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brd7基因对鼻咽癌细胞作用的初步研究

BRD7基因对鼻咽癌细胞作用的初步研究

作者：彭聪中南大学

学位级别：硕士

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是东南亚地区及我国南方各省常见的一种恶性肿瘤，其发生不仅有明显的地域性和家族集聚现象，而且存在基因组不稳定的特性。细胞和分子遗传学研究发现，鼻咽癌基因组存在高频率3p、9p、11q、13q和... 详细信息

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)是东南亚地区及我国南方各省常见的一种恶性肿瘤，其发生不仅有明显的地域性和家族集聚现象，而且存在基因组不稳定的特性。细胞和分子遗传学研究发现，鼻咽癌基因组存在高频率3p、9p、11q、13q和14q染色体的等位基因的杂合性丢失。我室采用cDNA代表性差异分析的方法克隆了一个新基因brd7，Genbank登录号为AF152604。我室近期研究显示，该基因在鼻咽癌细胞和组织中表达明显下调，在brd7基因的编码区发现了3个cSNP。采用酵母双杂交系统(Two-hybrid system)筛选出与6种brd7蛋白相互作用的蛋白，包括：溴区包含蛋白3(Bromodomain-containing 3 protein，brd3)、溴区包含蛋白2(Bromodomain-containing 2 protein，brd2)、β-IkB激酶(IkB kinase-beta)、KIAA1375蛋白(KIAA1375 protein)、白介素7(interleukin 7，IL-7)和接头相关蛋白复合物3 δ-1亚单位(adaptor-related protein complex 3，delta 1 subunit)。这些都说明brd7可能是一个与鼻咽癌相关的肿瘤抑制候选基因。本研究拟进一步研究brd7的功能，阐述其在鼻咽癌发生发展中的作用。通过生物信息学分析，我们发现brd-7的溴区蛋白与五个结构已知的溴区蛋白具有高度同源性，这些已知的溴区蛋白具有如下特征：含有四个α螺旋(Z，A，B，C)，螺旋与螺旋之间通过环连接(ZA loop，BC loop)，并且含有一个由疏水氨基酸形成的“口袋”，通过这个结构，彭聪硕士学位论文9能特异性识别乙酚化的组蛋白。这表明brd7 可能具有与以上bromodomain蛋白相似的结构。另外，我们采用数字化杂交显示该基因在脑、肺、肝、肾、前列腺、骨骼肌、胎盘等正常组织表达较高。这与我们采用实验室方法得出的结果具有较高的一致性。我们在构建brd7的真核表达载体brd7小CDNA3．1卜）基础上，通过脂质体转染方法，将 brd7基因导入 NPC细胞株 HNE细胞中，并以HN’EI细胞为对照，通过 RTPCR和 Northern Blot方法检测 brd7基因的表达水平，挑选出brd7基因高表达的细胞克隆为研究对象，探讨brd7基因在鼻咽癌发生、发展中的可能作用。为了证实 brd7基因对 HNE恶性表型的影响，我们采用重表达brd7基因的HNEI细胞株，运用细胞生长曲线、软琼脂糖集落形成实验、裸鼠体内接种实验进行生物学行为的研究。结果显示，pCDNA3．l卜＊brd7／HNEI细胞的生长速度明显减慢，倍增时间延长，软琼脂中集落形成率较对照组显著下降b狈．05入裸鼠体内成瘤的时间较对照组明显延长，瘤体的大小较HNE和p cDNA3．1卜）空载体转染组明显减小，将3组肿瘤进行病理切片，均为中、低分化鳞癌，无组间差异，显示brd7基因对裸鼠移植瘤生长具有抑制作用。以上表明，brd7基因重表达有助于HNEI细胞恶性表型的部分逆转。为了研究brd7基因对NPC细胞的作用机制，我们采用流式细胞仪结合细胞周期素的分析方法。结果显示重表达brd7基因后，能更多的将细胞阻滞于G厂G;期，降低细胞周期素eyel inDI、B表达。以上结果说明brd7可能通过下调cyclinDI，B的表达，阻滞细胞于G厂Gl期，从而抑制NPC细胞的过度增殖。综上所述，brd7基因作为一个重要的鼻咽癌抑瘤基因侯选者，在鼻咽癌细胞中的过表达后，可导致鼻咽癌细胞 HNE蛋白质表达谱发生改变，逆转其恶性表型，其作用机理可能是：brd7基因通过其功能域彭聪硕士学位论文10Bromodomain与乙酚化的组蛋白特异性结合，参于染色体的乙酚化，染色质的组装，

关键词：鼻咽癌 HNE1细胞 brd7基因基因转染细胞周期与周期素

过表达E2F6基因抑制brd7基因启动子活性

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中国生物化学与分子生物学报 2006年第11期22卷 886-893页

