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敲除brcc3加重异基因造血干细胞移植受体小鼠急性移植物抗宿主病

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中华放射医学与防护杂志 2022年第6期42卷 401-407页

作者：李欣赵珂孙慧颖任广明高慧英李长燕宁红梅安徽医科大学解放军总医院第五医学临床学院血液科合肥230032 中国人民解放军军事科学院军事医学研究院生命组学研究所北京100850

目的:研究brcc3的缺失对急性移植物抗宿主病(aGVHD)的影响,并初步探讨其机制。方法:12只C57BL/6J小鼠作为受体,分为野生型(WT组)和brcc3 -/-型(KO组),每组6只。采用两次4.5 Gy ^(60)Co全身照射(TBI),两次照射间隔30 min,6 h后通过尾静... 详细信息

目的:研究brcc3的缺失对急性移植物抗宿主病(aGVHD)的影响,并初步探讨其机制。方法:12只C57BL/6J小鼠作为受体,分为野生型(WT组)和brcc3 -/-型(KO组),每组6只。采用两次4.5 Gy ^(60)Co全身照射(TBI),两次照射间隔30 min,6 h后通过尾静脉输注BABL/c小鼠1×10^(7)骨髓细胞和8×10^(6)脾脏细胞建立aGVHD小鼠模型。在aGVHD小鼠模型中特异性敲除brcc3,通过组织病理学检测靶器官损伤;酶联免疫吸附试验(ELISA)和细胞因子微球检测技术(CBA)检测小鼠血清中细胞因子的水平;移植后第9天分离脾脏、肝脏和小肠淋巴细胞,运用流式细胞术检测靶器官中T细胞的浸润和活化。结果:受体小鼠brcc3的缺失可导致aGVHD小鼠生存期明显缩短( P3、5.52, P3.74、3.19, P3.52、4.06、3.29, Pbrcc3在受体中的缺失可促进供体CD8+ T细胞的增殖与活化而加重aGVHD,为aGVHD探索了潜在的预防和治疗靶点。

关键词： brcc3 急性移植物抗宿主病 T细胞活化治疗靶点

brcc3调控ALK2泛素化对肺动脉高压的保护机制研究

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BRCC3调控ALK2泛素化对肺动脉高压的保护机制研究

作者：高雅扬州大学

学位级别：硕士

目的:探讨去泛素化酶brcc3对肺动脉高压的保护效应及其作用机制。方法:1)通过GEO数据库挖掘特发性肺动脉高压疾病患者和肺动脉高压动物模型转录组数据进行聚类分析筛选出差异基因;将雄性C57BL/6J小鼠随机分为低氧组和对照组,低氧组给予S... 详细信息

