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热休克蛋白70过表达对过氧化氢诱导brl细胞caspase 3表达的影响

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中国生物制品学杂志 2016年第2期29卷 129-133页

作者：计红张伟宏连帅王慧马莉李悦郭景茹郭文晋李士泽杨焕民黑龙江八一农垦大学黑龙江大庆163319

目的探讨热休克蛋白（heat shock protein,Hsp）70过表达对过氧化氢（hydrogen peroxide,H_2O_2）诱导Buffalo大鼠肝细胞（brl细胞）cleaved caspase 3表达的影响。方法将brl细胞分为6组：空白对照组、Ad-CMV-Null组、Ad-CMV-Hsp70组、H_2O_2组、Ad-CMV-Null＋H_2O_2组和Ad-CMV-Hsp70＋H_2O_2组,Ad-CMV-Null、Ad-CMV-Hsp70、AdCMV-Null＋H_2O_2、Ad-CMV-Hsp70＋H_2O_2组分别加入1×10~7 PFU/ml的Ad-CMV-Null或Ad-CMV-Hsp70培养48 h后,H_2O_2、Ad-CMV-Null＋H_2O_2和Ad-CMV-Hsp70＋H_2O_2组分别加入150μmol/L H_2O_2处理2 h,空白对照、Ad-CMVNull和Ad-CMV-Hsp70组分别加入培养液培养。分别采用实时荧光定量PCR检测细胞中Hsp70基因mRNA的转录水平,Western blot法检测细胞中Hsp70及cleaved caspase 3蛋白的表达水平。结果与H_2O_2组相比,Ad-CMVHsp70＋H_2O_2组细胞中Hsp70基因mRNA的转录水平和蛋白表达水平均显著升高（P〈0.01）,cleaved caspase 3蛋白表达水平显著下降（P〈0.01）。结论Hsp70可抑制caspase 3的激活最终保护brl细胞,减少凋亡损伤。

关键词：热休克蛋白70 brl细胞 caspase 3 过氧化氢

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过氧化氢诱导brl细胞凋亡损伤模型的建立

中国兽医学报 2015年第5期35卷 774-778,788页

作者：王慧计红薛琳琳耿仁德郭静茹王建发孔凡志杨焕民郭丽黑龙江八一农垦大学动物科技学院黑龙江大庆163319 黑龙江职业学院黑龙江双城150111 黑龙江农垦总局建三江分局勤得力农场第六管理区黑龙江同江156426

动物冷应激过程中肝脏因发生氧化应激而受损。本试验采用过氧化氢(H2O2)诱导buffalo大鼠肝细胞(brl)凋亡,建立体外氧化应激的凋亡损伤模型,为深入研究冷应激对肝脏损伤的机理奠定基础。试验采用不同浓度H2O2刺激brl细胞2h,运用WST-1法... 详细信息

动物冷应激过程中肝脏因发生氧化应激而受损。本试验采用过氧化氢(H2O2)诱导buffalo大鼠肝细胞(brl)凋亡,建立体外氧化应激的凋亡损伤模型,为深入研究冷应激对肝脏损伤的机理奠定基础。试验采用不同浓度H2O2刺激brl细胞2h,运用WST-1法检测细胞生长活力、Annexin-V/FITC-PI双染技术检测细胞凋亡率及Western blot方法检测Caspase-3的表达量来筛选brl细胞凋亡的H2O2作用浓度。结果显示,与空白对照组相比,150μmol/L H2O2作用后,细胞增殖率明显下降,Caspase-3的蛋白表达量增加,流式细胞仪检测的凋亡率升高,同时细胞坏死较其他H2O2处理组低。结果表明,150μmol/L H2O2作用brl细胞2h可模拟氧化应激造成的凋亡损伤。

关键词：过氧化氢氧化应激凋亡 brl细胞

加味小柴胡汤对顺铂诱导的brl细胞相关凋亡蛋白表达的影响

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中国中医基础医学杂志 2009年第9期15卷 665-667页

作者：刘应柯李合国宫璀璀解放军第153中心医院河南郑州450042 河南中医学院第一附属医院河北郑州450042

目的:探讨加味小柴胡汤对顺铂诱导的大鼠肝brl细胞凋亡蛋白表达的调控作用。方法:将培养的brl细胞分为空白组、顺铂组、实验1组(加味小柴胡汤大剂量)、实验2组(小剂量)4组。采用MTT、TUNEL、DNA琼脂糖凝胶电泳、免疫组化、完整细胞蛋白... 详细信息

