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慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术编辑PFF细胞bmpr-ib基因及BMPs信号通路重要基因表达分析

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中国农业科学 2018年第7期51卷 1378-1389页

作者：杨强徐盼蒋凯乔传民任军黄路生幸宇云江西农业大学猪遗传改良与养殖技术省部共建国家重点实验室

【目的】利用慢病毒介导的CRISPR/Cas9基因组编辑技术获得编辑bmpr-ib(bone morphogenetic protein receptor,type ib)基因的猪胎儿成纤维细胞(pig fetal fibroblasts,PFF),并研究该基因被编辑后对骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMPs)信号通路中重要功能基因表达的影响。【方法】针对猪的bmpr-ib基因的外显子8,利用在线软件http://crispr.***.edu获得了21条sg RNAs(single-guide RNAs)序列;得分最高的sg RNA与互补序列(包含接头)退火成双链后连接入线性化的lenti CRISPR v2质粒以获得打靶质粒,打靶质粒与包装质粒ps PAX2和p CMV-VSV-G按5﹕4﹕1质量比混合后通过293T细胞包装慢病毒。慢病毒溶液经0.45μm滤膜回收后与PFF细胞培养液按照1﹕1混合、并加入聚凝胺(polybrene)至终浓度为6μg·m L-1,在1 000 g转速、32℃下离心感染PFF细胞1 h。感染3 d后,细胞在含3.5μg·m L-1嘌呤霉素的培养液中筛选6—7 d,最终获得编辑bmpr-ib基因的PFF细胞克隆群。针对编辑(打靶)细胞,首先通过T7E1酶切检测突变体,初步判断打靶效率,再通过PCR、PCR-TA克隆分析细胞的编辑及脱靶情况。利用RT-PCR检测编辑和对照组细胞中与BMPs信号通路相关的重要基因的表达情况;Western blotting检测编辑细胞与对照组细胞中bmpr-ib基因的蛋白表达量。利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)试剂盒检测编辑细胞及对照组细胞的增殖能力。【结果】T7E1酶切及PCR测序均证实PFF细胞成功打靶目标DNA区域;TA克隆测序表明目标区域发生了插入与缺失突变,突变率为70%。针对20个潜在的脱靶位点的TA克隆测序结果表明,仅1个位点出现了10%(2/20)的脱靶情况。RT-PCR结果显示,打靶细胞与对照组细胞相比,bmpr-ib、Cylin D2、Cdk2和Bcl2基因的表达量均极显著下降(Pbmpr-ib基因的表达量较对照组细胞降低62%。CCK-8检测试验表明,同一代细胞中,打靶PFF的增殖能力极显著低于对照组细胞(P0.05);打靶PFF的增殖能力不受嘌呤霉素筛选的影响。【结论】慢病毒介导的CRISPR/Cas9技术可针对PFF细胞快速高效地实现基因编辑;在bmpr-ib基因编辑细胞中,BMPs通路重要功能基因的表达量显著下降,该基因对PFF细胞的增殖有重要的调节作用。

关键词：慢病毒 CRISPR/Cas9 猪胎儿成纤维细胞 bmpr-ib 脱靶细胞增殖

bmpr-ib基因在寒泊羊群体中的增羔效应、遗传规律及育种应用分析

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畜牧兽医学报 2020年第4期51卷 688-700页

作者：马晓菲刘爱菊韩红叶孙欢孙克佳李晓双孙树春田树军河北农业大学动物科技学院保定071000 河北省牛羊胚胎工程技术研究中心保定071000

旨在揭示bmpr-ib基因在寒泊羊种群中的多态性及遗传学规律,探讨将bmpr-ib基因第746位碱基发生的A→G突变(FecB突变)作为分子标记进行绵羊多胎品种选育的科学性。本研究对寒泊羊育种核心群的健康种公羊、繁殖母羊、羔羊共计1267只绵羊个... 详细信息