目的:探讨去泛素化酶brcc3对肺动脉高压的保护效应及其作用机制。方法:1)通过GEO数据库挖掘特发性肺动脉高压疾病患者和肺动脉高压动物模型转录组数据进行聚类分析筛选出差异基因;将雄性C57BL/6J小鼠随机分为低氧组和对照组,低氧组给予Sugen5416(20mg/kg)皮下注射,一周一次,合并低氧(10%O2)处理五周,Western blot检测各组肺组织以及肺组织分离出的肺动脉平滑肌细胞PASMCs中brcc3的表达;将Wista大鼠随机分为MCT组和对照组,MCT组给予野百合碱MCT(60mg/kg)处理,四周后Western blot检测各组肺组织以及肺组织分离出的肺动脉平滑肌细胞PASMCs中brcc3的表达,以明确brcc3在肺动脉高压中的表达。2)使用平滑肌特异性启动子SM22 α产生VSMC特异性brcc3的转基因小鼠(SMA22 α-brcc3 Tg),对Tg小鼠给予低氧(10%O2)合并Sugen5416(20mg/kg)皮下注射,一周一次,处理五周。将雄性C57BL/6J小鼠随机分为低氧对照组和常氧对照组,低氧对照组给予Sugen5416(20mg/kg)皮下注射,一周一次,合并低氧舱(10%O2)处理五周。肺动脉导管测量三组小鼠右心室收缩压(RVSP);肺动脉造影观察三组小鼠肺血管稀疏情况;富尔顿指数衡量三组小鼠右心肥厚情况,以明确brcc3对肺动脉压的保护作用。3)用空载腺病毒Ad-Null和brcc3过表达腺病毒Ad-brcc3转染大鼠原代肺动脉平滑肌细胞PASMCs,进行转录组学分析,以检测brcc3在PASMCs上调节的基因。提取大鼠原代肺动脉平滑肌细胞PASMCs,对其进行6、24、48、72h的低氧处理(1%O2,5%CO2),通过Western Blot检测低氧对PASMCs的BMP信号通路的关键因子ALK2、T-Smad1/5、P-Smad1/5、PPARγ、p53、id1的影响;再对低氧处理的PASMCs给予过表达brcc3的处理,Western Blot检测BMP信号通路的关键因子ALK2、PPAR γ、p53、id1的含量,免疫荧光检测Smad1/5的入核;对上述三组小鼠肺组织进行 Western blot 分析 ALK2、T-Smad1/5、P-Smad1/5、PPARγ、p53、id1 的含量,以明确brcc3对BMP信号通路的影响。4)用空载腺病毒Ad-Null和brcc3过表达腺病毒Ad-brcc3转染大鼠原代肺动脉平滑肌细胞PASMCs,用Phos-tag技术检测p-ALK2、p-BMPR2水平;对Ad-brcc3转染的细胞给予消减ALK2或降低其酶活性的处理,Western blot检测ALK2、p-ALK2及其下游信号p-Smad1/5的表达,免疫荧光检测Smad1/5的入核;对低氧处理的PASMCs给与brcc3过表达处理,对其和上述三组小鼠的肺组织进行免疫共沉淀实验,以明确brcc3通过是影响ALK2酶活性从而影响BMP信号通路。5)通过蛋白结构及过往的研究预测出ALK2的472和475位点的赖氨酸可能是ALK2的泛素结合位点,将472、475位点的赖氨酸K突变为精氨酸R。将未突变的野生型WT、472位点突变的K427R、475位点突变的K475R、双位点突变的质粒与泛素Ub过表达质粒转染到239A细胞中,Co-IP实验检测ALK2的K63-Ub的变化,Western blot检测ALK2、p-ALK2及其下游信号p-Smad1/5的表达,以明确突变引起的ALK2 K63-Ub减少对BMP通路的影响。通过对PASMC细胞转染未突变的野生型WT、K427R、K475R、双位点突变的质粒,并另设一组WT为常氧对照组,其余四组低氧处理48h,进行CCK8及细胞迁移实验,以明确K63位点的去泛素化对细胞的增殖迁移的影响,去泛素化酶brcc3对ALK2的去泛素化与突变质粒效应一致,用此演绎去泛素化酶brcc3对ALK2去泛素化调控细胞增殖迁移。6)使用血管平滑肌特异工具鼠Tagln-Cre鼠与brcc3/Flox纯合小鼠杂交得到平滑肌特异敲除KO鼠。将雄性C57BL/6J小鼠设为常氧对照组;将雄性KO鼠随机分为两组:常氧KO组,常氧KO+PIO(吡格列酮)组,PIO组给予PIO(10mg/kg每天灌胃处理,持续四周)。肺动脉导管测量三组小鼠右心室收缩压(RVSP);肺动脉造影观察三组小鼠肺血管稀疏情况;富尔顿指数指数衡量三组小鼠右心肥厚情况;HE染色观察三组小鼠肺动脉血管管壁厚度;对上述小鼠肺组织进行 Western blot 分析 ALK2、T-Smad1/5、P-Smad1/5、PPARγ 的含量,验证 PIO 可以通过激活BMP通路保护因brcc3减少导致的PAH,以验证brcc3在PAH的重要性。结果:1)GSE48149数据库数据分析IPAH患者肺组织中

