推测bvdv Osloss-Like株P14基因表达的蛋白可能是一种毒性蛋白，其对大肠杆菌BL21（DE3）pLysS和DH5α具有毒性。

关键词： bvdv P20基因 P14基因克隆原核表达

bvdv囊膜蛋白E0、E1和E2基因的克隆及原核表达

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BVDV囊膜蛋白E0、E1和E2基因的克隆及原核表达

作者：何海娟东北农业大学

学位级别：硕士

牛病毒性腹泻-粘膜病病毒（Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus,bvdv）是黄病毒科、瘟病毒属（Flaviviridae Pestivirus）的成员,主要引起牛病毒性腹泻-粘膜病（BVD-MD）,症状为腹泻,急、慢性粘膜病,持续性感染与免疫耐受,免... 详细信息

牛病毒性腹泻-粘膜病病毒（Bovine viral diarrhea-mucosal disease virus,bvdv）是黄病毒科、瘟病毒属（Flaviviridae Pestivirus）的成员,主要引起牛病毒性腹泻-粘膜病（BVD-MD）,症状为腹泻,急、慢性粘膜病,持续性感染与免疫耐受,免疫抑制,母畜流产、死胎和畸胎等。该病主要发生于牛,犊牛更易感,还可感染其它动物及人。牛病毒性腹泻粘膜病是全球性传染病,具有较高的感染率,我国二十几个省市自治区均存在本病,且在各易感动物群中的感染已呈日益扩大趋势。且常规的bvdv 疫苗不能提供有效的保护,因此从分子生物学水平上对该病原进行研究具有重要的意义。bvdv E0、E1 和E2 基因位于基因组5’端的三分之一部分,分别编码病毒的结构蛋白（囊膜蛋白E0、E1 和E2）,囊膜蛋白E0 和E2 具有抗原性,而E1 的抗原性未见有报道。根据GenBank 中bvdv Osloss 株基因组序列设计一对引物,应用RT-PCR 方法体外扩增bvdv VEDEVAC-Like 株E0 基因,将其克隆至pMD18-T 载体,序列测定及同源性分析表明,bvdv VEDEVAC-Like 株E0 基因与bvdv VEDEVAC（AJ585412）、Oslos（sM96687）、NADL（AJ133738）、SD1（M96751）及Oregon C24V（AF091605）株E0 基因核苷酸同源性分别为99.41%0.91%。根据这一结果,参考GenBank 上发表的bvdv VEDEVAC 株基因组序列设计二对引物,应用RT-巢式PCR（RT-nested PCR）方法扩增E2 基因,并进行序列测定及同源性分析,结果表明bvdv VEDEVAC-Like 株E2 基因与bvdv VEDEVAC（AJ585412）、Osloss（M96687）、SD1（M96751）、Oregon C24V（AF091605）及NADL（AJ133738）株E2 基因核苷酸同源性分别为98.58%2.82%。根据E2 基因测序结果,参考GenBank 上发表的bvdv VEDEVAC 株基因组序列设计一对引物,扩增E1 基因,并进行序列测定及同源性分析,结果表明bvdv VEDEVAC-Like 株E1 基因与bvdv VEDEVAC（AJ585412）、Osloss（M96687）、SD1（M96751）、Oregon C24V（AF091605）及NADL（AJ133738）株核苷酸同源性分别为100%6.75%。系统发生分析结果表明bvdv VEDEVAC-Like 株E0、E1 和E2 基因与VEDEVAC 株亲源关系较近。利用DNA重组技术,将bvdv E0、E1和E2基因分别亚克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建E0、E1 和E2 基因重组原核表达载体pGEX-6P-E0、pGEX-6P-E1 和pGEX-6P-E2。将上述重组质粒转化至工程菌,在IPTG 诱导下重组质粒pGEX-6P-E0、pGEX-6P-E1 和pGEX-6P-E2 均得到成功表达。本研究克隆bvdv E0、E1 和E2 基因,并将其在原核系统中表达,旨在为基因工程诊断抗原和亚单位疫苗的研究奠定基础,同时为E1 蛋白抗原性的阐明提供必要物质基础。

关键词： bvdv E0 基因 E1 基因 E2 基因克隆原核表达

bvdv荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

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广东农业科学 2011年第11期38卷 154-157页