作者：刘华英罗晓敏李夏雨牛朝霞张荔茗周鸣彭聪向波李征彭淑平李丹李小玲李桂源中南大学肿瘤研究所湖南长沙410078

brd7基因是采用cDNA代表性差异分析法克隆的一个新bromodomain基因(GenBank登录号AF152604).它在鼻咽癌细胞和组织中表达明显下调,过表达brd7基因可抑制鼻咽癌细胞的生长和细胞周期的进程.前期工作已克隆了brd7基因启动子区,并将其启动... 详细信息

brd7基因是采用cDNA代表性差异分析法克隆的一个新bromodomain基因(GenBank登录号AF152604).它在鼻咽癌细胞和组织中表达明显下调,过表达brd7基因可抑制鼻咽癌细胞的生长和细胞周期的进程.前期工作已克隆了brd7基因启动子区,并将其启动子定位于450bp(-404～+46bp)的区域.为了进一步揭示brd7基因在鼻咽癌细胞和组织中表达下调的分子机制,生物信息学分析表明,brd7基因启动子-229至-243bp为一个E2F6转录因子结合位点共有序列,电泳迁移率实验结果表明转录因子E2F6特异性地结合于brd7启动子区.荧光素酶检测和绿色荧光蛋白表达检测都证实,过表达E2F6基因能抑制brd7基因启动子活性.

关键词： brd7基因 E2F6转录因子启动子活性荧光素酶检测技术绿色荧光蛋白

全反式维甲酸诱导白血病细胞分化对brd7基因表达的影响

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中国实验血液学杂志 2010年第3期18卷 593-596页

作者：唐雪元王成红肖广芬中南大学湘雅三医院血液科湖南长沙410013

为了探讨brd7基因与白血病细胞分化的关系及其在白血病细胞分化中的作用,本研究采用全反式维甲酸(ATRA)诱导HL-60和K562细胞系分化,通过Wright-Giema染色在显微镜下观察细胞形态学变化,应用流式细胞术分析细胞分化抗原CD11b的表达,以鉴... 详细信息

为了探讨brd7基因与白血病细胞分化的关系及其在白血病细胞分化中的作用,本研究采用全反式维甲酸(ATRA)诱导HL-60和K562细胞系分化,通过Wright-Giema染色在显微镜下观察细胞形态学变化,应用流式细胞术分析细胞分化抗原CD11b的表达,以鉴定细胞分化程度,并在此基础上通过Western blot检测brd7基因在诱导分化前和细胞分化过程中蛋白表达水平的变化。结果发现,ATRA具有抑制HL-60细胞生长的作用,并可诱导HL-60细胞向粒系分化,在ATRA诱导细胞分化过程中HL-60细胞表面CD11b的表达水平逐渐上调,brd7蛋白表达随着HL-60细胞的分化而增加;ATRA对K562细胞无诱导分化作用,brd7的表达也无明显变化。结论:随着HL-60细胞的分化,brd7基因表达上调,其机制有待进一步阐明。

关键词：全反式维甲酸白血病 brd7基因细胞分化

鼻咽癌相关基因brd7对鼻咽癌细胞CNE1的影响

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生物化学与生物物理进展 2005年第9期32卷 842-849页

作者：彭聪李小玲周鸣刘华英王莉莉张秋红杨一新吴尚辉黄柏英熊炜李桂源中南大学湘雅医学院肿瘤研究所长沙410078 中南大学现代分析测试中心细胞生物研究室长沙410078

为了研究brd7基因对鼻咽癌细胞CNE1的影响,通过脂质体转染方法,将brd7基因导入NPC细胞株CNE1细胞中.通过细胞生长曲线发现该基因能够抑制CNE1细胞的生长.为了探讨可能的作用机制,进而采用蛋白质组技术研究该基因对鼻咽癌蛋白质表达谱的... 详细信息

为了研究brd7基因对鼻咽癌细胞CNE1的影响,通过脂质体转染方法,将brd7基因导入NPC细胞株CNE1细胞中.通过细胞生长曲线发现该基因能够抑制CNE1细胞的生长.为了探讨可能的作用机制,进而采用蛋白质组技术研究该基因对鼻咽癌蛋白质表达谱的影响,从而研究该基因在CNE1中的地位和作用.通过对过表达brd7基因后鼻咽癌细胞系CNE1的蛋白质表达谱改变的研究,鉴定出19个差异表达蛋白,这些蛋白质包括:BCCIP(BRCA2andCDKN1A(p21(Waf1/Cip1)),FHL2(fourandahalfLIMdomains2),Chloridechannelregulatoryprotein;Hin-1(high-in-normal-1),WISP-1(connectivetissuegrowthfactorrelatedprotein),SREC-4(scav-engerreceptorexpressedbyendothelialcells-2),folatereceptor.这些差异蛋白涉及到基因表达调控、细胞黏附等众多的事件.从另一个侧面研究了brd7基因与鼻咽癌的关系,扩展了brd7基因的研究范围,并进一步充实了该基因做为鼻咽癌候选抑瘤基因的证据.