关键词：去泛素化酶 BMP信号通路 brcc3 肺动脉高压

brcc3基因敲除小鼠的构建和表型初步分析

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军事医学 2018年第1期42卷 44-48页

作者：肖阳任广明詹轶群于淼李长燕杨晓明尹荣华军事科学院军事医学研究院北京100850

目的构建brcc3（BRCAl／BRCA2一containing complex subunit3）基因敲除小鼠，并对其表型进行初步研究。方法利用Cas9／sgRNA基因编辑技术构建brcc3基因敲除小鼠；提取鼠尾基因组DNA，在DNA水平对小鼠基因型进行鉴定；提取小鼠心、肝、... 详细信息

目的构建brcc3（BRCAl／BRCA2一containing complex subunit3）基因敲除小鼠，并对其表型进行初步研究。方法利用Cas9／sgRNA基因编辑技术构建brcc3基因敲除小鼠；提取鼠尾基因组DNA，在DNA水平对小鼠基因型进行鉴定；提取小鼠心、肝、脾、肺、肾的RNA和蛋白质，利用Real．timePCR和Western印迹（WB）技术检测brcc3基因的表达。观测敲除小鼠体质量变化趋势及可能影响生长发育和代谢的指标；对小鼠的主要脏器进行苏木精一伊红（HE）染色；小鼠外周血血常规检测。结果成功构建了brcc3基因敲除小鼠。brcc3敲除小鼠可正常生长繁殖，血脂和肝功能等代谢指标基本正常，各组织器官无明显病变，外周血血常规各指标均正常。brcc3敲除小鼠体质量增加，血清胆固醇含量增高。结论brcc3可能参与小鼠体质量调节及胆固醇代谢。

关键词： brcc3 小鼠基因敲除表型分析基因型基因表达泛素化

CDK5介导brcc3调控帕金森病中炎症小体活化的机制研究

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CDK5介导BRCC3调控帕金森病中炎症小体活化的机制研究

作者：程芯育桂林医学院

学位级别：硕士

目的:(1)在帕金森病(Parkinson’s disease,PD)动物模型及细胞模型中探讨brcc3的表达情况;(2)在PD细胞模型中探讨brcc3对NLRP3炎症小体复合物及IL-1β表达的影响;(3)在PD细胞模型和HEK293细胞中,探讨CDK5与brcc3之间的关系;(4)在PD模型... 详细信息