作者：姚晓辉李华强陈瑞爱练炳洲王林川邓月嫦王凤国广东大华农动物保健品股份有限公司广东新兴527400

根据GenBank中登录的牛病毒性腹泻病毒(bvdv)毒株序列,选择5’NTR保守区域设计1对特异性引物和1条Taqman探针,通过矩阵法筛选引物探针的最佳浓度,建立了检测bvdv的荧光RT-PCR方法。结果显示,用1.5μL上下游引物混合液(10μmol/L)和0.5μ... 详细信息

根据GenBank中登录的牛病毒性腹泻病毒(bvdv)毒株序列,选择5’NTR保守区域设计1对特异性引物和1条Taqman探针,通过矩阵法筛选引物探针的最佳浓度,建立了检测bvdv的荧光RT-PCR方法。结果显示,用1.5μL上下游引物混合液(10μmol/L)和0.5μL探针溶液(10μmol/L)对bvdv进行检测,可获得较小Ct值、较高吸光值,并可降低检测成本。对该方法进行特异性、敏感性和重复性试验,结果表明,该方法敏感性高、特异性强、重复性好。将该方法应用在疫苗生产中,可快速准确地筛选出合格的原辅材料和半成品,为生产提供及时准确可靠的数据。

关键词： bvdv 荧光RT—PCR 检测方法

bvdv纳米抗体的筛选、表达及抗病毒效果的研究

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BVDV纳米抗体的筛选、表达及抗病毒效果的研究

作者：张国奇石河子大学

学位级别：硕士

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,bvdv)主要引起牛病毒性腹泻-粘膜病(BVD-MD),该病尚无完全有效的防制措施,对养牛业造成巨大的损失。骆驼体内发现存在一种天然缺失轻链的重链抗体,仅由其可变区组成的抗体称为单域抗体,... 详细信息

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,bvdv)主要引起牛病毒性腹泻-粘膜病(BVD-MD),该病尚无完全有效的防制措施,对养牛业造成巨大的损失。骆驼体内发现存在一种天然缺失轻链的重链抗体,仅由其可变区组成的抗体称为单域抗体,又称为纳米抗体。纳米抗体具有高亲和力、高稳定性、强组织穿透性、高效表达等优点。构建抗bvdv纳米抗体基因文库,利用噬菌体展示技术获得高表达、特异性强的纳米抗体,为防治bvdv奠定基础。本文的主要研究内容如下:1、bvdv纳米抗体基因文库的库容量和多样性鉴定。本实验采用稀释计算法测定已构建的文库库容量,随机挑取24个单菌落进行菌液PCR对抗体文库的重组率鉴定,阳性单克隆测序;利用MEGA 4.0构建系统进化树、DNAMAN分析氨基酸序列同源性,评价基因文库的多样性。结果表明基因文库库容达到1.22×106、重组率约83.3%、氨基酸序列同源性为63.51%,说明文库在保存过程中其库容量没有受到环境的影响,多样性丰富。2、bvdv纳米抗体文库的筛选和克隆鉴定。利用M13K07辅助噬菌体对基因文库拯救得到噬菌体展示文库,测定其滴度。以bvdv全病毒作为目标抗原,将其结合于固相上,加入噬菌体展示文库,经三轮“吸附-洗脱-扩增”亲和筛选后,随机挑取单克隆进行ELISA检测。结果拯救的噬菌体展示文库滴度约1.2×1013 cfu/mL,三轮筛选使噬菌体文库中的特异性单克隆得到有效的富集,ELISA检测得到1株阳性克隆,命名为VHH-A6。3、bvdv纳米抗体的原核表达和功能验证。根据VHH-A6基因的测序序列,设计引物,采用PCR扩增技术克隆VHH-A6基因,构建pET-28a(+)-VHH-A6重组原核表达载体,经SDS-PAGE检测目的蛋白,Ni柱纯化得到高纯度的目的蛋白,在细胞水平验证VHH-A6纳米抗体对bvdv复制的影响。结果表明:成功获得VHH-A6基因及其重组原核表达载体,得到高纯度的目的蛋白。利用实时荧光定量PCR(RT-q PCR)测定MDBK细胞内的病毒拷贝数,结果发现100μg/mL的VHH-A6纳米抗体对bvdv的复制有一定阻断效果。本研究通过对bvdv纳米抗体文库进行三轮亲和筛选,从中筛选获得与bvdv特异性结合的纳米抗体VHH-A6片段,对其进行原核表达并纯化,细胞水平验证VHH-A6对bvdv的复制有一定的阻断效果,为进一步探讨纳米抗体干扰病毒复制机理奠定基础。