旨在揭示bmpr-ib基因在寒泊羊种群中的多态性及遗传学规律,探讨将bmpr-ib基因第746位碱基发生的A→G突变(FecB突变)作为分子标记进行绵羊多胎品种选育的科学性。本研究对寒泊羊育种核心群的健康种公羊、繁殖母羊、羔羊共计1267只绵羊个体进行采血,利用PCR-RFLP方法判定个体bmpr-ib基因位点的基因型并进行群体遗传学分析。对繁殖母羊共计980胎次的产羔记录进行统计,分析FecB突变、胎次及产羔季节对胎产羔数性状的影响。统计所设计杂交组合后代共计167只健康羔羊的基因型比例。结果表明,bmpr-ib基因在寒泊羊种群中有BB、B+和++3种基因型,其基因型频率分别为1.97%、73.40%和24.63%,等位基因B和+的频率分别为38.67%、61.33%;BB、B+和++基因型繁殖母羊的平均胎产羔数分别为2.69、1.91、1.57只,目前寒泊羊种群的胎产羔数平均为1.85只;若经过品种选育使寒泊羊个体中增加一个B基因拷贝,胎产羔数预期增加0.44只;父母本杂交组合为B+×++的后代中B+和++基因型的比例为1.11∶1,父母本杂交组合为B+×BB的后代中BB和B+基因型的比例为0.82∶1,均符合孟德尔分离定律;预测经过6个世代的选育,可使寒泊羊种群母羊基本实现胎产羔数2只的育种目标。本研究结果为绵羊育种实践中制定选种和选配方案提供了理论基础。

关键词： bmpr-ib 寒泊羊产羔数遗传规律

四个绵羊品种bmpr-ib基因CDS区864位点多态性及其产羔数相关性分析

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基因组学与应用生物学 2017年第10期36卷 4116-4124页

作者：马晓明张利平朱韶华杜丽张筱燕甘肃农业大学动物科学技术学院兰州730070

为了探索绵羊产羔性状与绵羊bmpr-ib基因多态性位点关系,找寻调控绵羊繁殖力的分子标记,以小尾寒羊(多胎母羊)、湖羊(多胎母羊)、蒙古羊(单,双胎母羊)、和甘肃高山细毛羊(单,双胎母羊)样本为试验材料,运用DNA直接测序及PCR-SSCP技术的方... 详细信息

为了探索绵羊产羔性状与绵羊bmpr-ib基因多态性位点关系,找寻调控绵羊繁殖力的分子标记,以小尾寒羊(多胎母羊)、湖羊(多胎母羊)、蒙古羊(单,双胎母羊)、和甘肃高山细毛羊(单,双胎母羊)样本为试验材料,运用DNA直接测序及PCR-SSCP技术的方法,对bmpr-ib基因CDS区864位点进行分析。试验羊品种出现3种基因型AA、AB、BB,该基因编码区第846位点发生T>C的突变。湖羊母羊以及小尾寒羊母羊的优势基因型均为AA型,而蒙古羊母羊和甘肃高山细毛羊母羊AB型基因频率略高于AA型。4种绵羊的优势等位基因均为A。小尾寒羊、甘肃高山细毛羊、湖羊三种绵羊x2值和G2值均未达到显著水平(p>0.05),而蒙古羊的x2值和G2值达到显著水平(pbmpr-ib基因中均处于95%置信区间内,且接近于上线。根据各品种间的PIC多态信息含量可知,属于低度多态的是小尾寒羊和湖羊(PICbmpr-ib基因编码区第846位点突变在不同繁殖力母羊群体中分布不同,该位点可以作为绵羊潜在分子标记位点。

关键词： bmpr-ib 绵羊产羔性状 PCR-SSCP 多态性

德国肉用美利奴羊bmpr-ib、BMP15和GDF9基因10个突变位点的多态性检测分析

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南京农业大学学报 2012年第3期35卷 114-120页

作者：左北瑶钱宏光刘佳森李蕴华乌云毕力克艾肯江应诗家王子玉努尔尼沙王旭郭志勤王锋南京农业大学动物胚胎工程技术中心江苏南京210095 新疆巴州畜牧工作站新疆库尔勒841000 内蒙古自治区农牧业科学院内蒙古呼和浩特010031 新疆巴州种畜场新疆博湖841400 新疆畜牧科学院农业部家畜繁育生物技术重点开放实验室新疆乌鲁木齐830000

以影响不同绵羊品种产羔数的bmpr-ib、BMP15和GDF9基因作为候选基因,采用连接酶检测反应(LDR)法,检测10个突变位点在德国肉用美利奴羊上的多态性及其对产羔数的影响。结果表明:在德国肉用美利奴羊中未发现bmpr-ib基因的FecB突变和BMP15... 详细信息

以影响不同绵羊品种产羔数的bmpr-ib、BMP15和GDF9基因作为候选基因,采用连接酶检测反应(LDR)法,检测10个突变位点在德国肉用美利奴羊上的多态性及其对产羔数的影响。结果表明:在德国肉用美利奴羊中未发现bmpr-ib基因的FecB突变和BMP15基因的FecXI、FecXB、FecXL、FecXH、FecXG、FecXR突变及GDF9基因的FecGH(G8)、FecTT突变,但在GDF9上检测到G1突变,该突变处于Hardy-Weinberg平衡状态,达到中度多态水平,但其多态性与产羔数无显著性相关。