目的:探讨加味小柴胡汤对顺铂诱导的大鼠肝brl细胞凋亡蛋白表达的调控作用。方法:将培养的brl细胞分为空白组、顺铂组、实验1组(加味小柴胡汤大剂量)、实验2组(小剂量)4组。采用MTT、TUNEL、DNA琼脂糖凝胶电泳、免疫组化、完整细胞蛋白质斑点印迹等方法,检测各组细胞存活率、凋亡率及细胞相关凋亡蛋白的变化。结果:顺铂组细胞凋亡率比空白组明显升高,Rb、p21、Caspase-3、Bax、wp53蛋白表达上调;存活率显著降低,Bcl-2、mp53表达下调;实验1组、2组凋亡率明显较顺铂组降低,存活率升高,其他各指标皆与顺铂组有明显差异,1组作用更明显。结论:加味小柴胡汤可使顺铂诱导的brl细胞存活率升高,凋亡率降低,对顺铂诱导brl细胞凋亡蛋白的异常表达有调控作用。

关键词：顺铂加味小柴胡汤 brl细胞存活率凋亡率凋亡蛋白

N-acetylserotonin对H_2O_2诱导大鼠肝brl细胞氧化损伤的保护作用

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实用医学杂志 2013年第21期29卷 3486-3488页

作者：史才兴姜政辰李晓琎王海亮李进于树娜王守训蒋吉英潍坊医学院人体解剖学教研室 261053 潍坊医学院临床学院 261053 潍坊医学院研究生处 261053 潍坊医学院生物化学教研室 261053

目的:探讨N-acetylserotonin(NAS)对H2O2诱导正常大鼠肝brl细胞氧化损伤的保护作用。方法:选择正常大鼠肝细胞株brl,采用H2O2诱导法制备brl细胞氧化应激损伤模型,HE染色和台盼蓝染色观察细胞形态及细胞存活率的变化;比色法检测细胞中超... 详细信息

目的:探讨N-acetylserotonin(NAS)对H2O2诱导正常大鼠肝brl细胞氧化损伤的保护作用。方法:选择正常大鼠肝细胞株brl,采用H2O2诱导法制备brl细胞氧化应激损伤模型,HE染色和台盼蓝染色观察细胞形态及细胞存活率的变化;比色法检测细胞中超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量的变化。结果:对照组brl细胞贴壁生长良好,排列紧密,胞膜完整,细胞界限清晰。H2O2诱导后细胞膜皱缩,形态不规则,细胞界限模糊,贴壁能力下降,出现大片细胞缺失;细胞存活率下降;SOD活性降低,而MDA含量升高。NAS可明显改善H2O2引起的细胞形态变化,使细胞存活率升高,增加SOD活性并降低MDA含量。结论:NAS可通过增强抗氧化系统的激活、减轻抗氧化系统受抑制的程度,发挥对H2O2诱导的brl细胞氧化损伤的保护作用。

关键词：氧化性应激 N-acetylserotonin brl细胞 H2O2 细胞凋亡

加味小柴胡汤对顺铂诱导brl细胞核转录因子和热休克蛋白70表达的影响

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中国中医药信息杂志 2009年第6期16卷 31-32页

作者：刘应柯张玉峰宫璀璀刘尚岭中国人民解放军第153中心医院河南郑州450042 河南省中医院河南郑州450000

目的观察加味小柴胡汤对顺铂诱导的大鼠肝brl细胞核转录因子-kB(NF-kB)、热休克蛋白70(HSP70)表达的影响。方法将brl细胞分为4组:空白组、顺铂组及加味小柴胡汤大、小剂量组。采用完整细胞蛋白质斑点印迹、免疫组织化学等方法,检测各组... 详细信息

目的观察加味小柴胡汤对顺铂诱导的大鼠肝brl细胞核转录因子-kB(NF-kB)、热休克蛋白70(HSP70)表达的影响。方法将brl细胞分为4组:空白组、顺铂组及加味小柴胡汤大、小剂量组。采用完整细胞蛋白质斑点印迹、免疫组织化学等方法,检测各组细胞NF-kB、HSP70变化。结果顺铂组NF-kB表达明显较空白组升高,HSP70表达降低,组间比较差异有统计学意义;加味小柴胡汤大、小剂量组NF-kB明显较顺铂组低,差异有统计学意义;加味小柴胡汤大、小剂量组HSP70表达均升高,但仅加味小柴胡汤大剂量组差异明显。结论加味小柴胡汤可下调顺铂诱导的brl细胞NF-kB表达,上调HSP70表达,此作用可能是该方减轻细胞氧化损伤、抑制细胞凋亡重要机理之一。