目的:(1)在帕金森病(Parkinson’s disease,PD)动物模型及细胞模型中探讨brcc3的表达情况;(2)在PD细胞模型中探讨brcc3对NLRP3炎症小体复合物及IL-1β表达的影响;(3)在PD细胞模型和HEK293细胞中,探讨CDK5与brcc3之间的关系;(4)在PD模型中探讨CDK5介导brcc3对NLRP3炎症小体表达的影响。方法:(1)将C57BL/6J小鼠随机分为对照组和实验组,实验组按照25mg/kg*7天的剂量腹腔注射1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)进行PD造模,对照组注射同等剂量的生理盐水,应用Western blot检测脑组织内酪氨酸羟化酶(TH)蛋白的表达,确定PD动物模型的建立;在大鼠神经元细胞中使用经典的1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP)诱导剂构建PD细胞模型,应用RT-PCR检测PD动物模型和细胞模型中brcc3的m RNA表达水平;应用Western blot检测PD动物模型和细胞模型中brcc3蛋白的表达;在PD细胞模型中,应用细胞免疫荧光检测brcc3在细胞内的定位及蛋白表达情况。(2)在PD细胞模型中,分别应用去泛素化酶抑制剂(G5)或慢病毒sh RNA-brcc3降低brcc3的蛋白表达,应用Western blot分别检测NLRP3炎症小体复合物及IL-1β蛋白表达情况;在慢病毒sh RNA-brcc3干预的PD细胞模型中,应用细胞免疫荧光检测NLPR3在细胞内的蛋白表达情况。(3)在PD细胞模型中,给予CDK5抑制剂Roscovitine处理,Western blot检测brcc3蛋白表达水平的变化;在HEK293细胞中利用脂质体转染brcc3-His质粒、CDK5-HA质粒,免疫共沉淀检测CDK5与brcc3蛋白两者的相互作用。(4)在PD细胞模型中应用CDK5抑制剂Roscovitine抑制CDK5的表达,Western blot检测NLRP3、pro-caspase-1、ASC、IL-1β的表达;在HEK293细胞中通过脂质体共转染brcc3和CDK5/P35质粒,并使用LPS+ATP处理,构建细胞炎症模型,Western blot检测NLRP3、pro-caspase-1、ASC的蛋白表达情况;在PD细胞模型中使用brcc3抑制剂(G5)和sh RNA-brcc3慢病毒感染神经元,降低brcc3表达,应用ELISA试剂盒检测神经元中炎性因子IL-1β的分泌情况。结果:(1)成功构建PD动物模型:腹腔注射MPTP的PD动物模型具有明显的行为学损伤,如平衡杆和爬杆通过时长均较正常对照组延长,Western blot结果显示PD动物模型组TH表达降低;RT-PCR结果提示MPTP诱导的PD动物模型和MPP诱导的PD细胞模型中brcc3的m RNA水平均没有显著变化,但在MPP构建的PD细胞模型中发现,MPP作用不同时间(0h,0.5h,1h,4h,8h),brcc3的m RNA的表达水平随着MPP处理时间的延长而逐渐增强,作用1h达到高峰,随后又逐渐下降;Western Blot检测结果显示,MPTP诱导的PD动物模型中brcc3表达明显增加,在PD细胞模型中,MPP作用不同时间(0h,2h,4h,8h,16h,32h),brcc3蛋白在神经元中的表达水平随着时间延长而明显增加,在8h时brcc3蛋白表达最显著;免疫荧光结果表明,brcc3主要定位于神经元胞浆中,经过MPP诱导后brcc3表达增强。(2)在PD细胞模型中分别使用去泛素化酶抑制剂(G5)处理和慢病毒sh RNA-brcc3感染神经元细胞,抑制brcc3蛋白的表达,Western blot结果显示,NLRP3、pro-caspase-1、ASC、IL-1β蛋白表达水平降低;免疫荧光结果显示,NLRP3主要定位于神经元的细胞浆中,且在抑制brcc3蛋白表达时NLRP3表达随之降低。(3)在PD细胞模型中,给予Roscovitine抑制CDK5表达时,brcc3表达也随之减少;在HEK293细胞中共转染brcc3-His和CDK5-HA质粒,免疫共沉淀检测二者的相互作用情况。结果显示,CDK5和brcc3之间存在相互作用。(4)在PD细胞模型中,应用CDK5抑制剂Roscovitine可使神经元中NLRP3、pro-caspase-1、ASC、IL-1β表达降低;在HEK293细胞中共转染brcc3-His、CDK5-HA/P35-Myc质粒并构建细胞炎症模型,结果发现过表达brcc3可增加NLRP3炎症小体复合物的表达,当CDK5抑制剂Roscovitine抑制CDK5表达后,NLRP3炎症小体复合物的表达随之下降;此外,在PD细胞模型中,ELISA检测MPP处理组中炎性因子IL-1β显著增加,当应用brcc3抑制剂(G5)或者慢病毒sh RNA-brcc3作用于MPP处

关键词：帕金森病 brcc3 CDK5 炎症小体

DAPK1介导brcc3调节NLRP3炎性小体在帕金森病中的机制研究

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DAPK1介导BRCC3调节NLRP3炎性小体在帕金森病中的机制研究

作者：张聪慧桂林医学院

学位级别：硕士

目的:(1)在帕金森病(PD)细胞模型中探讨死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)及去泛素化酶(brcc3)蛋白的表达水平;(2)在HEK293细胞和原代神经元中探讨DAPK1和brcc3的关系;(3)在PD细胞模型中探讨DAPK1对NLRP3炎性小体复合物表达水平的影响;(4)在PD... 详细信息