关键词： bvdv 纳米抗体筛选原核表达复制

bvdv-1型E2蛋白亚单位疫苗的制备及免疫效果评价

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BVDV-1型E2蛋白亚单位疫苗的制备及免疫效果评价

作者：曹慧西南民族大学

学位级别：硕士

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,bvdv)是由囊膜包裹的单股正链RNA病毒,属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus),bvdv侵袭机体后可引起持续性感染,对全球养牛业造成了不可估量的损失。目前对bvdv进行预防的主要... 详细信息

牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,bvdv)是由囊膜包裹的单股正链RNA病毒,属于黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属(Pestivirus),bvdv侵袭机体后可引起持续性感染,对全球养牛业造成了不可估量的损失。目前对bvdv进行预防的主要措施为接种具有良好免疫效果的疫苗,在中国主要以灭活疫苗为主进行免疫和预防,而尚无bvdv的E2亚单位疫苗投入生产并使用。本研究对四川地区bvdv流行毒株E2基因进行分析,bvdv-1型E2部分基因进行原核表达并制备亚单位疫苗,并对其免疫效果进行评价,取得成果如下:1.四川地区bvdv流行毒株E2基因序列分析利用RT-PCR方法,对2021年采自四川3个地区275份牛粪便样本进行bvdv检测。结果显示,bvdv总检出率为27.64%(76/275),进化结果分析表明均bvdv-1a亚型。从3个地区挑选15株阳性样本成功扩增出9株E2全基因并克隆测序,结果显示9株E2基因之间核苷酸长度约为1073～1100bp,同源性大概在72.4%～99%之间,而氨基酸同源性约为61.5%～100%。对已扩增的9株E2蛋白与本实验室疫苗株SMU-Z6/1a/SC/2016毒株的E2基因进行氨基酸突变位点分析及抗原决定簇预测比较。结果显示9株阳性毒株中有5株(RL6、LZ5、R3-5、LZ3、R1-1)在残基148-312内抗原决定簇与SMU-Z6/1a/SC/2016的抗原决定簇完全相同。结果表明9条E2基因与本实验室所分离的疫苗株SMU-Z6/1a/SC/2016毒株遗传关系最近,都与bvdv-1a聚在一个分支,具有一致的基因型。为了了解9株E2基因的重组现象,进行基因重组分析,结果显示只有毒株GK2的E2基因有重组,但其重组后主要亲本为本实验扩增毒株R3-14,次要亲本为SMU-Z6/1a/SC/2016,均为bvdv-1a型。本实验结果表明,bvdv-1a型在四川地区牛群中广泛存在和流行,为四川地区bvdv的防治及临床诊断提供了一定的理论依据。***-1型E2基因蛋白原核表达、纯化及间接ELISA方法的建立根据E2序列结果,选取本实验室分离的疫苗株SMU-Z6/1a/SC/2016的E2部分基因进行扩增,并对其进行诱导表达,可溶性分析,纯化复性,通过Western Blot鉴定。结果表明成功构建E2重组原核表达载体,重组菌在0.3 m M的IPTG,37℃条件下诱导6h成功表达以包含体形式存在的E2重组蛋白,大小约为40 KDa,能与兔抗SMU-Z6/1a/SC/2016高免血清发生反应,有良好的反应原性。为了建立bvdv-1型抗体检测的间接ELISA方法,以本研究制备的bvdv E2重组蛋白为抗原,经过对抗原包被浓度、一抗等条件进行优化,建立间接ELISA检测方法。优化结果为E2蛋白的包被浓度为1μg/m L,一抗稀释度为1:100,判定ODnm≥0.357为阳性。该方法为后续E2亚单位疫苗诱导动物抗体水平的评价提供了技术手段。***-1型E2重组蛋白亚单位疫苗免疫效果评价为了制备bvdv-1型E2亚单位疫苗,将MONTANIDE ISA 201 VG佐剂与等体积的纯化后的E2重组蛋白进行充分乳化得到bvdv-1型E2重组蛋白亚单位疫苗,并对其进行检验,结果显示,本研究成功制备了无污染,且稳定性、安全性良好bvdv-1型E2重组蛋白亚单位疫苗。为了评价bvdv-1型E2亚单位疫苗的免疫效果,以200μg蛋白/只的剂量免疫新西兰大白兔,利用抗体中和试验和间接ELISA方法检测免疫后兔血清抗体消长规律。ELISA检测结果显示在二免14 d后血清中抗体水平最高为3.39,中和抗体效价在二免21 d达到最高,为1:186。以1 mg蛋白/头的剂量颈部肌肉注射免疫肉牛,以同样的方法检测牛血清抗体消长,结果显示,免疫牛后收集血清测定ELISA抗体效价发现在二免14 d达到最高3.3671。对牛血清中和抗体效价进行测定,E2亚单位疫苗组中和抗体在一免后即可检测到有抗体产生,二免7 d中和抗体效价达到1:285以上,二免后28 d抗体效价达到最高1:2185,最低为1:89,表明制备的E2亚单位疫苗能有效刺激兔和牛产生较高水平的特异性抗体。为了进一步研究E2亚单位疫苗能否诱导对小鼠的保护作用,本研究对SPF级BALB/c小鼠进行免疫,二免后21 d,以本实验室分离的疫苗株SMU-Z6/1a/SC/2016对每只小鼠灌胃攻毒1m L,并在攻毒后检测小鼠血常规和粪便病毒载量。结果表明,攻毒后第5 d和第9 d,E2亚单位疫苗组白细胞、淋巴细胞、血小板含量均高于灭活疫苗组和空白攻毒组,低于阴性对照组。对攻毒后小鼠粪便病毒荷载量进行测定,结果显示E2亚单位疫苗组小