关键词： brl细胞顺铂加味小柴胡汤细胞核转录因子-kB 热休克蛋白70

缺氧诱导因子-1α在甲基汞致PC12和brl细胞毒性差异中的作用研究

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缺氧诱导因子-1α在甲基汞致PC12和BRL细胞毒性差异中的作用研究

作者：刘婷婷江苏大学

学位级别：硕士

背景与目的:甲基汞(MeHg)是一种普遍存在于环境中的污染物,虽然中枢神经系统是其主要的靶器官,但是对肝脏等非神经器官同样产生毒性损伤。HIF-1α作为低氧调节因子在机体缺血缺氧及化学性损伤应答中发挥着重要的细胞保护或细胞损伤作用... 详细信息

背景与目的:甲基汞(MeHg)是一种普遍存在于环境中的污染物,虽然中枢神经系统是其主要的靶器官,但是对肝脏等非神经器官同样产生毒性损伤。HIF-1α作为低氧调节因子在机体缺血缺氧及化学性损伤应答中发挥着重要的细胞保护或细胞损伤作用。我们以PC12细胞作为神经元样细胞模型,以brl细胞作为非神经细胞模型,探究神经元及非神经元细胞对MeHg毒性敏感性的差异,并进一步探讨HIF-1α及其下游蛋白在MeHg毒性中的作用,分析MeHg调控HIF-1α的可能机制。利用不同的方式分别从基因、蛋白方面调控HIF-1α,观察MeHg神经及肝损害效应的变化。一方面探究MeHg毒性机制与HIF-1α的关系,为MeHg中毒后所致的不同器官的损害提供诊断指标,同时评估上调HIF-1α对拮抗MeHg毒性效应的影响,研发针对不同MeHg毒性损害系统的有效拮抗剂。方法:1.根据前期的预实验,选择不同浓度的MeHg(0、1、2.5、5、10μM)分别处理PC12和brl细胞不同时间(0、0.5、1、3、6 h)后,利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测PC12及brl细胞活力,评估其剂量-时间效应关系;利用乳酸脱氢酶漏出率(LDH)检测不同浓度(0、1、2.5、5、10μM)MeHg作用0.5 h后的细胞毒性作用;利用光学显微镜观察不同浓度MeHg作用后细胞形态学的变化;采用DCFH-DA荧光探针检测两株细胞中活性氧(ROS)随MeHg浓度改变后的改变情况,综合评价MeHg对PC12及brl细胞的毒性作用及其差异。2.蛋白免疫印迹法(WB)用于检测HIF-1α及其下游靶蛋白GLUT-1、VEGF-A、EPO的变化,荧光定量PCR(RT-PCR)用于检测MeHg作用后HIF-1αmRNA水平的变化。探讨HIF-1α在MeHg毒性中的作用。利用药理学(2-MeOE2,10μM,0.5 h)抑制HIF-1α蛋白的表达,WB法检测蛋白变化,MTT法检测细胞活力进一步探讨HIF-1α及其下游蛋白在甲基汞致PC12及brl细胞毒性中的作用。3.腺病毒过表达调控HIF-1α,WB法检测HIF-1α及其下游靶蛋白GLUT-1、VEGF-A、EPO的变化,MTT法检测细胞活力,以探讨HIF-1α在MeHg毒性中的作用,基因水平上调HIF-1α后对MeHg所致两株细胞毒性的影响。4.利用脯氨酸羟化酶抑制剂(DHB,1 mM,6 h)、(CoCl,200μM,0.5 h)及蛋白酶体抑制剂(MG132,1μM,24 h)抑制HIF-1α的降解后,利用WB检测蛋白的变化,MTT检测细胞活力,一方面探讨从蛋白水平上调HIF-1α后对MeHg所致两株细胞毒性的影响,另一方面探讨MeHg调控HIF-1α的可能机制。结果:***结果表明,MeHg以剂量-时间依赖性的方式降低PC12及brl细胞活力,PC12细胞中,MeHg浓度为5μM作用0.5 h后细胞活力下降具有统计学意义;在brl细胞中,MeHg浓度为为10μM作用0.5 h后细胞活力显著下降;MeHg浓度为10μM作用0.5 h后,PC12和brl细胞活力分别下降至68%和76%。LDH结果表明,在PC12细胞中,MeHg浓度为2.5μM时,LDH漏出率显著增高;而在brl细胞中,MeHg浓度为10μM时,LDH漏出率明显升高。不同浓度MeHg作用0.5 h后两株细胞内的ROS的水平亦明显增高,同样浓度的MeHg处理后,在PC12细胞中,荧光强度强于brl细胞中的荧光强度。***结果表明不同浓度MeHg作用0.5 h后,在PC12和PC12细胞中,MeHg浓度为2.5μM和5μM时HIF-1α下降具有统计学意义。MeHg浓度为10μM作用0.5 h,HIF-1α蛋白表达下调至对照组的2%及4%。MeHg作用后对两株细胞的HIF-1β的水平无明显影响。MeHg亦以剂量依赖性方式下调两株细胞中HIF-1α的下游靶蛋白如GLUT-1、VEGF-A、EPO等。qRT-PCR结果表明,MeHg作用后对两株细胞的HIF-1αmRNA的水平亦无明显影响。利用2-MeOE2下调HIF-1α后能够进一步诱导MeHg所致的HIF-1α及其下游蛋白的表达下调并能加重因MeHg所致的细胞活力的下降,进一步论证HIF-1α参与甲基汞诱导的神经毒性和肝脏毒性损害。3.在基因水平上,利用腺病毒上调HIF-1α后,能够显著逆转HIF-1α及其下游蛋白水平,拮抗MeHg所致的两株细胞毒性。4.在蛋白水平上,采用PHD抑制剂DHB、CoCl预处理,可显著逆转HIF-1α及其下游蛋白水平,CoCl预处理可以明显拮抗MeHg所致的brl细胞毒性损害,DHB预处理能够明显拮抗MeHg所致的两株细胞毒性损害,且拮抗MeHg所致的brl细胞毒性更加明显。利用蛋白酶体抑制剂MG13