关键词： brd7基因 CNE1细胞生长曲线双向电泳 MAJDL-TOF-MS

侯选抑瘤基因brd7及家族蛋白的功能研究进展

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生物化学与生物物理进展 2005年第9期32卷 811-816页

作者：刘华英李桂源中南大学肿瘤研究所长沙410078

溴区结构(bromodomain)是近年来发现的广泛分布于多种生物中的一种高度保守的结构域,溴区结构蛋白通过参与信号依赖性的基因转录调控而广泛参与细胞内重要的生命活动.brd7基因是1999年克隆的一个新的bromodomain基因,GenBank登录号为AF1... 详细信息

溴区结构(bromodomain)是近年来发现的广泛分布于多种生物中的一种高度保守的结构域,溴区结构蛋白通过参与信号依赖性的基因转录调控而广泛参与细胞内重要的生命活动.brd7基因是1999年克隆的一个新的bromodomain基因,GenBank登录号为AF152604或***分析表明,brd7蛋白包含多个磷酸化位点和一个保守bromodomain功能域,Blast显示brd7蛋白与人的Celtix-1及鼠的bromodomain蛋白BP75具有高度的同源性.利用转基因技术已证实,在鼻咽癌细胞系HNE1中过表达brd7基因可以抑制其细胞生长和细胞周期G1-S的进程,并部分逆转鼻咽癌细胞HNE1的恶性表型.为了全面地揭示brd7基因的细胞内生物学功能,深入了解brd7基因的细胞内整体信息流向,中南大学肿瘤研究所细胞遗传室已从上、中、下游三个不同层面对brd7基因的功能研究展开了初步的探索.

关键词： brd7基因溴区结构功能域 brd7基凼功能

运用蛋白质组学技术研究鼻咽癌候选抑瘤基因brd7

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生物化学与生物物理学报 2003年第9期35卷 816-822页

作者：彭聪梁宋平谭琛吕红斌黄河周鸣王蓉李小玲李桂源中南大学湘雅医学院湖南师范大学生命科学学院中南大学湘雅医学院肿瘤研究所长沙410078

brd7基因是采用cDNA代表性差异分析法克隆得到的一个新基因 (GenBank登录号AF15 2 6 0 4 )。初步研究显示 ,它在鼻咽癌细胞和组织中表达明显下调 ,并且能部分逆转其恶性表型。在brd7基因的编码区发现了 3个cSNP ,并且采用酵母双杂交系... 详细信息

brd7基因是采用cDNA代表性差异分析法克隆得到的一个新基因 (GenBank登录号AF15 2 6 0 4 )。初步研究显示 ,它在鼻咽癌细胞和组织中表达明显下调 ,并且能部分逆转其恶性表型。在brd7基因的编码区发现了 3个cSNP ,并且采用酵母双杂交系统筛选出 6种与brd7蛋白相互作用的蛋白质。为进一步研究其可能的作用机制 ,通过脂质体转染方法 ,将brd7基因导入NPC细胞株HNE1细胞中 ,采用蛋白质组技术研究该基因对鼻咽癌蛋白质表达谱的影响 ,从而考察该基因在肿瘤发生发展中的地位和作用。通过对过表达brd7基因后鼻咽癌细胞系HNE1的蛋白质表达谱改变的研究 ,鉴定出 2 0个差异表达蛋白质 ,这些蛋白质包括精氨酸代琥珀酸裂解酶 (argini nosuccinateLyase)、金属蛋白酶抑制因子 2前体 (Metalloproteinaseinhibitor 2precursor)、蛋白酶体激活因子 2 8β亚单位(Proteaseomeactivator2 8βsubunit)、甲状腺转录因子 1(thyroidtranscriptionalfactor 1)、细胞周期蛋白H(cyclinH ,MO15 associatedprotein)等。这些差异蛋白质涉及基因表达调控、细胞周期的调控分子、细胞免疫、细胞代谢等众多事件。

关键词：鼻咽癌 brd7基因基因转染双向电泳 MAIDL-TOF-MS

新基因brd7对鼻咽癌蛋白质表达谱影响的初步研究

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生物化学与生物物理进展 2003年第5期30卷 721-725页