关键词：德国肉用美利奴羊繁殖力 bmpr-ib GDF9 BMP15

绵羊bmpr-ib基因密码子使用偏好和适应性进化分析

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河北农业大学学报 2016年第5期39卷 92-98,108页

作者：刘爱菊郝永兰李捷鑫田树军河北农业大学动物科技学院河北保定071001 河北省牛羊胚胎工程技术研究中心河北保定071001

探讨bmpr-ib编码特点可为提高外源基因在受体物种中稳定、高效表达提供重要依据。本研究运用CHIPS、CUPS和CodonW分析绵羊bmpr-ib基因序列,与不同物种bmpr-ib、模式生物基因组及其他多胎主效基因比较,构建进化树后,利用PAML分析bmpr-ib... 详细信息

探讨bmpr-ib编码特点可为提高外源基因在受体物种中稳定、高效表达提供重要依据。本研究运用CHIPS、CUPS和CodonW分析绵羊bmpr-ib基因序列,与不同物种bmpr-ib、模式生物基因组及其他多胎主效基因比较,构建进化树后,利用PAML分析bmpr-ib对环境的适应性。结果表明:绵羊bmpr-ib基因与多胎性状相关的主效基因及除人类、倭黑猩猩和家犬外的不同物种CDS序列中大部分偏好使用G/C结尾密码子,对17种密码子具有偏好性,偏好性较强的密码子为GTG(2.02);绵羊多胎性状相关的BMP-15、GDF-9主效基因,对27种密码子具有偏好性,使用频率最高的为TGT(2.79)。密码子偏好性的聚类结果类似于进化结果,且不同物种的bmpr-ib基因中性选择的作用比例较高;绵羊与3种模式生物基因组密码子使用频率比较发现,小鼠基因组优于酵母和大肠杆菌。本研究结果为今后进一步开展绵羊新基因的发现、功能基因表达调控研究等提供了理论基础。

关键词：绵羊 bmpr-ib 密码子偏好适应性

策勒黑羊bmpr-ib、MTNR1A和PTGS2基因的RFLP分析

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新疆农业科学 2013年第7期50卷 1330-1339页

作者：王琼邵勇钢刘玲玲田佳古丽尼沙.吐拉甫努孜古丽.图尔荪耿明莫合塔尔.夏甫开提刘武军新疆农业大学动物科学学院乌鲁木齐830052

【目的】寻找与绵羊多胎性状相关的DNA标记,为提高绵羊繁殖力的标记辅助选择提供科学依据。【方法】试验以策勒黑羊为主要研究对象,利用PCR-RFLP、DNA测序等技术,对bmpr-ib、MTNR1A和PTGS2基因的遗传多态性进行研究。【结果】策勒黑羊BM... 详细信息

【目的】寻找与绵羊多胎性状相关的DNA标记,为提高绵羊繁殖力的标记辅助选择提供科学依据。【方法】试验以策勒黑羊为主要研究对象,利用PCR-RFLP、DNA测序等技术,对bmpr-ib、MTNR1A和PTGS2基因的遗传多态性进行研究。【结果】策勒黑羊bmpr-ib基因具有多态性,存在三种基因型:++、B+和BB;MTNR1A和PTGS2基因不存在多态。【结论】验证了bmpr-ib基因的A746G突变位点是策勒黑羊多胎性的主效基因,而MTNR1A和PTGS2基因与策勒黑羊繁殖性能关系不大。

关键词：策勒黑羊多胎性状 bmpr-ib MTNR1A PTGS2

bmpr-ib基因对绵羊产羔数影响的回顾和Meta分析

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基因组学与应用生物学 2019年第12期38卷 5393-5402页

作者：梅步俊王志华梁永厚河套学院农学系巴彦淖尔015000 华中农业大学动物科学技术学院武汉430070 河套学院土木工程系巴彦淖尔015000

为了验证澳大利亚美利奴绵羊的候选基因研究中骨形态发生蛋白受体ib型(bmpr-ib)基因与产羔数增加是否有关,及随后在不同的绵羊品种中进行的研究显示了不同的结果,特别是在亚洲地区的绵羊品种中更是如此的现象。因此,有必要对不同绵羊品... 详细信息