关键词： bvdv 流行病学调查 E2基因亚单位疫苗 ELISA 免疫效果

bvdv基因E_0在人参发根的转化及其分子检测

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中国农学通报 2011年第10期27卷 239-242页

作者：李然臧埔郜玉钢马琳王亚星李学李萍张连学吉林农业大学中药材学院长春130118

将重组鹿源bvdv基因E0植物表达载体(pBI121/E0),通过发根农杆菌Ri介导,用叶盘法转化得到人参发根,分别用PCR、RT-PCR检测其转化情况。结果表明:获得了转鹿源bvdv基因E0人参发根,鹿源bvdv基因E0已整合到人参发根基因组中并得到了转录,为... 详细信息

将重组鹿源bvdv基因E0植物表达载体(pBI121/E0),通过发根农杆菌Ri介导,用叶盘法转化得到人参发根,分别用PCR、RT-PCR检测其转化情况。结果表明:获得了转鹿源bvdv基因E0人参发根,鹿源bvdv基因E0已整合到人参发根基因组中并得到了转录,为研制转基因人参发根疫苗提供了科学依据和材料。

关键词： bvdv E0基因人参发根 RT-PCR

bvdv 1型和2型焦磷酸测序检测方法的建立

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中国兽医杂志 2014年第7期50卷 14-17页

作者：刘海生张永强赵永刚吴延功王清华任炜杰吕艳刘春菊王志亮单虎青岛农业大学山东省兽药诊断试剂工程技术研究中心山东省高校预防兽医学重点试验室山东青岛266109 中国动物卫生与流行病学中心山东青岛266032

为了建立bvdv 1型和2型焦磷酸测序检测方法,用于bvdv的确诊和分型。根据GenBank中发表的bvdv 5'-UTR序列,设计通用扩增引物和分别针对bvdv 1型和2型的两条测序引物。以bvdv 1型BA株和bvdv 2型分离株为模板,用通用引物进行RT-PCR扩增,用... 详细信息