目的:(1)在帕金森病(PD)细胞模型中探讨死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)及去泛素化酶(brcc3)蛋白的表达水平;(2)在HEK293细胞和原代神经元中探讨DAPK1和brcc3的关系;(3)在PD细胞模型中探讨DAPK1对NLRP3炎性小体复合物表达水平的影响;(4)在PD细胞模型中,探讨DAPK1通过brcc3调节NLRP3的表达。方法:(1)在原代培养的神经元细胞中,1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP)(100m M)诱导构建PD细胞模型,应用Western blot检测TH(酪氨酸羟化酶)蛋白表达水平;(2)在PD细胞模型中,应用Western blot和细胞免疫荧光检测DAPK1和brcc3蛋白表达情况;(3)在HEK293细胞中,脂质体共转染DAPK1-Flag和brcc3-His质粒,应用免疫共沉淀(CO-IP)检测DAPK1与brcc3之间的相互作用情况;在原代培养的神经元细胞中,应用细胞免疫荧光观察DAPK1和brcc3的共定位情况;在HEK293细胞中,转染DAPK1不同结构域质粒(DAPK1–Flag,DAPK1-K42A–Flag,DAPK1-△KD–Flag,DAPK1-△DD–Flag,DAPK1-△Ca M–Flag),应用Western blot检测DAPK1不同结构域与brcc3的相互作用情况;(4)在PD细胞模型中,给予DAPK inhibitor(100m M),应用Western blot和细胞免疫荧光检测NLRP3炎性小体复合物表达情况;(5)在PD细胞模型中,给予DAPK inhibitor(100m M),应用Western blot和细胞免疫荧光检测brcc3蛋白表达情况;sh brcc3慢病毒感染SH-SY5Y细胞,转染DAPK1-Flag质粒,Western blot检测NLRP3蛋白表达水平。结果:(1)Western blot结果显示MPP组TH蛋白水平较对照组明显降低,说明PD细胞模型构建成功;(2)在原代培养的神经元中,DAPK1蛋白在MPP作用时8h表达最强,随后逐渐减弱;PD细胞模型中,Western blot和细胞免疫荧光结果显示DAPK1和brcc3表达升高;(3)在HEK293细胞中,共转染DAPK1-Flag和brcc3-His质粒,CO-IP结果显示DAPK1与brcc3存在相互作用;在原代培养的神经元中,细胞免疫荧光结果显示DAPK1(绿色)和brcc3(红色)在胞浆中存在共定位;在HEK293细胞中,转染DAPK1不同结构域质粒,结果显示DAPK1的Ca M结构域可能是与brcc3相互作用的结构域;(4)在MPP诱导的PD细胞模型中,Western blot结果显示NLRP3、pro-Caspase-1、ASC和IL-1β蛋白表达较对照组高,加入DAPK inhibitor后,NLRP3、pro-Caspase-1、ASC和IL-1β的蛋白表达则降低;细胞免疫荧光结果与Western blot结果一致。表明在PD细胞模型中DAPK1正向调节NLRP3炎性小体复合物的表达;(5)在PD细胞模型中,在应用DAPK inhibitor后,抑制剂组brcc3表达较MPP组降低;细胞免疫荧光brcc3蛋白表达情况与Western blot结果一致。表明在PD模型中DAPK1正向调控brcc3的表达。sh brcc3慢病毒感染SH-SY5Y细胞,Western blot结果发现NLRP3表达显著降低;sh brcc3慢病毒感染SH-SY5Y细胞系,转染DAPK1-Flag质粒48h后,检测NLRP3炎性小体的表达水平。Western blot结果显示brcc3被抑制,过表达DAPK1,NLRP3的表达反而升高,说明DAPK1是可以通过brcc3调控NLRP3表达。结论:死亡相关蛋白激酶DAPK1与去泛素化酶brcc3二者存在相关性,且DAPK1通过brcc3正向调节PD细胞模型中NLRP3的表达。

关键词： DAPK1 brcc3 NLRP3 帕金森病

携带小鼠brcc3基因重组腺病毒的包装及鉴定

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携带小鼠Brcc3基因重组腺病毒的包装及鉴定

作者：郑海霞扬州大学

学位级别：硕士

目的：构建能够在体外真核细胞中过表达目标基因brcc3的重组腺病毒真核表达载体,并进而使用HEK293细胞包装重组腺病毒,从而为后续转染小鼠心脏成纤维细胞（cardiofibroblasts, cFs）探讨细胞内brcc3基因过表达对TGF-β信号通路各环... 详细信息