为了验证澳大利亚美利奴绵羊的候选基因研究中骨形态发生蛋白受体ib型(bmpr-ib)基因与产羔数增加是否有关,及随后在不同的绵羊品种中进行的研究显示了不同的结果,特别是在亚洲地区的绵羊品种中更是如此的现象。因此,有必要对不同绵羊品种的各种研究进行Meta分析,合并加权均数差(WMD)和置信区间(CI)以评估这些关联的强度。试验共包括18项研究,其中10895个样本用于bmpr-ib基因多态性。结果表明,观察到bmpr-ib基因与绵羊胎产羔数之间存在显著的相关性(BB vs.++:WMD=0.88,95%CI=0.73~1.04,pbmpr-ib基因的作用对于绵羊的产羔量是加性的(每个等位基因的一个拷贝增加约0.5个羔羊)。说明这种涉及非常大样本量的Meta分析意味着bmpr-ib基因与绵羊胎产仔数之间的显著关联,应进一步研究以确定这些不一致结果中常见因果变体的潜在机制。

关键词：骨形态发生受体ib基因 bmpr-ib 产羔数绵羊 Meta分析繁殖性状

黄牛bmpr-ib基因外显子8的多态性及其与体尺性状的关系

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西北农业学报 2010年第7期19卷 12-16页

作者：钟昕昝林森王洪宝林清胡怡菲李常青黄磊辛亚平西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌712100 国家肉牛改良中心陕西杨凌712100

采用PCR-SSCP技术,对秦川牛(QC)、鲁西牛(LX)、南阳牛(NY)、郏县红牛(JXR)4个品种共计459个个体bmpr-ib基因第8外显子进行SNPs多态性检测,并分析基因型与部分体尺性状的相关性。在QC、LX和NY中分别检测到AA、AB和BB 3种SSCP多态型,且QC... 详细信息

采用PCR-SSCP技术,对秦川牛(QC)、鲁西牛(LX)、南阳牛(NY)、郏县红牛(JXR)4个品种共计459个个体bmpr-ib基因第8外显子进行SNPs多态性检测,并分析基因型与部分体尺性状的相关性。在QC、LX和NY中分别检测到AA、AB和BB 3种SSCP多态型,且QC、LX和NY 3个品种中A和B等位基因的频率分别为0.4949/0.5051、0.4663/0.5337和0.4118/0.5882。测序结果显示,A等位基因与GenBank公布的序列(NC_007304.3)相比在43 933位发生T→C突变。最小二乘法分析表明,3个品种中BB基因型个体的体高显著高于AA和AB基因型个体(P0.05);3种基因型对黄牛其他体尺性状没有显著影响(P>0.05)。结果表明,bmpr-ib基因对黄牛体尺性状有一定影响,可以作为黄牛标记辅助选择的候选基因。

关键词：黄牛 bmpr-ib 体尺性状 SNP

山羊bmpr-ib基因密码子偏好性及聚类分析

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生物技术 2017年第2期27卷 148-153页

作者：杨佳栋刘月琴张英杰河北农业大学动物科技学院河北保定071000

[目的]利用生物信息学分析山羊bmpr-ib基因密码子使用特征,对不同物种bmpr-ib基因通过不同的聚类方法进行分析。[方法]利用Usage Codon在线程序和Codon W软件分析山羊和其他物种bmpr-ib基因对密码子偏好性的使用情况,通过欧式平方距离... 详细信息

[目的]利用生物信息学分析山羊bmpr-ib基因密码子使用特征,对不同物种bmpr-ib基因通过不同的聚类方法进行分析。[方法]利用Usage Codon在线程序和Codon W软件分析山羊和其他物种bmpr-ib基因对密码子偏好性的使用情况,通过欧式平方距离和最小进化法分别进行聚类分析。[结果]山羊bmpr-ib基因无G/C碱基的使用倾向,GCC、CTG、CAG、CCC、AGA、AGT、GTG和TGA为山羊bmpr-ib基因的偏好密码子,其余53种密码子的使用较为均衡。通过最小进化法建立起来的不同物种间的系统发育分析结果与动物学分类一致,且不同物种bmpr-ib基因编码蛋白表达水平存在种属差异。[结论]bmpr-ib基因偏爱使用以A或T结尾的密码子,基于欧式距离系数建立起来的聚类和最大似然法构建的聚类不一致,造成这种差异的原因可能是在进化过程中单基因突变所引起的。

关键词： bmpr-ib 山羊密码子偏好性系统发育分析