关键词：缺氧诱导因子-1α 甲基汞 PC12细胞 brl细胞细胞保护

戊二酰辅酶A脱氢酶基因沉默及高浓度赖氨酸对brl肝细胞活性的影响

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中国当代儿科杂志 2017年第9期19卷 1014-1019页

作者：高金枝张偲易琴应艳琴罗小平华中科技大学同济医学院附属同济医院儿科湖北武汉430030

目的探讨戊二酰辅酶A脱氢酶(GCDH)基因沉默和赖氨酸代谢物蓄积对肝细胞活性的影响。方法将brl肝细胞分为正常对照组、阴性对照组和GCDH沉默组。构建含靶向沉默GCDH基因的sh RNA慢病毒载体,分别用该病毒和阴性对照病毒感染GCDH沉默组和... 详细信息

目的探讨戊二酰辅酶A脱氢酶(GCDH)基因沉默和赖氨酸代谢物蓄积对肝细胞活性的影响。方法将brl肝细胞分为正常对照组、阴性对照组和GCDH沉默组。构建含靶向沉默GCDH基因的sh RNA慢病毒载体,分别用该病毒和阴性对照病毒感染GCDH沉默组和阴性对照组brl肝细胞。感染后细胞再用含5 mmol/L赖氨酸培养基培养。免疫荧光技术检测慢病毒感染效率;Western blot法检测GCDH蛋白表达水平;MTT法检测细胞活性,Hoechest 33342染色检测细胞凋亡,Western blot法检测细胞凋亡的经典指标Caspase3水平。结果构建的慢病毒可有效沉默肝细胞GCDH表达(P细胞活性及细胞凋亡比较差异无统计学意义(P>0.05)。Caspase3蛋白表达在各组间比较差异亦无统计学意义(P>0.05)。结论 GCDH基因沉默和赖氨酸代谢物蓄积对肝细胞无明显损伤作用。

关键词：戊二酰辅酶A脱氢酶细胞活性 brl细胞

分泌型rIL-10基因在正常大鼠肝细胞系brl中的稳定表达

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中国免疫学杂志 2009年第2期25卷 118-121页