目的：构建能够在体外真核细胞中过表达目标基因brcc3的重组腺病毒真核表达载体,并进而使用HEK293细胞包装重组腺病毒,从而为后续转染小鼠心脏成纤维细胞（cardiofibroblasts, cFs）探讨细胞内brcc3基因过表达对TGF-β信号通路各环节的影响做准备。方法： 1、目的基因片段的扩增（扩增包括双酶切位点的目标基因序列）分别以Ndel-Sacl-brcc3-F和brcc3-R为上下游引物扩增Sacl-brcc3;以brcc3-GST-F和Xhol-Spel-GST-R扩增GST-Xhol及以Ndel-Sacl-brcc3-F和Xhol-Spel-GST-R扩增Sacl-brcc3-GST-Xhol。 2、利用酶切连接构建pDown-brcc3/GST/IRES/EGFP并测序鉴定 Sacl/Xhol双酶切骨架载体pDown-MCS-IRES/EGFP和PCR回收产物Sacl-brcc3-GST-Xhol,并将骨架片段pDown-MCS-IRES/EGFP和目的基因brcc3-GST连接,接着转化连接产物到感受态细胞大肠杆菌stbl3,进行菌落PCR鉴定后挑取单克隆摇菌提取质粒pDown-brcc3/GST/IRES/EGFP送测序。 3、利用Gateway Technology构建pAV.Ex1d-CMV＞brcc3/GST/IRES/EGFP pDown-brcc3/GST/IRES/EGFP和pAV.Des1d进行LR反应,将目标基因克隆到腺病毒载体pAV.Des1d,于（反应产物转化到）大肠杆菌感受态细胞stbl3中进行（复制）,PCR鉴定阳性克隆,挑单克隆摇菌提取质粒送检测序。 4、将重组腺病毒转染293A细胞,进行病毒的包装和扩增,并提取转染的CFs细胞蛋白行Western blot检测brcc36蛋白表达水平。主要结果： 1、经琼脂糖电泳鉴定表明目的片段Sacl-brcc3-GST-Xhol扩增成功。 2、经PCR检测、琼脂糖电泳及基因测序表明载体pDown-brcc3/GST/IRES/EGFP构建成功。 3、经PCR检测、琼脂糖电泳、基因测序及western blot分析表明重组腺病毒真核表达载体pAV.Exld-CMV＞brcc3/GST/IRES/EGFP构建成功。主要结论：本研究利用Gateway技术成功构建重组腺病毒真核表达载体pAV.Exld-CMV＞brcc3/GST/IRES/EGFP,并成功包装获得过表达brcc3基因的腺病毒。

关键词：重组腺病毒载体 Gateway技术限制性酶切和连接 brcc3

靶向NLRP3炎症小体作为防治急性移植物抗宿主病策略的应用基础研究

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靶向NLRP3炎症小体作为防治急性移植物抗宿主病策略的应用基础研究

作者：李欣安徽医科大学

学位级别：硕士

研究目的:建立稳定的急性移植物抗宿主病(aGVHD)小鼠模型,以NLRP3炎症小体的靶向抑制剂硫藤黄菌素(THL)作为先导化合物研究其对aGVHD的防治作用并探究其作用机制。实验方法:1.使用8-10周龄雄性BABL/c小鼠作为受体,C57BL/6J雄性小鼠作为... 详细信息