为了建立bvdv 1型和2型焦磷酸测序检测方法,用于bvdv的确诊和分型。根据GenBank中发表的bvdv 5'-UTR序列,设计通用扩增引物和分别针对bvdv 1型和2型的两条测序引物。以bvdv 1型BA株和bvdv 2型分离株为模板,用通用引物进行RT-PCR扩增,用测序引物对扩增产物进行焦磷酸测序,建立bvdv 1型和bvdv 2型焦磷酸测序检测方法。结果显示,焦磷酸测序技术检测的序列为30个碱基以上,可用于bvdv的快速鉴定和分型。用该方法对奶牛场86份抗凝血样品进行检测。共检测出2份bvdv 1型,没有检测出bvdv 2型。将检测为阳性的RT-PCR产物测序,测序结果与焦磷酸测序结果一致,符合率为100%。表明本研究建立的bvdv 1型和2型焦磷酸测序检测方法,可用于bvdv的检测和分型,能一次性对待检样品进行确诊,是一种简便、快速的bvdv分型检测方法,对于bvdv的快速确诊具有重要意义。

关键词： bvdv 焦磷酸测序分型

河北部分地区四种肉犊牛腹泻病原调查及bvdv抗体检测方法建立

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河北部分地区四种肉犊牛腹泻病原调查及BVDV抗体检测方法建立

作者：刘勃兴河北科技师范学院

学位级别：硕士

在河北省,犊牛腹泻病是造成肉犊牛死亡和经济损失的主要疾病。在犊牛腹泻病的病因中,大肠杆菌(Escherichia coli,***)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,bvdv)、牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCo V)和牛轮状病毒(Bovine... 详细信息

在河北省,犊牛腹泻病是造成肉犊牛死亡和经济损失的主要疾病。在犊牛腹泻病的病因中,大肠杆菌(Escherichia coli,***)、牛病毒性腹泻病毒(Bovine viral diarrhea virus,bvdv)、牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCo V)和牛轮状病毒(Bovine rotavirus,BRV)是主要致病原。为了解上述四种传染性病原在河北地区犊牛腹泻病料中的阳性率,本研究自2018年至2020年收集河北省秦皇岛市、唐山市、石家庄市等市患腹泻病肉犊牛样品共计804份,19.28%(155/804)的样品检测出上述四种病原。肉犊牛腹泻样品中共计分离*** 649株,分离数量最多,进一步通过小鼠致病性试验验证分离***的致病性,共计有120株***具有致病性,检出率为14.93%(120/804)。其中,O型是致病性***检出率最高的血清型,其次为O型。通过RT-PCR检测样品中bvdv、BCo V和BRV三种病毒性病原,BCo V检出率为3.61%(29/804)、BRV检出率为2.99%(24/804)、bvdv检出率为0.87%(7/804)。混合感染样品数量占比14.84%(23/155),检出率较高的病原混合感染组合形式为:致病性***+BCo V、致病性***+BRV、BCo V+BRV。在国内,bvdv抗体ELISA检测试剂盒主要进口于国外,而国内商品化试剂盒的品牌和种类较少,这导致我国bvdv抗体检测成本较高。bvdv的E蛋白可诱导产生中和抗体,是疫苗和诊断试剂研发的靶蛋白。为了降低bvdv抗体检测成本,了解河北地区牛群bvdv抗体阳性率,本研究以河北地方bvdv毒株为试验材料,用***原核表达系统成功获得了E蛋白。以该蛋白为包被抗原建立bvdv抗体间接ELISA检测方法,并应用该方法检测河北地区牛血清样品的bvdv抗体阳性率。试验结果显示,本研究建立的bvdv抗体ELISA检测方法能特异性识别bvdv抗体阳性血清,具有较高的灵敏度(阳性血清最大稀释倍数为1 600倍)和重复性(批内和批间的变异系数均小于10%),与IDEXX试剂检测同一批样品的总符合率为93.33%。应用该方法对河北地区18家牛场的477份血清样品进行检测,其中接种疫苗牛场的血清阳性率为30.43%～92.86%,未接种免疫牛场抗体阳性率为0～100%。本研究通过对河北地区肉犊牛腹泻样品中四种病原进行流行病学调查,为河北地区由四种病原引起的肉犊牛腹泻病的防控提供数据参考,同时本研究建立的bvdv抗体ELISA检测方法为河北地区bvdv的监测和防控提供技术支持。

关键词：肉犊牛腹泻病病原流行病学调查 bvdv ELISA