作者：彭聪谭琛张秋红王晓艳周鸣黄河王蓉李小玲中南大学湘雅医学院肿瘤研究所长沙410078

brd7基因是与鼻咽癌相关的候选抑瘤基因 .为了进一步研究该基因的作用机制 ,将pcDNA3 1(+) /brd7的表达质粒经脂质体导入HNE1细胞 ,RNA斑点杂交筛选出阳性克隆 ,通过双向电泳分离过表达brd7的HNE1细胞内蛋白质 ,筛选出差异表达的蛋白质... 详细信息

brd7基因是与鼻咽癌相关的候选抑瘤基因 .为了进一步研究该基因的作用机制 ,将pcDNA3 1(+) /brd7的表达质粒经脂质体导入HNE1细胞 ,RNA斑点杂交筛选出阳性克隆 ,通过双向电泳分离过表达brd7的HNE1细胞内蛋白质 ,筛选出差异表达的蛋白质点 ,并进行质谱分析鉴定 .鉴定出 10种表达上调的蛋白质点 ,包括精氨 (基 )琥珀酸裂解酶 ,TSA (thio specificantioxdant) ,Proteaseomeactivator2 8betasubunit (PA2 8) ,金属蛋白酶抑制因子 2前体等 ,这些蛋白质涉及细胞生长 ,细胞代谢等很多相关事件 .

关键词：鼻咽癌蛋白质表达谱 brd7基因抑瘤基因

brd7调控Rb/E2F通路的分子机制研究

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生物化学与生物物理进展 2007年第8期34卷 881-888页

作者：李淑芳周鸣刘华英徐晓杰彭聪彭淑平武明花李小玲李桂源中南大学肿瘤研究所

brd7是采用cDNA代表性差异分析法克隆的一个新的Bromodomain基因,过表达brd7可抑制鼻咽癌细胞的生长和细胞周期进程,同时发现brd7基因可以调控Rb/E2F通路的活性.该研究旨在进一步探讨brd7调控Rb/E2F通路的分子机制.通过蛋白质印迹和RT-... 详细信息

brd7是采用cDNA代表性差异分析法克隆的一个新的Bromodomain基因,过表达brd7可抑制鼻咽癌细胞的生长和细胞周期进程,同时发现brd7基因可以调控Rb/E2F通路的活性.该研究旨在进一步探讨brd7调控Rb/E2F通路的分子机制.通过蛋白质印迹和RT-PCR实验方法发现,brd7能够降低Rb的磷酸化水平,抑制cyclinD1、cyclinE的蛋白质表达,上调CDK4抑制子P19的mRNA表达,但对CDK4和CDK2的蛋白质表达没有明显影响;通过荧光素酶实验从转录调控水平进一步证实了brd7能够明显抑制cyclinD1启动子活性;采用反义核酸技术抑制COS7细胞内源性brd7的表达后,发现cyclinD1、cyclinE、磷酸化Rb的蛋白质表达水平上调,并且可以促进细胞生长.这些结果表明:brd7参与调控Rb/E2F信号通路中重要靶分子的表达,抑制Rb/E2F通路的活性,从而阻止细胞周期G1-S期进程,抑制鼻咽癌细胞生长.

关键词： brd7基因 Rb/E2F信号通路细胞周期调控 cyclinD1 反义核酸技术

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brd7单核苷酸多态性及鼻咽癌易感性分析

生物化学与生物物理进展 2001年第4期28卷 568-572页

作者：余鹰朱诗国向娟娟李忠花张必成曹利李桂源中南大学湘雅医学院肿瘤研究所长沙410078

为了探讨brd7基因的遗传变异在鼻咽癌发生的作用 ,采用PCR SSCP和直接测序方法对brd7基因的编码区进行单核苷酸多态性 (coding regionsinglenucleotidepolymorphism ,cSNP)分析 ,并对两个鼻咽癌家系的高危成员、 5 7个散发性鼻咽癌病人... 详细信息

为了探讨brd7基因的遗传变异在鼻咽癌发生的作用 ,采用PCR SSCP和直接测序方法对brd7基因的编码区进行单核苷酸多态性 (coding regionsinglenucleotidepolymorphism ,cSNP)分析 ,并对两个鼻咽癌家系的高危成员、 5 7个散发性鼻咽癌病人和 5 0个正常人进行了brd7等位基因分型 .在brd7基因的编码区发现了 3个cSNP (C45 0T、A5 38C和A737G) ,其中A5 38C颠换导致其编码蛋白的第 16 2个氨基酸由Asp变为Ala ;C45 0T改变与同义的A737C多态性偶联发生在 87 7%的鼻咽癌活检组织和配对的外周血、所有的鼻咽癌家系的患者及8个易感成员 ,但是仅存在于 2 2 %的正常人血标本中 .C45 0T多态性变化可以导致其编码蛋白在第 133位氨基酸的翻译终止 (G133Ter) .以上结果说明 ,C45 0T和A737C偶联的多态性改变是鼻咽癌发生和发展的重要遗传易感风险因子之一 (P brd7基因有两种翻译方式 ,G133Ter可以导致另一种截断的翻译本 (truncatedisoform) .

关键词：鼻咽肿瘤 brd7基因易感基因单核苷酸多态性