研究目的:建立稳定的急性移植物抗宿主病(aGVHD)小鼠模型,以NLRP3炎症小体的靶向抑制剂硫藤黄菌素(THL)作为先导化合物研究其对aGVHD的防治作用并探究其作用机制。实验方法:1.使用8-10周龄雄性BABL/c小鼠作为受体,C57BL/6J雄性小鼠作为供体,移植当天受体小鼠采用6.5 Gy 60Co全身照射(TBI),6h后尾静脉输注供体小鼠来源的骨髓细胞1 × 107作为对照组,输注骨髓细胞1 × 107及脾细胞5 × 106作为aGVHD组,于移植后不同时间点观察记录各组小鼠的生存、体重变化、临床评分;移植后第11天,取对照组和aGVHD模型组小鼠肝脏及小肠进行常规组织病理学检查;移植后第11天,取aGVHD模型组小鼠外周血,分离脾脏淋巴细胞、肝脏淋巴细胞、小肠淋巴细胞,标记anti-mouse H-2Kb及anti-mouse H-2Kd,运用流式细胞学技术对aGVHD模型组小鼠进行移植嵌合率检测。2.aGVHD小鼠实验组于移植前1天通过腹腔注射给予不同剂量THL(0.25mg/kg、0.5mg/kg、1mg/kg),隔天给药一次至移植后20天,对照组给予相同体积的药物溶媒DMSO。每天观察实验组和对照组小鼠生存情况和临床表现;每周三次对小鼠进行临床评分并称取体重。于移植后第11天取小鼠肝脏,小肠,结肠组织固定、包埋、切片、H&E染色进行病理学检查;于移植后第6天和第11天分离小鼠脾脏、肝脏和小肠的淋巴细胞,运用流式细胞学技术检测谱系分化、T淋巴细胞亚群及T细胞的增殖活化;酶联免疫吸附剂测定(ELISA)和细胞因子微球检测技术(CBA)检测小鼠血清中细胞因子的水平;qPCR检测靶器官组织中细胞因子mRNA的表达水平。3.在供体和受体中分别特异性敲除THL的靶分子brcc3,以探究brcc3的缺失对aGVHD的作用,通过组织病理学检测靶器官损伤;酶联免疫吸附剂测定(ELISA)和细胞因子微球检测技术(CBA)检测小鼠血清中细胞因子的水平;移植后第9天分离脾脏、肝脏和小肠淋巴细胞,运用流式细胞学技术检测靶器官中T细胞的浸润和活化。实验结果:1.成功建立了稳定可靠的aGVHD小鼠模型。aGVHD模型组小鼠可观察到明显的体重下降、皮损、竖毛、弓背和腹泻等aGVHD表现,于移植后第19天全部死亡。对照组小鼠仅在移植后第10天左右有轻度的体重下降、竖毛及弓背表现,恢复后可获得长期生存;aGVHD模型组小鼠肝脏及小肠病理切片可见明显的aGVHD病理学表现,对照组小鼠未见明显的aGVHD病理特征;移植后第11天,在aGVHD模型组小鼠外周血、脾脏、肝脏和小肠嵌合率都达到95%左右。2.在发生严重的aGVHD时,与对照组小鼠相比,THL实验组小鼠生存期显著延长,体重下降程度较轻,临床评分低于对照组。移植后11天病理检测表明THL处理组靶器官病理损伤较轻,肝脏功能检测表明肝功能好于对照组。血清中细胞因子检测结果显示在移植后的第6天,实验组IL-10、IL-17A、IL-2及TNF细胞因子水平明显降低;而在移植后的第11天,实验组IL-10、IFN-γ、IL-1β和IL-2细胞因子水平明显降低。流式细胞学检测结果显示THL不影响供体细胞在脾脏中的谱系分化和CD4+T细胞及CD8+T细胞比例,但可以降低脾脏及肝脏中T细胞的活化,抑制供体CD4+T细胞和CD8+T细胞在小肠及肝脏中的浸润,并促进脾脏及肝脏中Treg细胞的分化。qPCR结果THL可以降低靶器官中IL-1β、IFN-γ、TNF-α和IL-18等细胞因子mRNA表达。3.在aGVHD小鼠模型中,供体brcc3的缺失对aGVHD无明显影响,但受体中brcc3的缺失明显加重了 aGVHD。brcc3在受体中缺失会加重靶器官肝脏的损伤,促进CD8+T细胞在靶器官中的浸润和增殖活化。研究结论:THL可以显著延长aGVHD小鼠的生存期、减轻aGVHD靶器官的病理损伤、降低血清中aGVHD相关细胞因子的水平及靶器官中aGVHD相关细胞因子mRNA的表达;THL能够减少供体T细胞在靶器官中的浸润并抑制供体T细胞活化、增加靶器官Treg细胞分化从而延缓aGVHD的发生发展。但是,THL的靶分子brcc3在受体中敲除会加重aGVHD,表明THL减轻aGVHD的作用可能不是通过BRISC复合体实现的。