作者：黄月红陈运新张莉娟郑伟达陈治新王小众福建医科大学附属协和医院消化内科福州350001

目的:建立稳定表达分泌型大鼠白细胞介素10(rIL-10)基因的正常大鼠肝细胞系(brl细胞),为研究IL-10抗纤维化的基因治疗打下基础。方法:通过RT-巢式PCR技术从大鼠外周血单核细胞(PBMC)中扩增出rIL-10全长基因,克隆入pcDNA3真核表达载体构... 详细信息

目的:建立稳定表达分泌型大鼠白细胞介素10(rIL-10)基因的正常大鼠肝细胞系(brl细胞),为研究IL-10抗纤维化的基因治疗打下基础。方法:通过RT-巢式PCR技术从大鼠外周血单核细胞(PBMC)中扩增出rIL-10全长基因,克隆入pcDNA3真核表达载体构建重组表达载体pcDNA3-rIL-10。鉴定正确后,用受体介导的脂质体转染试剂将pcDNA3-rIL-10转染brl细胞,高浓度G418筛选,RT-PCR及ELISA法证实rIL-10在brl细胞中的稳定表达。结果:构建的真核表达载体pcDNA3-rIL-10经质粒双酶切及测序鉴定证实载体构建的正确性。RT-PCR及ELISA法检测出经G418筛选的brl细胞稳定表达IL-10。结论:成功构建分泌型pcDNA3-rIL-10真核表达质粒及筛选出稳定表达分泌型rIL-10的brl细胞株,为进一步研究IL-10抗纤维化的基因治疗打下基础。

关键词：白细胞介素10 基因构建基因表达 brl细胞

胱硫醚β-合酶/胱硫醚γ-裂解酶-硫化氢体系小干扰RNA对大鼠正常肝细胞株brl凋亡的影响

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天津医药 2014年第9期42卷 853-858,I0002,I0003页

作者：闫骏李彦敏郭雪西章明放第一中心医院病理科天津市300100

目的：探讨内源性胱硫醚β-合酶（CBS）/胱硫醚γ-裂解酶（CSE）-硫化氢（H2S）体系在生理状态肝细胞凋亡中的作用及其机制。方法培养大鼠正常肝细胞株brl。小干扰RNA（siRNA）序列筛选：设阴性siRNA序列转染组（对照组）、CBS siRNA序... 详细信息

目的：探讨内源性胱硫醚β-合酶（CBS）/胱硫醚γ-裂解酶（CSE）-硫化氢（H2S）体系在生理状态肝细胞凋亡中的作用及其机制。方法培养大鼠正常肝细胞株brl。小干扰RNA（siRNA）序列筛选：设阴性siRNA序列转染组（对照组）、CBS siRNA序列转染组（CBS 1~3序列组）和CSE siRNA序列转染组（CSE 1~3序列组），转染24、48 h；siRNA转染后检测细胞凋亡：设阴性对照组、溶剂对照组、CBS siRNA组、CSE siRNA组、（CBS＋CSE）siRNA组，作用时间为转染后0、4、8、12、24 h；凋亡机制探讨：设阴性对照组、CBS siRNA组、CSE siRNA组、（CBS＋CSE）siRNA组，作用时间为转染后4、8、12、24 h；每组均4个平行样。RT-PCR、Western blot检测brl细胞中CBS、CSE mRNA和蛋白的表达，siRNA基因静默CBS、CSE，去蛋白法检测H2S生成，Hoechst荧光染色、流式细胞术检测brl细胞凋亡，荧光染色检测线粒体膜电位（MMP）变化，Western blot 检测胞浆内细胞色素 C（Cyt C）和激活型 caspase 3（cleaved-caspase 3）蛋白表达变化。结果 brl细胞株存在CBS、CSE表达。CBS/CSE siRNA转染后，细胞内源性H2S生成降低，凋亡细胞数量和细胞凋亡率随时间延长而逐渐增加，brl细胞上清乳酸脱氢酶（LDH）活性均未见明显变化，MMP下降，胞浆内Cyt C蛋白表达上调，cleaved-caspase3蛋白表达上调。结论抑制内源性H2S体系可引起生理状态肝细胞凋亡，机制可能部分涉及凋亡线粒体途径。

关键词：胱硫醚β合酶胱硫醚γ裂合酶硫化氢 RNA,小分子干扰细胞凋亡 brl细胞