关键词： aGVHD THL NLRP3 brcc3

B7-H3介导的DNA损伤修复与结直肠癌细胞5-Fu耐药关系的研究

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B7-H3介导的DNA损伤修复与结直肠癌细胞5-Fu耐药关系的研究

作者：孙张章江南大学

学位级别：硕士

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是常见的消化道恶性肿瘤,其发病率正逐年升高,每年有超过一百万例CRC患者确诊,60万名患者死于该病,是世界上第三个常见的癌症。5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)作为最常用的治疗CRC的化疗药物,至今尚... 详细信息

结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是常见的消化道恶性肿瘤,其发病率正逐年升高,每年有超过一百万例CRC患者确诊,60万名患者死于该病,是世界上第三个常见的癌症。5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)作为最常用的治疗CRC的化疗药物,至今尚未阐明确切的耐药机制,但是,启动DNA损伤修复机制是CRC细胞产生5-Fu耐药的原因之一;我们前期结果发现共刺激分子B7-H3高表达的CRC细胞能显著降低对5-Fu的敏感性。因此,本课题进一步从B7-H3调控DNA损伤修复的角度,研究B7-H3在CRC细胞5-Fu耐药中发挥的作用。本课题组前期自主构建了两对CRC稳转细胞株,高表达B7-H3的SW480-B7-H3及其对照株SW480-NC和敲减表达B7-H3的HCT-8-shB7-H3及其对照株HCT-8-NC。MTT法结果显示B7-H3高表达CRC细胞的对5-Fu耐药指数明显高于其低表达;克隆形成实验结果显示B7-H3高表达CRC细胞具有更强的细胞增殖能力。由于5-Fu作用机制为损伤细胞DNA,可用彗星实验的方法检测细胞DNA的损伤程度,结果显示B7-H3高表达CRC细胞对于5-Fu造成的DNA损伤明显弱于其低表达。因此,以上这些结果揭示了B7-H3通过增加DNA损伤修复能力从而拮抗5-Fu造成的DNA损伤,是CRC细胞对5-Fu耐药的一个重要的因素。接下来是探索B7-H3如何调控细胞DNA的损伤修复。根据前期CRC细胞株mRNA基因芯片结果发现,上调B7-H3表达后CRC细胞中brcc3也高表达。因此,为了进一步的证实芯片结果,qRT-PCR结果显示B7-H3高表达稳转细胞株中brcc3也高表达;B7-H3敲减的稳转细胞株中的brcc3也低表达;Western blot结果得到了同样的证实;免疫荧光激光共聚焦结果发现B7-H3与brcc3成正相关,并且Western blot结果显示细胞通过5-Fu处理后brcc3发生了核转移。由于brcc3是DNA损伤修复的关键蛋白,5-Fu处理后入核参与DNA修复。所以,B7-H3可能是通过调控brcc3从而促进CRC细胞对5-Fu的耐药。实验结果证明了B7-H3的表达与brcc3表达成正相关性,但brcc3是否是B7-H3拮抗5-Fu的一个关键蛋白,我们通过特异性针对brcc3的siRNA抑制细胞brcc3的表达,Western blot和免疫荧光激光共聚焦结果显示brcc3在B7-H3高表达SW480-B7-H3细胞中表达降低;克隆形成实验结果显示在SW480-B7-H3细胞中敲减brcc3后增殖能力变弱;细胞周期结果发现brcc3敲减后,G2/M期细胞比例明显增加,降低了关卡对DNA损伤的检查;彗星实验结果显示brcc3敲减后SW480-B7-H3细胞的DNA损伤修复能力变弱,对于化疗药物5-Fu敏感性增强。因此,实验结果显示B7-H3上调brcc3的表达,增加对DNA损伤后的修复能力,从而成为CRC细胞对5-Fu耐药的一个重要的原因。我们研究结果首次证明了B7-H3调控brcc3的表达,增加CRC细胞对DNA损伤的修复能力,减弱5-Fu引起的细胞损伤,降低肿瘤细胞对5-Fu的敏感性。这些结果表明通过靶向B7-H3过表达或相关信号通路可以作为逆转5-Fu耐药的一个新的方向。

关键词：结直肠癌 B7-H3 brcc3 5-Fu耐药 DNA损伤修复